Detecção e identificação dos fungos de importância médica

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DESCRIÇÃO
Os conceitos e os protocolos envolvidos no diagnóstico micológico para a detecção e identificação dos
fungos de importância médica.
PROPÓSITO
Apresentar as etapas da rotina laboratorial para o diagnóstico das infecções fúngicas a fim de
compreender o papel do analista na detecção e identificação dos microrganismos causadores das
micoses. Além disso, ser capaz de diferenciar as técnicas laboratoriais da micologia, das demais áreas
da microbiologia.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Definir os conceitos gerais da coleta, transporte e armazenamento das amostras clínicas para o
diagnóstico micológico
MÓDULO 2
Descrever os processamentos e as técnicas da rotina laboratorial na micologia médica
INTRODUÇÃO
As micoses são causadas por fungos filamentosos ou leveduriformes e podem provocar doenças com
manifestações clínicas leves, levando a incômodos estéticos ou ainda a situações mais graves que
levam o paciente ao óbito. Nas últimas décadas, as doenças causadas pelos fungos passaram a
desempenhar um papel importante na saúde pública, principalmente, por causa dos tratamentos com
antibacterianos de forma indiscriminada e o uso de imunossupressores. Por isso, indivíduos com a
microbiota alterada ou com o sistema imunológico comprometido são mais predispostos a
desenvolverem infecções fúngicas oportunistas.
A correta detecção e identificação do real agente etiológico é fundamental para traçar o curso do
tratamento e delimitar as abordagens a serem aplicadas para o paciente. Nesse aspecto, o profissional
da saúde qualificado fará toda diferença no sucesso diagnóstico realizado em um laboratório clínico. Por
isso, neste tema, aprenderemos sobre o diagnóstico micológico e as principais etapas envolvidas para
se conseguir uma correta identificação do agente etiológico das micoses.
 
 
Foto: Shutterstock.com. 
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MÓDULO 1
 Definir os conceitos gerais da coleta, transporte e armazenamento das amostras clínicas para
o diagnóstico micológico
INTRODUÇÃO AO DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO
Na micologia, busca-se utilizar metodologias específicas, sensíveis, simples, rápidas e econômicas, que
sejam capazes de cumprir com os objetivos que são o isolamento e a identificação do agente etiológico.
Como em qualquer rotina laboratorial, o diagnóstico micológico passa por três etapas distintas, desde a
coleta até a liberação do laudo, que compreendem as fases: pré-analítica, analítica e pós-analítica.
FASE PRÉ-ANALÍTICA
A fase pré-analítica é o primeiro contato do paciente com o laboratório. Nessa fase, serão avaliadas a
requisição médica e a suspeita clínica, para então decidir a melhor forma de realizar a coleta, o
armazenamento e o transporte do espécime clínico. Na rotina da micologia clínica, essa etapa é
fundamental para o sucesso do diagnóstico e da identificação do real agente causador da micose, pois
será o norte do analista.
 
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 Fase pré-analítica.
 
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 A localização da lesão deverá ser confirmada de acordo com a requisição médica.
O tipo de coleta realizada vai depender, principalmente, da localização das lesões, da manifestação
clínica e da hipótese diagnóstica. Para a execução adequada dessa fase, é necessário verificação da
suspeita clínica que consta na solicitação do exame, orientação do paciente, coleta precisa do espécime
clínico, identificação das amostras, armazenamento e transporte apropriados até o setor onde os
espécimes clínicos serão processados.
FASE ANALÍTICA
Após todo o procedimento pré-analítico, a amostra clínica chegará ao laboratório para então iniciar a
fase analítica. Nessa etapa, o espécime clínico será processado e analisado para a determinação do
agente causador da micose investigada. As técnicas empregadas dependerão da suspeita clínica e das
solicitações realizadas no requerimento médico. O diagnóstico micológico é, classicamente, realizado
pelo exame direto com observação do espécime clínico em microscópio óptico e a cultura micológica,
que é o padrão-ouro, pois isola o fungo no laboratório. Em alguns casos, é necessária a execução de
testes auxiliares, como investigações bioquímicas ou moleculares, que ajudarão na identificação do
microrganismo.
 
