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UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP RELATÓROS DE AULAS PRÁTICAS CURSO: FARMÁCIA DISCIPLINA: IMUNOLOGIA CLÍNICA. NOME DO ALUNO: ALEXANDRE DA ASCENÇÃO MACHADO DE PAULA. R.A: 1980755 POLO: CACHOEIRO ITAPEMIRIM - ES DATA: 01/09/2021. INTRODUÇÃO Inserida no escopo das Ciências Biomédicas, a imunologia faz-se presente como disciplina de graduação de diversos cursos, dentre os principais: Ciências Biológicas, Nutrição, Enfermagem, Fisioterapia, Odontologia, Medicina, Bioquímica e Farmácia. A imunologia pode ser definida como uma ferramenta científica de investigação dos mecanismos de defesa orgânica contra agentes estranhos – moléculas, células, patógenos, de origens endógenas ou exógenas. Através da realização dos mais diversos exames, testes, protocolos e outros, a imunologia procura não somente prevenir, tratar ou diagnosticar doenças, mas também, aprofundar-se no entendimento fisiopatológico das inúmeras afecções e, com isso obter subsídios fundamentais para o desenvolvimento de novos métodos, insumos laboratoriais, vacinas e, tudo que seja pertinente a melhoria da saúde humana ou animal. No ambiente acadêmico, o estudo da imunologia clínica é direcionado para a organização do sistema imunológico e como age os seus aparatos de defesa. Logo, é esperado que esses conhecimentos aprimorem os meios de diagnósticos. Nesse contexto, tornar-se relevante para o acadêmico o entrelaçamento dos seguintes conhecimentos práticos: a) Visualização de Células Sanguíneas. O sangue, devido a sua função de: transportar oxigênio, nutrientes, carreamento do dióxido de carbono e remoção dos produtos de excreção dos tecidos e, intermediar o mecanismo de defesa imunológica, podemos considera-lo um tipo de tecido especial. Este tecido é constituído basicamente de glóbulos sanguíneos – hemácias (com denominação de - eritrócitos ou glóbulos vermelhos); glóbulos brancos ou leucócitos e plasma que representa apenas 10% do volume sanguíneos. Na classe dos leucócitos temos: granulócitos (neutrófilo, eosinófilo, basófilo) e, agranulócitos (linfócito e monócito), conforme figura 01. Figura 01 – Células Sanguíneas. Disponível em: https://www.infoescola.com/wp-content/uploads/2008/06/leucocitos-1226857036.jpg . Acesso em: 29/08/2021. https://www.infoescola.com/wp-content/uploads/2008/06/leucocitos-1226857036.jpg b) Técnicas de Diluição. Quando uma certa quantidade de substância é adicionada a outra com o objetivo de reduzir a sua concentração – essa técnica é chamada de diluição e divide-se em: diluição simples e seriada. Lembrando que diluição expressa concentração e não volume, assim diluir é acrescentar solvente a uma solução sem alterar a quantidade de soluto existente. Com isso, podemos representar a diluição através da seguinte expressão, conforme figura 2 Figura 02 – Fórmula diluição Disponível em: https://pt.slideshare.net/JosVitorAlves/diluio-simples-e-seriada Acesso em: 29/08/2021. Da expressão, figura 02, entende-se por exemplo na prática o seguinte: a diluição 1/10 ou 1:10 (leia-se: 1 para 10), isto é, combinando um (1 ml) da parte de volume do soluto ou amostra, mais nove (9ml) da parte do solvente. Nesse caso, teremos uma diluição simples e o fator da diluição será 10, esse valor é obtido dividindo-se o volume final pelo volume da alíquota. Caso semelhante irá acontecer na diluição seriada, conforme pode ser visto na figura 03, a ocorrência de uma série de diluições simples, onde cada diluição é multiplicada por 2, que neste caso será o fator de diluição. IMPORTANTE: desprezar parte do volume na última diluição. Figura 03 – Diluição Seriada Acesso em: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2016/04/como-fazer-diluicoes-seriadas.html