Projeto TCC 1 5 HIV CRISPR

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ANÁLISE DA TÉCNICA DE EDIÇÃO GÊNICA CRISPR/CAS9 PARA ALTERAÇÃO DO CORECEPTOR CCR5 DOS LINFÓCITOS NAS INFECÇÕES POR HIV COM BASE NA MULTAÇÃO CCR5 DELTA/32 
 
 CENTRO UNIVERSITÁRIO APARÍCIO CARVALHO - FIMCA
COORDENAÇÃO BIOMEDICINA
ARAUJO, Erika Crhistina Santos
AGUIAR, Bárbara Wanessa Lima de1
DOCENTE, Fulano de Tal2
1Graduanda em CURSO DE BIOMEDICINA do Centro Universitário Aparício Carvalho – FIMCA
E-mail: erika-ecss@hotmail.com
2Docente do Centro Universitário Aparício Carvalho – FIMCA. 
E-mail: fulanodetal.@hotmail.com
ANALYSIS OF THE CRISPR/CAS9 GENE EDITING TECHNIQUE FOR ALTERING THE LYMPHOCYTE CCR5 CORRECEPTOR IN HIV INFECTIONS BASED ON CCR5DELTA / 32 MUTATION 
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RESUMO
OBJETIVOS: Analisar as informações relevantes sobre a técnica de edição gênica empregada em estudos realizados com CRISPR/Cas9 que potencialmente possuam a capacidade de inibir a expressão de CCR5 em linfócitos, evitando a infecção pelo vírus HIV.
METODOLOGIA:
RESULTADO: 
CONCLUSÃO: 
Palavras-chave: CRISPR/Cas9. HIV. CCR5.
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ABSTRACT
OBJECTIVES: To analyze relevant information on the gene editing technique used in studies conducted with CRISPR/Cas9 that potentially have the ability to inhibit the expression of CCR5 in lymphocytes, preventing infection by the virus HIV.
METHODS:
RESULT: 
CONCLUSION: 
KEYWORDS: CRISPR/Cas9. HIV. CCR5.
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1. INTRODUÇÃO
Em 1987, ao estudar uma determinada sequência genômica de Escherichia coli, responsável pela produção de aminopeptidases, foi identificado, pela primeira vez, por Ishino et al, repetições peculiares justapostas ao gene. Mais tarde, em 1993, Francisco Mojica reconheceu que as sequências díspares de repetição compartilhavam um conjunto comum de recursos e, em 2005, relatou que estas sequências de fragmentos correspondem a partes dos genomas de bacteriófagos invasores. Esse sistema de repetições foi então denominado de sistema CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas, Interespaçadas e Regularmente Agrupadas - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) (HAN, W.; SHE, Q., 2017; DIAS, C. A. P., DIAS, J. M. R., 2018).
Em 2014, as pesquisadoras Emanuelle Charpentier e Jennifer Doudna publicaram um projeto de pesquisa destinado a desvendar o mecanismo de ataque das bactérias aos vírus. Descobriram, então, que as bactérias possuem um sistema imunológico adaptativo. Além do sistema CRISPR, estes microrganismos possuíam uma proteína capaz de identificar, clivar e degradar DNA viral, denominada Cas (proteína associada a CRISPR - CRISPR associated protein) (PLUVINAGE, J.; FONSECA, O.; VELHO, R., 2018).
Essa nova técnica combinada, CRISPR/Cas9, passou a ser estudada com intuito de solucionar agravos, tais com os causados por o vírus HIV; que em 2019, segundo o Boletim Epidemiológico emitido pelo Departamento de Doenças de Condições Crônicas e Infecções Sexualmente Transmissíveis, da Secretaria de Vigilância em Saúde, do Ministério da Saúde (DCCI/SVS/MS), de 2007 até junho de 2019, foram notificados no Sinan (Sistema de Informação de Agravos de Notificação) 300.496 casos de infecção pelo HIV no Brasil, sendo que destes, houveram 43.941 novos casos diagnosticados de HIV e 37.161 casos de AIDS apenas no ano de 2018 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2019).
Em 2016, os Estados-membros das Nações Unidas se comprometeram a reduzir as novas infecções por HIV para menos de 500.000 ao ano até 2020 – uma redução de 75% em comparação com 2010 - e a eliminar a AIDS como ameaça à saúde pública até 2030. No entanto, a redução do número de novas infecções em adultos tem sido muito lenta e os objetivos globais de prevenção estão longe de serem alcançados. (UNAIDS, 2019b).