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 Processamento da amostra de acordo com a suspeita clínica.
FASE PÓS-ANALÍTICA
A fase pós-analítica é a última fase do diagnóstico laboratorial. Todos os resultados obtidos nos
diferentes testes precisam ser analisados de forma criteriosa e estar de acordo entre si. Além disso, é
muito importante lembrar-se da suspeita clínica colocada no requerimento do exame que lhe dará um
norte do que pesquisar e se o laudo emitido responde à hipótese diagnóstica. Após a conclusão por
parte do analista, esse resultado pode ser liberado e o médico com posse dessas informações decidirá
qual a melhor conduta para o tratamento daquele paciente.
 
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 Fase pós-analítica.
A coleta, o armazenamento e o processamento das amostras de maneira inadequada podem levar ao
diagnóstico incorreto com consequente atraso ou tratamento errado, que, em alguns casos, podem ser
fatais, além dos prejuízos econômicos associados.
RECOMENDAÇÕES GERAIS DA COLETA DE
ESPÉCIMES CLÍNICOS
O espécime clínico que será coletado dependerá da suspeita clínica e de qual é o tipo da suposta
micose. Veja a seguir:
 
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Para as micoses superficiais e cutâneas, recomenda-se a coleta das escamas de pele, unha, pelos
parasitados e, em caso de lesões, a coleta das bordas externas.
 
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Para as micoses subcutâneas, a amostra coletada pode ser biopsia, secreção e o pus.
 
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Para as micoses sistêmicas e oportunistas, podem ser coletados o escarro, a urina, as fezes, o liquor, o
sangue e até mesmo a biopsia, dependendo da manifestação clínica e localização das lesões.
Os procedimentos que envolvem a coleta da amostra influenciam diretamente na qualidade desse
material e, por consequência, o resultado que será obtido. Por isso, fatores como experiência
profissional, comunicação entre o corpo médico e o laboratório, cuidado com os procedimentos e
materiais utilizados na coleta, correta identificação das amostras são imprescindíveis para o sucesso do
diagnóstico micológico.
Para garantir a qualidade, algumas recomendações são sugeridas, como as da lista abaixo:
Preparação, esterilização ou desinfecção prévia do material a ser utilizado na coleta,
conforme os protocolos de cada teste.
A identificação das amostras deve conter o nome do paciente, tipo e data da amostra
coletada, registro hospitalar ou ambulatorial, além de outras informações que auxiliam a
equipe do laboratório no direcionamento dos exames.
A coleta deve ser realizada após a antissepsia do local, e o espécime clínico deve ser
acondicionado em um recipiente vedado e estéril, de acordo com o agente a ser pesquisado,
também é recomendado realizar em duplicata ou triplicata, dependendo de quanto material
for possível coletar.
Sempre que for possível, coletar as amostras clínicas antes de iniciar o tratamento,
principalmente para as lesões de pele, pelos e unhas. Caso o paciente já tenha iniciado o
tratamento tópico, é importante orientá-lo para que seja suspenso de 4 a 5 dias antes da
coleta.
A amostra clínica deve ser acompanhada da requisição médica do exame, sempre que for
possível com a hipótese diagnóstica. Essas informações auxiliarão o analista na escolha dos
métodos a serem empregados, quais colorações e meios de cultura utilizar para o
isolamento do real agente causador da micose.
Em alguns casos específicos de pacientes com algum imunocomprometimento, é importante
e necessário coleta consecutiva em 2 ou 3 dias para a interpretação correta dos achados
laboratoriais. Já que para esses pacientes fungos que são considerados saprófitas,
contaminantes ambientais ou que são constituintes da microbiota normal do pacientepodem
se comportar como patógenos, causando as micoses oportunistas.
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PROCEDIMENTOS DA COLETA DAS AMOSTRAS
CLÍNICAS
Para a realização da coleta dos espécimes clínicos, a primeira medida a ser tomada é a leitura da
requisição do exame. Nesse documento, é preciso constar a suspeita clínica, qual material deve ser
coletado e a localização da lesão. Por exemplo, se a suspeita clínica for onicomicose, na requisição do
exame, é preciso constar em qual dedo da mão ou dedo do pé está a lesão.
 