Disponível em: 29/08/2021. https://pt.slideshare.net/JosVitorAlves/diluio-simples-e-seriada https://www.biomedicinapadrao.com.br/2016/04/como-fazer-diluicoes-seriadas.html c) Aglutinação No alcance da imunologia clínica em ambiente de laboratório são realizados inúmeros testes para diagnóstico de vírus, bactérias, fungos, hormônios, tipagem sanguínea, doenças autoimunes e outros. Dentre os testes existentes temos o de aglutinação – direto ou indireto (quantitativa ou qualitativa) e, de forma geral a reação de aglutinação é caracterizada pela formação de agregados visíveis que resultam da interação de anticorpos e partículas que contenham alguns antigenos em sua superfície. Será quantitativo: para medir o nível de anticorpos para antígenos particulados (diluição seriada até a máxima - título), figura 04. Figura 04 – Teste Aglutinação quantitativo Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=rDTQuKunUj4 Acesso em: 29/08/2021. Será qualitativo: para investigar a presença de um antígeno ou um anticorpo (positivou ou negativo), figura 05. Figura 05 – Teste Aglutinação qualitativo Disponível em: https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-8-- interacoes-antigeno-anticorpo.pdf Acesso em: 29/08/2021. https://www.youtube.com/watch?v=rDTQuKunUj4 https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-8--interacoes-antigeno-anticorpo.pdf https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-8--interacoes-antigeno-anticorpo.pdf d) Aglutinação (Hemaglutinação) O teste de Hemaglutinação ou aglutinação indireta ou passiva, possui a vantagem de: simplicidade na execução, não necessita de equipamentos para execução ou leitura e, pode ser feito em amostras de soro ou plasma, é considerado um teste treponêmico, isto é, detecta anticorpos contra antígenos do Treponema pallidum, de forma qualitativa (presença ou ausência de anticorpos na amostra). Este teste emprega a retenção (adsorção) de anticorpos ou antígenos solúveis na superfície de micropartículas inertes (suportes), tais como: plásticos, gelatina, carvão, dentre outros, contando que não causem interferência na reação de antígeno e anticorpo. Modelo figura 06. Figura 06. Disponível em: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/10/aglutinacao-indireta.html Acesso em: 30/08/2021 e) Teste Enzimático – Elisa para HIV Esta sigla ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay, aqui no Brasil, é conhecida como ensaio imunoenzimático ou ELISA, sendo o tipo sanduiche de terceira geração, considerado o mais usual. No geral, o teste ELISA direto ou indireto necessita de uma fase sólida, podendo ser uma placa de plástico, onde são fixados os antígenos que irão se ligar aos anticorpos presentes na amostra, outras etapas são necessária até a leitura final do ensaio, visto na figura 07. Figura 07 – Teste ELISA Disponível em: https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22167/mod_resource/content/1/HIV%20- %20Manual%20Aula%205.pdf . Acesso em: 30/08/2021. https://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/10/aglutinacao-indireta.html https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22167/mod_resource/content/1/HIV%20-%20Manual%20Aula%205.pdf https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22167/mod_resource/content/1/HIV%20-%20Manual%20Aula%205.pdf f) Discussão de Casos Clínicos. Caso Clínico 1 – Reação Cruzada (Falso positivo): covid-19 O teste rápido para detecção do Covid-19 é realizado após a retirada de uma pequena amostra de sangue que poderá positivar se a pessoa possui anticorpos para o vírus, em média se obtém a resposta entre 10 a 15 minutos. O teste irá avaliar a presença de 02 anticorpos, sendo o IgM para fase aguda – pessoa recém