Desta forma, pesquisadores estão trabalhando para desenvolver novas técnicas capazes de conter este avanço e regredir com o número de casos. Dentre estas novas ferramentas, a técnica de edição genica está sendo amplamente discutida e desenvolvida para diversos propósitos, incluindo a cura sorológica e esterilizante. Uma das novas abordagens, recentemente testada, é a edição do gene que codifica o(s) correceptor(es) CCR5 e/ou CXCR4.
2. O VÍRUS
A primeira descrição do que veio posteriormente ser conhecida por síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), se deu no início da década de 1980 por Gottlieb e colaboradores. A caracterização antigênica do novo agente, que se seguiu logo após seu isolamento, permitiu que já em 1985 estivesse disponível um teste para o diagnóstico da doença baseado na detecção de anticorpos específicos, o que conduziu à tomada de medidas de prevenção. Apenas em 1986 o agente etiológico da AIDS foi denominado vírus da imunodeficiência humana (HIV) e associado ao estabelecimento de quadros clínicos de imunocomprometimento grave (ABBAS, 2015).
Estruturalmente, o HIV-1 possui nove genes, sendo três estruturais (gag, env e pol), três regulatórios (tat, rev e nef) e três acessórios (vif, vpr e vpu). A nomenclatura das proteínas virais utiliza a abreviação “gp” para glicoproteína ou “p” para proteína, seguida de um número que indica o peso molecular em kilodaltons (kd). A partícula viral possui um formato esférico de aproximadamente 100nm de diâmetro com um envelope lipoproteico composto por uma bicamada lipídica e pelas glicoproteínas de superfície do envelope gp120 e a glicoproteína transmembranar gp41, responsáveis pela interação com a célula hospedeira (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018)
Figura 1. Estrutura molecular do HIV
(Fonte: adaptado de ViralZone)
O gene env codifica as glicoproteínas gp160, encontradas no envelope viral. A gp160 é uma proteína precursora, clivada para formar a gp120 e a gp41. A gp120 se projeta na superfície viral na forma trimérica, enquanto a gp41 é uma glicoproteína transmembranar e se associa à gp120. Tanto a gp120 como a gp41 estão envolvidas na ligação aos receptores de HIV nas células do hospedeiro e na fusão do envelope viral com a membrana celular (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018).
A infecção pelo HIV inicia-se a partir da adsorção do vírus à superfície da célula alvo, a qual é mediada por uma interação de alta afinidade entre o domínio extracelular da glicoproteína viral gp160 e receptores celulares específicos, sendo o CD4+ o principal receptor para HIV-1. Em primeiro caso, a gp 120 se liga ao receptor celular CD4+ promovendo uma mudança conformacional nessa glicoproteína possibilitando a exposição da gp 41 que interage com o correceptor (CCR5 ou CXCR4). Ambas as interações desencadeiam uma mudança conformacional na membrana plasmática semelhante a um grampo, que aproxima o envelope viral da membrana celular possibilitando a fusão de ambas as membranas permitindo a entrada do conteúdo viral na célula (TEMEROZO, J. R. 2018). 
Após essa etapa ocorre o desnudamento viral e liberação do genoma no citoplasma, sendo este seguido pela transcrição reversa do RNA viral, pela ação da enzima transcriptase reversa (RT), dando origem a uma fita complementar de DNA (cDNA). Além disso, a RT possui também atividade de ribonuclease, degradando o RNA original durante a síntese do cDNA, e atividade DNA polimerase dependente de DNA, que promove a criação da fita senso a partir do cDNA antisenso. Ambas as fitas se ligam formando um cDNA dupla fita viral que é transportado até o núcleo da célula onde será incorporado ao genoma celular por meio da atividade da enzima viral integrase, passando a denominar-se provírus (RODRIGUES, 2017; TEMEROZO, J. R. 2018).
Figura 2. Representação esquemática do ciclo replicativo do vírus HIV.