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Os dedos das mãos também são conhecidos como quirodáctilos e são contados a partir do polegar (1º
quirodáctilo) até o dedo mínimo (5º quirodáctilo).
 
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Os dedos dos pés também são conhecidos como pododáctilos e são contados a partir do polegar (1º
pododáctilo) até o dedo mínimo (5º pododáctilo).
Alguns espécimes clínicos só poderão ser coletados pela equipe médica em ambiente hospitalar, como
é o caso do liquor, medula óssea, aspirado traqueal e secreção obtida por broncoscopia ou aspirado
gástrico.
 
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 Coleta de liquor.
 
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 A coleta da biopsia realizada no ambulatório, depende do lugar da lesão.
Ou ainda em ambiente ambulatorial, como é o caso de alguns tipos de biopsia. De modo geral, nesses
casos, a responsabilidade do laboratório será de transportar a amostra até o setor técnico, que realizará
o processamento e as análises necessárias para o diagnóstico.
Para evitar contaminações das amostras por bactérias ou outros fungos, recomenda-se que a coleta
seja realizada sob condições de assepsia. Isso porque a maioria das manifestações clínicas causadas
pelos fungos ocorre em sítios anatômicos altamente contaminados com a microbiota normal do indivíduo
ou até com fungos que estão dispersos no ambiente onde será realizada a coleta, como é o caso de
materiais cutâneos.
Abaixo conheça os procedimentos de coletas:
COLETA DO ESCARRO
Para a coleta de escarro, recomenda-se que seja realizado um gargarejo com água limpa ou fervida,
para posterior recolhimento da primeira expectoração da manhã, preferencialmente. O frasco precisa ser
estéril e de boca larga, e não deve conter saliva.
 
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COLETA DE SANGUE PARA A HEMOCULTURA
Com a finalidade de se realizar uma coleta de sangue venoso para exames hematológicos ou
bioquímicos, há o protocolo de antissepsia. Porém, quando essa coleta for para a realização de
hemocultura, esse protocolo precisa ser ainda mais rigorosamente aplicado, de modo que evite
contaminações cruzadas. Após a antissepsia no local da punção, deve-se realizar a coleta de cerca de
5-6 mL do sangue, que será imediatamente transferido para o frasco, contendo meio de cultura
apropriado para hemocultura, seja líquido ou bifásico (líquido sobre sólido). Esse protocolo tem como
objetivo evitar a coagulação que diminui a sensibilidade do teste.
 
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Além disso, uma pequena alíquota, a última gota, deve ser utilizada para a elaboração de um esfregaço
sanguíneo que será enviado ao laboratório juntamente com o frasco da hemocultura.
COLETA DE URINA
A coleta da urina é crítica, pois a região perineal é extremamente contaminada, dificultando o
diagnóstico do real agente causador da micose. Para isso, o recomendado é que a coleta seja feita por
cistoscopia ou sondagem. Entretanto, por serem procedimentos realizados em ambiente hospitalar,
nem sempre será de fácil acesso ao paciente. Desse modo, quando não for possível realizar essas
técnicas mais complexas, é necessário que haja limpeza prévia na região perineal com água e sabão e
que o paciente despreze o primeiro jato da manhã e, em seguida, colete de 3 a 5 mL em um frasco
estéril. Para o diagnóstico micológico, as coletas de urina de 24 horas não têm valor diagnóstico.
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CISTOSCOPIA
A cistoscopia, ou uretrocistoscopia, é um exame de imagem que é feito principalmente para
identificar qualquer alteração no sistema urinário, principalmente na bexiga, e pode ser utilizado
para a coleta de amostras.
COLETA DAS FEZES
As fezes podem ser coletadas após a lavagem com água e sabão da região anal. Pequenas porções de
fezes devem ser transferidas para um frasco estéril com tampa, ou então a coleta poderá ser feita por
um swab anal.
 
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SWAB
Trata-se de um cotonete estéril que serve para coleta de exames microbiológicos com a finalidade
de estudos clínicos ou pesquisa.
COLETA DE SECREÇÃO DO CONDUTO AUDITIVO EXTERNO
O material do conduto auditivo pode ser coletado por curetagem da lesão ou com o auxílio de um swab
estéril.
 