infectada e, IgG indicando que a pessoa já teve contato com o vírus anteriormente. Dito isso, os resultados dos testes para covid-19 podem ser: Verdadeiro-positivo: resultado positivoem uma pessoa que está infectada pelo vírus; Verdadeiro-negativo: resultado negativo em uma pessoa não-infectada pelo vírus; Falso-positivo: resultado positivo em uma pessoa não-infectada pelo vírus; Falso-negativo: resultado negativo em uma pessoa infectada pelo vírus. Com isso, pode-se inquerir que existem vários fatores que podem interferir nos resultados do testes rápidos – o momento da coleta, erros ao coletar a amostra, realização do teste sem um indicação médica e, também uma reação cruzada (Falso positivo). Neste último caso, em função da identidade entre os coronavírus causadores de gripe comum em humanos (HKU1, OC43, NL63, 229E) e o SARS-CoV-2, com isso, a antigenicidade cruzada deve ser considerada, evidenciando que o teste pode positivar para outros vírus com certa semelhança ao covid-19 ou até mesmo casos de vacinação comum para a gripe. Caso Clínico 2 – Soropositivo para Rubéola A rubéola é uma doença infectocontagiosa que ataca principalmente crianças na faixa etária entre 5 a 9 anos, causada por vírus (Rubella vírus – do gênero Rubivirus) semelhante ao sarampo, caracterizada por febre baixa, presença de gânglios linfáticos, erupções papular avermelhada sem descamação, conforme figura 8 e, apesar destes sintomas pode facilmente ser confundida com outras doenças. Figura 08 – Rubéola X Sarampo Disponível em: https://enfermagemilustrada.com/sarampo-e-rubeola-as-diferencas/ Acesso em: 30/08/2021 A transmissão ocorre principalmente de pessoa a pessoa, pela emissão de gotículas de secreções respiratórias ou pelo contato com objetos contaminados por essas secreções e, também por via transplacentária – mãe ao feto (rubéola congênita). Caso Clínico 3 – Sífilis Considerada uma Infecção Sexualmente Transmissível – IST, é causada por uma bactéria denominada Treponema pallidium, que espalha-se no corpo humano por pequenos cortes na pele ou através das mucosas. Sua característica, tipo e sintomas podem variar conforme o estágio da doença, podendo ser: Sífilis primária – Geralmente começa no local de contato (pênis, vulva, vagina, colo uterino, ânus, boca e outros locais da pele), surge uma ferida ou verruga entre 10 a 90 dias após o contágio e, não coça ou dói. Sífilis secundária – Sinais aprecem aproximadamente após seis (06) meses - manchas no corpo e caroços, febre, dor de cabeça, mal-estar e ínguas, tudo num quadro assintomático. Sífilis latente – estágio totalmente assintomático. Sífilis terciária – última fase, afeta os órgãos em geral causando graves lesões. Sífilis congênita – transmitida da mãe para filho, geralmente causa alguma deformação ou aborto. https://enfermagemilustrada.com/sarampo-e-rubeola-as-diferencas/ Aula (01) Roteiro (01) Visualização de Células Sanguíneas Nesta aula, inicialmente os alunos foram divididos em grupos de aproximadamente quatro componentes, o professor reforçou sobre as normas de segurança geral do laboratório e, as medidas de segurança que seriam adotadas em relação ao covid-19. Assim, o uso do microscópio – ferramenta de visualização seria empregado de forma controlada, isto é, a cada visualização o aparelho seria higienizado. Após isso, foi distribuído aos grupos algumas lâminas com esfregaço de sangue humano para a visualização das células, no decorrer dessa tarefa algumas dificuldades, dúvidas e perguntas foram levantadas, anotadas e posteriormente o professor esclareceu para todos. Foram comuns dúvidas sobre o ajuste do microscópio, momento que tornou-se oportuno para aprimorar o manuseio do aparelho. Os alunos em geral também tiveram inúmeras