(Fonte: Ministério da Saúde, 2018)
Durante a replicação celular, inicia-se o processo de transcrição do provírus em RNA mensageiro (mRNA), que passa por um “splicing” onde fragmentos menores serão editados. A síntese de partículas virais infecciosas maduras começa após os transcritos totalmente completos de gRNA viral serem sintetizados e os genes virais expressos como proteínas. A montagem das partículas virais infecciosas inicia-se pelo acondicionamentodos transcritos completos de RNA do genoma proviral dentro de um complexo de nucleoproteína que inclui as proteínas do núcleo codificadas por gag e enzimas codificadas por pol necessárias para o próximo ciclo de integração. Este complexo de nucleoproteína então brota através da membrana plasmática, capturando env e glicoproteínas do hospedeiro como parte de seu envelope (ABBAS, 2015; TEMEROZO, J. R. 2018).
Durante o brotamento ou imediatamente após, esse vírus imaturo sofre um rearranjo estrutural que resulta na partícula viral infecciosa. Essa transição ocorre pela clivagem das poliproteínas precursoras Gag (pr55) e Gag-Pol (pr160). Concomitantemente com a clivagem das poliproteínas precursoras ocorre um rearranjo no RNA empacotado na partícula viral, que passa de um dímero fracamente associado a uma forma termodinamicamente mais estável. Esse evento ocorre após o processamento do sítio que possui maior taxa de clivagem e maior afinidade pela protease (ABBAS, 2015; SANTOS, 2015).
2.3 RECEPTORES
Como mencionado anteriormente, para que ocorra a entrada do vírus na célula o mesmo necessita interagir com receptores e correceptores de quimiocinas presentes na membrana plasmática da célula hospedeira. Os principais correceptor envolvidos na adsorção viral são CXCR4 e CCR5 (NI, J., WANG, D., WANG, S., 2018).
Os receptores CCR5 são codificados pelo gene CKR5 no éxon 4 que está localizado no braço curto do cromossomo 3 na região do p21.3 (LOC102724297), onde há a formação de um grupo de alelos que codificam outros receptores. Estes correceptores são expressos em macrófagos, linfócitos, nos tecidos não linfoides e linfoides, e em células dendríticas (SILVA, D. F., et al., 2020).
Figura 3. Localização do gene CCR5
(Fonte: SILVA, D. F., et al., 2020, adaptado)
Em alguns casos, ocorrem uma mutação nesta região do gene. Esta variante, denominada CCR5Δ32, é caracterizada por uma deleção de 32 pares de bases (pb) da região de codificação do gene CCR5. Esta mutação causa uma mudança de quadro com um códon de parada prematuro e gera uma forma truncada de CCR5 (com 215 aminoácidos em vez de 352). A proteína truncada não é expressa na superfície da célula e, portanto, a ligação viral ao receptor é impedida (NI, J., WANG, D., WANG, S., 2018; RONSARD, L., et al., 2019).
Estudos demonstram que indivíduos homozigotos para CCR5Δ32 possuem uma resistência contra a infecção por HIV R5 dependente, enquanto que indivíduos heterozigotos para esse gene expressam um atraso na progressão da AIDS (NI, J., WANG, D., WANG, S., 2018).
	A frequência da mutação CCR5∆32 varia de acordo com a região. Aproximadamente 19% da população afro-americana, 15% da população norte-europeia e 10% da população caucasiana apresentam esta característica. Entre os asiáticos, a frequência varia de 1 a 12%. Na Índia, o primeiro relato sobre heterozigosidade de CCR5∆32 foi documentado com prevalência de 1% em 1998 (RONSARD, L., et al., 2019).
	Devido à baixa disponibilidade de doadores e rara frequência com que essa mutação ocorre naturalmente na população, estudos de edição genica estão sendo desenvolvidos com objetivo de induzir está alteração em células de tropismo, concedendo resistência viral a indivíduos já portadores da doença.
	2.4 CRISPR 
Atualmente, três tipos de mecanismos CRISPR foram identificados e, apesar de apresentarem semelhanças mecanísticas, o sistema mais estudado é o CRISPR/Cas tipo II, na qual a enzima Cas9 (também conhecida como Csn1), proveniente da bactéria Streptococcus pyogenes, participa do processamento de crRNAs (RNA CRISPR) e é responsável pela destruição do DNA alvo (CRISPR/CAS9, 2015; RUFINO RAMOS, A. D., 2016).
Após infectada, o bacteriófago insere fragmentos de seu genoma ao genoma da bactéria. Ao ser identificado, a bactéria ativa seu sistema CRISPR/Cas, onde este atuará no processo de inserção de partes do genoma invasor ao genoma hospedeiro. Esse DNA incorporado ao locus CRISPR passa a designar-se por protoespaçador (RUFINO RAMOS, A. D., 2016; CAETANO, G. C. G. et al., 2019).