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COLETA DE AMOSTRAS DA MUCOSA ORAL E
OROFARÍNGEA
Essa coleta deverá ser realizada com o auxílio de swab estéril diretamente da lesão presente na mucosa
jugal, região tonsilar ou papilas linguais.
 
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PROCEDIMENTO PARA A COLETA DE SECREÇÃO VAGINAL
A secreção vaginal também será coletada com o auxílio do espéculo e do swab estéril diretamente do
fundo do saco vaginal ou do material da lesão.
 
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COLETA DE PUS E MATERIAL DE ABSCESSO
O ideal para a coleta desse material é que seja realizada ainda nos abscessos fechados por aspiração
com o auxílio de seringa e agulha estéreis. Caso a lesão já esteja aberta, deve-se limpar com gaze e
salina estéreis para remover a crosta e o exsudato superficial, que é excessivamente contaminado com
bactérias. Somente após essa limpeza que a coleta com o swab deve ser realizada.
 
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PROCEDIMENTOS DE TRANSPORTE E
ARMAZENAMENTO
Tão importante quanto a coleta em si, o transporte e o armazenamento do espécime clínico são etapas
críticas que definirão o sucesso ou o fracasso do diagnóstico micológico. Por isso, seguir corretamente
as orientações para cada tipo de material é fundamental para garantir a integridade da amostra durante
todo o tempo no transporte até o setor técnico, bem como seu armazenamento até o processamento
laboratorial.
A rapidez no envio das amostras clínicas tem por objetivo garantir a sobrevivência e o isolamento dos
fungos ou leveduras, já que é necessário que esses microrganismos estejam viáveis para crescer no
laboratório.
Veremos a seguir as orientações para alguns tipos de espécimes clínicos haja vista a melhor forma de
preservar os possíveis fungos presentes.
AMOSTRAS COLETADAS COM SWAB
Os materiais clínicos coletados com o swab devem ser processados imediatamente. Caso isso não seja
possível pela distância do local de coleta e o setor técnico do laboratório, é necessário que esse swab
seja alocado em tubos com solução salina estéril e fechamento hermético, de modo que impeça
vazamentos e evite a dessecação da amostra. Esse swab em tubo com salina deve ser conservado a
4°C por, no máximo, 8 a 10 horas, pois tempos superiores podem comprometer a integridade da
amostra.
 
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MATERIAIS DITOS CONTAMINADOS
Espécimes clínicos provenientes de sítios sabidamente contaminados ou de difícil descontaminação
(exemplos: urina, fezes, escarro, secreções de orofaringe, pus e secreção de feridas) devem ser
transportados com as precauções necessárias para a manutenção da proporção da microbiota original.
Por essa natureza contaminada, é importante que essas amostras permaneçam em frascos estéreis,
vedados e sejam imediatamente transportadas e processadas. Caso esse tempo seja superior a 30
minutos, é necessário manter sob refrigeração (2°C a 8°C), inclusive, durante o transporte em caixas
térmicas. Essa amostra deverá ser enviada para o laboratório até 18 horas após a coleta, desde que
mantida sob refrigeração.
 
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MATERIAIS DE SÍTIOS ESTÉREIS
O liquor e os líquidos cavitários são exemplos de amostras clínicas de sítios estéreis e devem ser
mantidosem tubo estéril hermeticamente fechado e transportado imediatamente para o laboratório em
temperatura ambiente.
 
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O sangue e a amostra de punção de medula, que são coletados e acondicionados diretamente no frasco
com meio de cultura, serão enviados em temperatura ambiente e o processamento deve ocorrer no
máximo em 9 horas após a coleta.
AMOSTRAS DE LESÃO DE PELE, PELOS E UNHAS
O material clínico seco proveniente de raspado de pele, pelos ou unhas pode ser acondicionado entre
lâminas de vidro vedadas com fita adesiva ou parafilme, ou placas de Petri, e permanecem em
temperatura ambiente por até sete dias. No entanto, recomenda-se que seja enviado e processado o
mais breve possível.
As biopsias devem ser acondicionadas em frascos estéreis contendo solução salina estéril protegidas da
luz. Se o tempo entre coleta e processamento for inferior a 2 horas, esse material pode ficar em
temperatura ambiente; caso o tempo seja superior, é recomendado manter sob refrigeração (2°C a 8°C).
 