dificuldades para a visualização das células sanguíneas, visto que, segundo o professor algumas lâminas degradaram-se e não eram de boa qualidade. (Figura 09). Figura 09 – Esfregaços. Disponível em: https://www.ufrgs.br/lacvet/esfregaco.htm Acesso em: 30/08/2021 Apesar das dificuldades, estas tornaram-se material didático para discussão e, após superar os entraves foi possível a visualização de algumas células sanguíneas como: hemácias, leucócitos e outros componentes como as plaquetas. Demonstrado na figura 10 (Ilustração). Figura 10 – Células sanguíneas Disponível em: https://conhecimentocientifico.r7.com/hemacias/ Acesso em: 30/08/2021 https://www.ufrgs.br/lacvet/esfregaco.htm https://conhecimentocientifico.r7.com/hemacias/ As lâminas que apresentavam boa visualização foram separadas e compartilhadas entre os grupos, dessa forma, todos os alunos tiveram a oportunidade de visualizar algum tipo de célula. Durante a explicação das dúvidas o professor fez breve explanação sobre os métodos de contagem de células – manual e automática e, a importância deste exame para a investigação de doenças e alterações diversas no sangue. Conclusão Com a leitura do material teórico, as aulas no ambiente virtual e as aulas práticas somadas as orientações do professor, tudo isso, possibilitou o aumento da compreensão sobre o tema – Imunologia Clínica e o Sistema Imunológico. Na aula prática, as técnicas de visualizações das células sanguíneas, suas características, funções, diferenças e as possíveis alterações que podem ocorrer, evidenciaram a importância do conhecimento em Imunologia Clinica e sua relação com a função do farmacêutico. RESULTADOS E DISCUSSÃO Aula (01) Roteiro (02) Técnicas de Diluição Nesta aula, com alunos já ambientados ao laboratório em relação a todos os procedimentos relacionados as normas de segurança individual e coletiva, deu-se início ao tema. O momento foi oportuno para reforçar e relembrar alguns conceitos teóricos como: solução, solvente, soluto, diluição simples, diluição seriada, fator de diluição, concentração, título e, a importância do uso dos POP’s – (Procedimento Operacional Padrão) na rotina do laboratório. Também, foram reforçados conceitos, aspectos jurídicos e condutas relacionadas a qualidade e responsabilidades individuais do profissional farmacêutico na atividade laboratorial. Ficou perceptível, ao realizar as duas diluições – simples e seriada, que apesar do entendimento teórico, ainda permanecia algo vago, ou seja, era necessário colocar em prática a teoria para concatená-la. Por exemplo: Na diluição simples de 1/10 ou 1:10, entende-se; Uma diluição de 1:10 significa que: 10% da sua solução será a amostra e 90% será o diluente. Então, em um tubo de ensaio de 10 ml, você vai adicionar 1 ml da amostra e 9 ml do diluente. Portanto: 10 será o total da solução = amostra + solvente e, ainda será o fator de diluição. Já, na diluição seriada de 1:10 significa que: a primeira diluição será 1:10; a segunda será 1:100; a terceira será 1:1000. Ou seja, multiplica-se o fator de diluição que é 10 pelo fator de diluição anterior. Portanto: 10 será fator de diluição e, a cada diluição a concentração da amostra é diminuída. (Figura 11) Figura 11 – Diluição seriada Disponível em: https://docplayer.com.br/45492652-Tecnico-em-alimentos-ufrpe-microbiologia-basica- irineide-teixeira-de-carvalho-universidade-federal-rural-de-pernambuco.html Acesso em: 30/08/2021 Foi visto, que em muitas práticas de diluição será necessário trabalhar com pequenas quantidades da amostra, geralmente em microlitros. Daí, a necessidade de entender as transformações matemáticas. Por exemplo: Na diluição de 1/30, como representar em microlitros? Aplicando conceitos matemáticos chegaremos no