Esse locus é então transcrito, originando um RNA mensageiro não codificante (pré-crRNA). Concomitantemente, um segundo fragmento de RNA não codificante é transcrito, o trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA), o qual sofrerá hibridação com o pré-crRNA formando uma cadeia parcialmente dupla de RNA que será clivada e processada pela host factor ribonuclease (RNase) III dando origem ao complexo tracrRNA-crRNA maduro (RUFINO RAMOS, A. D., 2016).
Figura 4. Representação esquemática do mecanismo de ação da CRISPR/Cas9.Bacteriófago
Maturação do crRNA
(Processamento da RNase III
Transcrição
Protoespaçador
Matriz CRISPR
Integração
DNA estrangeiro complementar
Espaçador
Aquisição do espaçador
Injeção do DNA
DNA viral ou plasmidial invasor
Corte de crRNA 5’)
Sítio específico de clivagem Cas9
Biossíntese do crRNA
Interferência do DNA
Fago
(Legenda: Um locus CRISPR típico em um sistema CRISPR-Cas tipo II compreende uma série de sequências repetitivas (losangos marrons) intercaladas por curtos trechos de sequências não repetitivas (espaçadores, caixas coloridas), bem como um conjunto de genes associados a CRISPR (cas) (operon, setas coloridas). Precedendo o operon cas está a transativação gene CRISPR RNA (tracrRNA), que codifica um RNA não codificador único com homologia com as sequências de repetição. Após a infecção por fagos, um novo espaçador (verde escuro) derivado dos elementos genéticos invasivos é incorporado ao arranjo CRISPR pela aquisição máquinas (Cas1, Cas2 e Csn2). Uma vez integrado, o novo espaçador é co-transcrito com todos os outros espaçadores em um longo precursor RNA CRISPR (pré-crRNA) contendo repetições (linhas marrons) e espaçadores (linhas verdes escuras, azuis, verdes claras e amarelas). O tracrRNA é transcrito separadamente e, em seguida, emparelha-se às repetições de pré-crRNA para maturação de crRNA por clivagem de RNase III. Corte adicional de a extremidade 5 do crRNA (pontas de seta cinza) por nucleases desconhecidas reduz o comprimento da sequência guia para 20 nt. Durante interferência, a estrutura crRNA-tracrRNA madura envolve a endonuclease Cas9 e a direciona para clivar o DNA estranho contendo uma sequência complementar de crRNA de 20 nt precedendo a sequência PAM.
Fonte: JIANG, F., DOUDNA, J. A., 2017, adaptado)
Esta estrutura formada, que possui o crRNA com o espaçador, tem especificidade para uma sequência alvo, ligando-se por complementaridade e arrastando consigo a nuclease Cas9. O seu domínio HNH cliva a cadeia complementar e o domínio RuvC a cadeia não complementar, provocando um duplo corte na dupla cadeia de DNA. Tal só acontece caso a sequência alvo se encontre na região adjacente a uma pequena sequência conhecida como protospacer adjacent motif (PAM) (RUFINO RAMOS, A. D., 2016).
Figura 5. Representação esquemática do mecanismo de clivagem das sequencias alvo.
Quebra da dupla fita
Sequência guia
DNA genômico
(Fonte: JIANG, F., DOUDNA, J. A., 2017, adaptado)
Após a edição do material genético do hospedeiro começa a etapa de reparação destas fitas. Nas células de mamíferos, essas quebras são geralmente reparadas por uma das duas vias: reparo dirigido por homologia (HDR) ou união de extremidade não homóloga (NHEJ). As células usam NHEJ com mais frequência que o HDR, porque o último requer um modelo homólogo das regiões que flanqueiam o intervalo. Em todas as fases do ciclo celular que não a fase S, uma região homóloga do cromossomo raramente está próxima o suficiente para atuar como esse modelo e, portanto, o NHEJ atua como um espaço de parada para reparar rapidamente a ruptura e manter a integridade cromossômica (HARTENIAN, E., DOENCH, J. G. 2015).
Figura 6. Representação esquemática do mecanismo de reparo pós edição.