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No vídeo a seguir, veja a especialista explicando o procedimento de coleta de espécimes clínicos para o
diagnóstico micológico.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. O DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO, ASSIM COMO QUALQUER OUTRO
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL, PODE SER DIVIDIDO EM TRÊS ETAPAS. A
COLETA DO ESPÉCIME CLÍNICO COMPREENDE QUAL FASE DO DIAGNÓSTICO?
A) Analítica
B) Pré-analítica
C) Processamento
D) Pós-analítica
E) Inicial
2. A COLETA DO ESPÉCIME CLÍNICO DEVE SER CRITERIOSA, POIS O SUCESSO
DO DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO TAMBÉM DEPENDE DISSO. PARA QUE A
COLETA SEJA FEITA CORRETAMENTE, QUAL É O PRIMEIRO CRITÉRIO QUE
DEVE SER OBSERVADO?
A) Identificação do frasco de transporte
B) Aspecto da lesão e a localização
C) Separação do material para a coleta
D) Leitura da requisição do exame
E) Antissepsia do local da lesão
GABARITO
1. O diagnóstico micológico, assim como qualquer outro diagnóstico laboratorial, pode ser
dividido em três etapas. A coleta do espécime clínico compreende qual fase do diagnóstico?
A alternativa "B " está correta.
 
A coleta do espécime clínico pertence à fase pré-analítica, pois é a primeira fase antes do
processamento da amostra e desempenha papel importante no sucesso do diagnóstico.
2. A coleta do espécime clínico deve ser criteriosa, pois o sucesso do diagnóstico micológico
também depende disso. Para que a coleta seja feita corretamente, qual é o primeiro critério que
deve ser observado?
A alternativa "D " está correta.
 
A leitura da requisição do exame é importante, pois é onde haverá as informações que direcionarão o
tipo de coleta, material e a forma de ser transportada.
MÓDULO 2
 Descrever os processamentos e as técnicas da rotina laboratorial na micologia médica
INTRODUÇÃO ÀS ROTINAS NO LABORATÓRIO
DE MICOLOGIA
Após todos os processamentos pré-analíticos vistos anteriormente, chegamos à fase analítica do
diagnóstico micológico. Essa etapa corresponde à execução propriamente dita das técnicas
laboratoriais, com o objetivo de evidenciar as estruturas fúngicas ou o isolamento do agente infeccioso.
Essa busca pela definição do diagnóstico pode ocorrer pela pesquisa direta de estruturas fúngicas nas
amostras clínicas, pela semeadura desse material com posterior crescimento do fungo no laboratório, ou
então pelas investigações indiretas que procuram por antígenos ou anticorpos circulantes, os quais
sugerem a presença do fungo ou levedura no organismo do paciente.
RECEBIMENTO E TRIAGEM DAS AMOSTRAS
Antes de processar os espécimes clínicos, o setor técnico necessita realizar uma verificação criteriosa
acerca das amostras estarem ou não adequadas, como, por exemplo, em relação ao seu volume, à
presença de vazamentos ou contaminações, se estavam sob refrigeração, entre outros aspectos, para
então dar prosseguimento à análise laboratorial.
 
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 Recebimento da amostra clínica.
Para garantir o sucesso do diagnóstico e uma correlação clínico laboratorial melhor, alguns critérios são
utilizados para a rejeição das amostras clínicas recebidas pelo laboratório. Veremos a seguir 2 tipos de
problemas:
AMOSTRAS CLÍNICAS
AMOSTRAS INADEQUADAS
PROBLEMAS COM A IDENTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS
CLÍNICAS
Discrepância entre o pedido médico e a identificação da amostra.
Falta de identificação, como nome do paciente, data, hora e local da coleta.
Falta de informações, como tipo ou origem da amostra, teste a ser realizado.
 