seguinte resultado: 1/30 ml = 25/750 microlitros. Conclusão Durante as práticas de diluições, o manuseio dos diversos materiais e equipamentos, principalmente o uso das micropipetas automáticas possibilitaram um melhor entendimento do processo de transformações dos volumes diluídos, isso em termos de:aumento de precisão, diminuição de esforço e tempo e maior qualidade. Ficou bastante evidente a diferença entre volume e concentração, com isso, ficou entendido que concentrações muito elevadas dificultam a contagem de certos microrganismos, por isso emprega-se o método de diluição seriada, objetivando atingir uma concentração ideal a ser analisada. https://docplayer.com.br/45492652-Tecnico-em-alimentos-ufrpe-microbiologia-basica-irineide-teixeira-de-carvalho-universidade-federal-rural-de-pernambuco.html https://docplayer.com.br/45492652-Tecnico-em-alimentos-ufrpe-microbiologia-basica-irineide-teixeira-de-carvalho-universidade-federal-rural-de-pernambuco.html Aula (02) Roteiro (01) Aglutinação passiva: determinação de proteína C-Reativa Nesta prática, ao realizar o teste de aglutinação passiva por intermédio de proteína C- Reativa de forma simples e rápida, ficou constatado a relevância do teste, visto que, esta proteína atua como importante marcador dos processos infecciosos e inflamatórios que ocorrem na fase aguda de algumas patologias. Assim, havendo aglutinação será positivo, caso contrário negativo, veja figura12 Figura 12 – Aglutinado e não aglutinado. Disponível em: http://www.ebram.com/assets/902.pop.pdf. Acesso em: 30/08/2021 A prática também interlaçou os conhecimento de como o sistema imunológico funciona expondo outras funções da proteína C-Reativa como as de: auxiliar na eliminação dos microrganismos e células mortas resultantes do processo inflamatório e na ativação do sistema, de modo a atrair mais células de defesa para o local da infecção. Conclusão Apesar do teste não especificar diretamente qual o agente causador da infecção/inflamação (bactéria, fungo ou vírus), torna-se pela sua simplicidade e custo uma ferramenta relevante, cabendo ao profissional farmacêutico o conhecimento acerca do teste. Aglutinação passiva: determinação de fator reumatoide OBS. ATIVIDADE NÃO EXECUTADA http://www.ebram.com/assets/902.pop.pdf Aula (02) Roteiro (02) Aglutinação - Hemaglutinação OBS. ATIVIDADE NÃO EXECUTADA Hemaglutinação passiva para toxoplasmose Nesta atividade, a técnica de diluição seriada foi aplicada de forma parcial e controlada principalmente para os reagentes – positivo e negativo. Toda tarefa foi bastante significativa pois proporcionou aos alunos o contato, manuseio e aplicabilidade da amostra e dos reagentes diretamente na placa. Fato que, exigiu dos alunos cuidado e atenção no momento das transferências dos volumes para as cavidades corretas, conforme procedimento do teste descrito no roteiro. O teste demonstrou ser prático, possuir grau de eficiência e, ser de fácil interpretação – positivo ou negativo. Figura 13 Figura 13 – Positivo e negativo Disponível em: http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B77DEC90D-0087-4111-935E- B0E189C1D560%7D_TOXO_HAI.PDF. Acesso em: 01/09/2021 Da reação de aglutinação, que foi realizada seguindo rigorosamente o roteiro da aula prática, obteve-se o seguinte resultado, que pode ser visto na figura 14. Figura 14 – Resultado (Fornecido pelo professor) Com base na figura, teremos a seguinte interpretação: Positivos na primeira linha – cavidades 2 e 3. Positivos na segunda linha – cavidades 1,2,3,4 e 5. Conclusão A toxoplasmose vista como uma zoonose é doença de alcance, que pode trazer sérios problemas e deixar graves sequelas em caso de transmissão congênita – microcefalia, http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B77DEC90D-0087-4111-935E-B0E189C1D560%7D_TOXO_HAI.PDF http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B77DEC90D-0087-4111-935E-B0E189C1D560%7D_TOXO_HAI.PDF calcificações intracranianas, miocardite, convulsões dentre outras. Logo, a prevenção primária da toxoplasmose congênita deve ser difundida por programas educacionais e são imprescindíveis os diversos exames, dentre estes: a ultrassonografia, os testes sorológicos de Imunofluorescência indireta, teste Imunoenzimático – ELISA e Hemaglutinação passiva. Aula (03) Roteiro (01) Aglutinação – Enzimático – ELISA para HIV O teste Enzimático (ELISA) para detecção de HIV, comparado com as prática das aulas anteriores destacou-se por apresentar várias etapas até o momento final, em que será realizada a leitura – Método Indireto. (Detecção de anticorpos). 1. Preparação da solução para a sensibilização da placa + incubação + lavagem; 2. Adição de anti-Ig + enzima + nova encubação + nova lavagem; 3. Adição de revelador + nova incubação; 4. Estabilização da amostra; 5. Leitura visual e em espectrofotômetro. O fato do teste ELISA ser realizado em várias etapas, possibilitou o envolvimento de todos os alunos no processo. Assim, enquanto um grupo realizava uma etapa, outro grupo acompanhava, isso fez os alunos repetirem o mesmo teste várias vezes, melhorando a assimilação. Conclusão Ainda que, o teste (ELISA) foi realizado em várias etapas, este demonstrou ser rápido, ter especificidade, sensibilidade e a placa possibilita a execução em triplicata o que reduz as incertezas. REERÊNCIA JUNQUEIRA. L.C; CARNEIRO. J. HISTOLOGIA BÁSICA. Ed. Guanabara Koogan 11º edição. Rio de Janeiro. 2007. IMUNOENSAIOS ensaios de aglutinação. Portaleducação, 2021. Disponível em: https://siteantigo.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/farmacia/. Acesso em: 28/08/21. O QUE e imunologia e qual a sua importância. Imedilaboratorios, 2021. Disponível em: https://www.imedilaboratorios.com.br/blog/2/. Acesso em: 28/08/21. MONTASSIER, Helio Jose. Interação antígeno anticorpo. Fcavunesp, 2021. Disponível em: https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/. Acesso em: 28/08/2021. HIV. Telelab, 2021. Disponível em: https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22167/mod_resource/content/1/HIV20 %20Manual%20Aula%205.pdf. Acesso em: 29/08/2021. FALSO negativo covid-19. Coronavírus saúde. 2021. Disponível em: https://coronavirus.saude.mg.gov.br/blog/162-falso-negativos-covid19. Acesso em: 29/08/2021. RUBÉOLA Sintomas transmissão e prevenção. Bio Fiocruz. 2021. Disponível em: https://www.bio.fiocruz.br/index.php/br/rubeola-sintomas-transmissao-e-prevencao. Acesso em: 30/08/2021. SIFILIS. Saudees. 2021. Disponível em: https://saude.es.gov.br/sifilis. Acesso em: 30/08/2021. SIFILIS o que é. Saudeabril. 2021. Disponível em: https://saude.abril.com.br/medicina/sifilis-o-que-e/. Acesso em: 01/09/2021. https://siteantigo.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/farmacia/imunoensaios-ensaios-de-aglutinacao/54437 https://www.imedilaboratorios.com.br/blog/2/o-que-e-imunologia-e-qual-a-sua-importancia https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/ed-7-interacoes-antigeno-anticorpo.pdf https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22167/mod_resource/content/1/HIV20%20Manual%20Aula%205.pdf https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22167/mod_resource/content/1/HIV20%20Manual%20Aula%205.pdf https://coronavirus.saude.mg.gov.br/blog/162-falso-negativos-covid19 https://www.bio.fiocruz.br/index.php/br/rubeola-sintomas-transmissao-e-prevencao https://saude.es.gov.br/sifilis https://saude.abril.com.br/medicina/sifilis-o-que-e/
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