Quebra da dupla fita
DNA genômico
Sequência guia
DNA doador 
(ssODN ou plasmídeo)
Reparo endógeno de DNA no local quebrado
Reparo dirigido por homologia (HDR)
União de extremidades não homólogas (NHEJ)
Pequena inserção
Sequência de DNA de interesse inserido
Pequena deleção
SubstituiçãoModificação genética específica
(ativo nas células em divisão: fase G2/S)
Mutação aleatória
(ativo em células em divisão e não divisão)
(Fonte: JIANG, F., DOUDNA, J. A., 2017, adaptado)
	O NHEJ é um processo propenso a erros que usa ligases, nucleases e polimerases para selar uma quebra e geralmente resulta na inserção ou exclusão de nucleotídeos (indels) em um processo imprevisível. Se a interrupção ocorrer em uma região de codificação de proteínas, esses indels geralmente resultarão em uma mutação no desvio de quadro e no subsequente códon de parada prematuro, revogando a função da proteína (HARTENIAN, E., DOENCH, J. G. 2015).
	Apesar de se tratar de um mecanismo relativamente simples, a etapas à serem cumpridas. Estudos clínicos como células tronco hematopoiéticas mutadas para conceder uma resistência ao vírus estão sendo realizados e pacientes monitorados. Tendo em vista os padrões supracitados, o presente trabalho tem por objetivo principal reunir informações essenciais sobre o tema abordado a fim de facilitar o entendimento sobre a evolução dos mecanismos de tratamento contra o HIV a partir da utilização de engenharia genética, abordando a evolução clínica dos pacientes relatados e atualizações sobre a tecnologia utilizada.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
	Trata-se de uma revisão da literatura desenvolvida com artigos originais com objetivo de relacionar o método de engenharia genética utilizando a técnica de CRISPR/Cas9 para o desenvolvimento e acompanhamento de cura sorológica de pacientes infectados com HIV, tendo por base uma mutação no correceptor CCR5. O levantamento bibliográfico foi realizado entre Setembro e Outubro de 2020, nas bases de dado NCBI - National Center for Biotechnology Information e MEDLINE - Medical LiteratureAnalysis and RetrievalSistem online. 
Para a realização das buscas online utilizou-se como descritores: CRISPR/ cas9, HIV e CCR5. Incluíram-se estudos de casos completos publicados entre 2015 e 2020, de acesso livre, em periódicos nacionais e internacionais e que apresentaram informações sobre utilização do sistema CRISPR/Cas9 na edição genética de CCR5 Delta/32 contra o HIV.
O resultado da pesquisa mostrou 508 artigos disponíveis no NCBI/PMC e 13 artigos no MEDLINE. Iniciou-se a leitura criteriosa dos resumos disponíveis de cada artigo, observando pontos pertinentes ao trabalho. Os principais critérios de inclusão adotado para delimitação dos artigos foram: abordagem da técnica CRISPR/Cas9 para edição do gene CCR5 resultando na mutação CCR5/Delta 32, utilização da técnica em ensaios práticos com linhagens celulares germinativas ou células as quais o vírus possui tropismo, descrição da metodologia utilizada, acompanhamento clínico e laboratorial do desenvolvimento celular e/ou viral, abordagem ética sobre o assunto a ser discutido e relatos de casos de tratamentos bem sucedidos que fizeram uso de células tronco homozigotas para a mutação CCR5/Delta32.
Foram selecionados, a partir de seus resumos, um total de 14 artigos do NCBI/PMC e 5 artigos do MEDLINE, os quais, posteriormente, passaram por uma leitura criteriosa de seus textos completos. A partir destas análises, foram inclusos no presente trabalho um total de 13 artigos, dos quais apenas 7 abordaram de forma prática o desenvolvimento da técnica in vivo.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4. CONCLUSÃO
REFERENCIA
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CAETANO, G. C. G. et al. Técnica crispr-cas9 e sua utilização na área laboratorial. Brazilian Journal of Surgery and Clinical Research – BJSCR, vol.25, n º. 2, pag. 96-99, Fev. 2019.
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NI, J., WANG, D., WANG, S. The CCR5-Delta32 Genetic Polymorphism and HIV-1 Infection Susceptibility: a Meta-analysis, Open Med, nº 13, pag. 467–474, 2018.
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RONSARD, L., et al. Genetic Polymorphisms in the Open Reading Frame of the CCR5 gene From HIV-1 Seronegative and Seropositive Individuals From National Capital Regions of India, Scientific Reports, v. 9, 2019.
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