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PROBLEMAS COM AMOSTRAS INADEQUADAS
Material com sinais de vazamento e contaminação.
Amostras com horário de coleta superior ao armazenamento recomendado.
Falta de refrigeração em amostras que deveriam ser refrigeradas.
Frascos não estéreis.
Biopsias ou outros materiais clínicos enviados em solução de fixação (formalina).
Swab seco.
Um único swab coletado para requisições que solicitam mais de um tipo de teste.
 
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Caso ocorra algum desses problemas ou outros que inviabilizem o processamento laboratorial da
amostra clínica, é imprescindível que o setor responsável pela coleta e o médico solicitante sejam
comunicados. Em algumas situações, como as descritas acima, será necessário realizar nova coleta;
por isso, é extremamente importante que todo o processo pré-analítico seja realizado com a máxima
cautela para que esses problemas sejam a exceção e não a regra.
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO CLÁSSICO
Classicamente, o diagnóstico micológico é realizado pela verificação do fungo ou levedura no espécime
clínico, seja por técnicas de microscopia chamadas de exame direto seja pelos cultivos em meio de
cultura. Por muitos anos, essas técnicas foram as únicas utilizadas para auxiliar no diagnóstico das
micoses, entretanto, com o avanço tecnológico, outros testes também puderam ser realizados para
complementar as informações obtidas, como a pesquisa de anticorpos e antígenos, ou a investigação
molecular.
Para realizar a análise micológica, alguns espécimes clínicos precisam ser previamente preparados com
a finalidade de aumentar a sensibilidade das técnicas, abaixo veremos as diferentes preparações e suas
especificidades.
PREPARAÇÃO DAS ESCAMAS DE UNHA E PELE, PELOS E
CABELOS
Esses materiais clínicos secos devem ser separados em porções para que sejam realizados o exame
direto e a cultura micológica.
 
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PREPARAÇÃO DE SECREÇÕES, LIQUOR E FLUÍDOS
CORPORAIS (LÍQUIDO ASCÉTICO, PERICÁRDICO,
SINOVIAL, ENTRE OUTROS.)
Esses líquidos deverão ser centrifugados por 10 minutos a 1500-2000 rpm. As amostras coletadas com
auxílio de swab devem transferidas para solução salina por agitação no líquido, de modo que o material
se desprenda e permaneça com posterior centrifugação da solução salina. O material adequado para
realização, tanto do exame direto quanto da cultura, é o sedimento que ficará no fundo do tubo após a
centrifugação.
PREPARAÇÃO DA URINA
A recomendação é que se utilize a alça calibrada para semear uma alíquota por esgotamento no meio
de cultura em placa de Petri, para o teste quantitativo pela verificação das unidades formadoras de
colônias (UFC). Uma outra alíquota deverá ser centrifugada (10 minutos a 1500-2000 rpm) e o
sedimento será utilizado para a verificação microscópica e para a avaliação qualitativa, sendo semeado
em tubo com meio de cultura específico.
 
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PREPARAÇÃO DO ESCARRO
Essa amostra pode ser digerida com a enzima N-acetil-L-cisteína, com a finalidade de fluidificar e
facilitar a manipulação do escarro e a obtenção do sedimento após a centrifugação. Deve-se utilizar as
porções purulentas da amostra, as porções liquefeitas não são apropriadas para o isolamento do fungo.
Também é possível realizar a fluidificação com hidróxido de potássio (KOH 20%), porém essa alíquota
somente será viável para o exame direto, já que essa solução destrói as estruturas fúngicasem algumas
horas, inviabilizando o isolamento do fungo a partir da cultura.
PREPARO DE BIOPSIAS DE TECIDO
As biopsias precisam ser fragmentadas por maceração com pistilo em almofariz (ambos estéreis), ou
então com o auxílio de um bisturi estéril e placa de Petri também estéril. Esse procedimento tem por
objetivo aumentar a sensibilidade do teste, pois aumenta a superfície de contato do tecido, o que expõe
o microrganismo e favorece o contato com o meio de cultura, permitindo, assim, seu isolamento e
posterior identificação.
 
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EXAME MICOLÓGICO DIRETO
O exame micológico direto é amplamente utilizado para auxiliar no diagnóstico das micoses por ser um
teste rápido, de baixo custo, eficaz, reprodutível, sensível e, em algumas situações, por permitir
evidenciar e até identificar o agente etiológico. Entretanto, a sensibilidade e a especificidade dessa
metodologia dependerão, principalmente, do tipo da micose e da experiência do analista. Por essas
limitações, um exame micológico negativo não anula a possibilidade de haver infecção fúngica.
Outro ponto crítico está relacionado à quantidade da amostra enviada para o laboratório. Alguns
espécimes clínicos são de difícil coleta ou então não apresentam uma quantidade de amostra suficiente
para o diagnóstico. Assim, quando a amostra é insuficiente para a realização do exame direto e da
cultura micológica, a cultura, na maioria dos casos, tem prioridade, por ser mais específica e sensível
quando comparada ao exame direto.
Para a realização do exame direto com a observação em microscópio, várias técnicas e colorações
podem ser empregadas, dependendo da suspeita clínica e do tipo de amostra, como veremos a seguir:
EXAME MICROSCÓPICO DIRETO COM HIDRÓXIDO DE
POTÁSSIO (KOH 20-40%)
Esta técnica pode ser utilizada para exames de pele, unha, pelos, biopsias de tecido, secreções
espessas e outros materiais densos. Após colocar uma gota do KOH 20-40% (aquoso) em uma lâmina
de vidro, deve-se transferir uma alíquota da amostra que será examinada.
 
Foto: Shutterstock.com.
 
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Em seguida, deve-se cobrir a preparação com uma lamínula de vidro e aguardar cerca de 20 minutos
para que ocorra a clarificação da amostra. Essa clarificação consiste na digestão do tecido do
hospedeiro a fim de facilitar a visualização, já que a célula fúngica permanece íntegra. Depois da
amostra clarificada, examinar em microscópio óptico comum, primeiro, com a objetiva de 10x para
localizar a amostra mais facilmente, seguida da objetiva de 40x onde será possível visualizar as
estruturas fúngicas presentes.
EXAME DIRETO COM TINTA NANQUIM (TINTA DA CHINA)
Essa preparação é utilizada para verificar a presença da levedura do gênero Cryptococcus no espécime
clínico, pois ela possui uma cápsula polissacarídica que facilita sua identificação. A tinta nanquim é a
base de água e tem cor preta, então, em contato com a levedura, sua cápsula faz um halo ao redor da
célula, que é facilmente visualizado pelo contraste do corante com o microrganismo. Para a preparação
da lâmina, deve-se colocar uma gota do sedimento da amostra após centrifugação e uma gota da tinta
nanquim, depois, cobrir com lamínula e observar no microscópio óptico, primeiro, com a objetiva de 10x
e, depois, com a de 40x.
Um erro comum nessa técnica é confundir linfócitos com as leveduras. Para que isso não ocorra, é
importante verificar a refringência da parede celular, as inclusões no citoplasma e os brotamentos das
leveduras.
 
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COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM
Ao contrário das bactérias que podem ser classificadas como Gram-positivas e Gram-negativas, todos
os fungos são Gram-positivos (coloram-se de roxo). Portanto, essa coloração não é utilizada para
diferenciar os fungos, mas permite distinguir as estruturas fúngicas de artefatos presentes nas fezes,
urina e secreções. Para a coloração de Gram, a amostra é espalhada homogeneamente com
movimentos circulares em uma lâmina de vidro e, depois, fixada com calor e seguido do protocolo da
coloração de Gram.
 
Foto: Shutterstock.com.
COLORAÇÃO PANÓTICA, LEISHMAN, GIEMSA OU WRIGHT
As colorações (Giemsa e panótico, por exemplo) podem ser utilizadas nas investigações em vários
espécimes clínicos, como sangue, medula óssea, secreção cutânea e aspirados. Para essas colorações,
a amostra precisa ser preparada como para o Gram e, depois, fixada com metanol e coradas, seguindo
o método escolhido.
 
Foto: Shutterstock.com.
EXAME HISTOPATOLÓGICO
Amostras de tecidos coletadas por biopsias podem ser coradas pelos métodos específicos e habituais
do exame histopatológico, porém a confirmação do agente etiológico somente será possível após o
isolamento e a identificação do microrganismo. Geralmente, essas técnicas são mais utilizadas para as
micoses subcutâneas, sistêmicas e oportunistas, pois evidenciam a invasão tecidual. Apesar de serem
técnicas rápidas e relativamente baratas, podem resultar em diagnósticos presuntivos, uma vez que
evidenciam as características morfológicas e as propriedades tintoriais.
A Hematoxilina-eosina (HE), utilizada rotineiramente nos laboratórios de patologia, não é indicada para
detectar estruturas fúngicas, pois muitos desses microrganismos não coram ou coram fracamente,
exceto para os fungos demáceos, que mantêm sua coloração escura facilitando a visualização. No caso
das micoses, essa coloração pode auxiliar na visualização da resposta tecidual.
 
Foto: VHAOKLSAWHR/ Wikimedia commons/ licença (CC BY-SA 4.0).
 Coloração de Hematoxilina-eosina mostrando Aspergillus niger com conídios de pigmentação
marrom (centro) e cristais de oxalato de cálcio (parte superior esquerda).
 
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 Histoplasma capsulatum aparecem como esférulas marrom-escura dentro do citoplasma dos
macrófagos. Coloração Grocott-Gomori.
Ao contrário da HE, as colorações como Gomori (impregnação pela prata), Gridley e PAS (ácido
periódico de Schiff) são mais indicadas para a detecção e a análise da morfologia tecidual e presença de
elementos fúngicos. Dentre essas, a mais indicada é a Gomori, porque permite um bom contraste entre
as estruturas fúngicas e as células do tecido do hospedeiro. Nessa coloração pela impregnação da
prata, as células fúngicas, independentemente da viabilidade, serão coradas em marrom-escuro, e o
resto poderá ser corado com o contracorante (corante de fundo) verde ou amarelo brilhante que
conferirá ao tecido uma coloração azulada.
Na coloração PAS, os fungos pigmentam-se de vermelho, facilitando a identificação. Outras técnicas,
como mucicarmim de Mayer e azul de alcian, podem ser utilizadas para suspeita de criptococose, já que
a cápsula dessa levedura será corada de vermelho ou azul.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Na coloração PAS, os fungos pigmentam-se de vermelho.
CULTURA MICOLÓGICA
O cultivo do espécime clínico para o isolamento e a identificação do agente etiológico da micose é, na
maioria dos casos, a única forma de definir o diagnóstico. Essa técnica é considerada o padrão-ouro
para o diagnóstico das micoses, o que significa que essa metodologia é o melhor exame disponível para
determinar qual agente fúngico está causando a doença. Apesar de ser considerada o padrão-ouro,
ainda existem algumas limitações, como o crescimento lento que, para alguns fungos, pode passar de
quatro semanas, a contaminação por outros microrganismos e a dependência de um analista experiente
para a identificação dos fungos isolados.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Tubos com meio de cultura.
A escolha do meio de cultura a ser utilizado depende do tipo de amostra e o suposto agente etiológico,
baseado na suspeita clínica. Outro parâmetro que auxilia na escolha do meio de cultura é baseado na
observação do exame microscópico direto da amostra. De modo geral, recomenda-se sempre dois tubos
contendo meio de cultura para a semeadura, que devem ser incubados em temperatura ambiente (25 °C
a 35 °C), independentementedo tipo da amostra.
Se a suspeita clínica estiver relacionada a fungos dimórficos, sugere-se que um dos tubos seja incubado
a 35°C. Ao contrário do que é visto na bacteriologia, onde existem vários meios de culturas indicados
para inúmeros tipos de bactérias, na micologia, não existem tantos meios seletivos que auxiliem no
isolamento apenas de um agente fúngico. Por isso, essa área da microbiologia depende tanto da
experiência do analista.
Para o isolamento dos fungos, independentemente do tipo de amostra clínica, devem ser utilizados
meios de cultura não seletivos, que permitirão o crescimento, tanto dos fungos patogênicos quanto dos
contaminantes de crescimento rápido (menor que sete dias). Apesar de os fungos contaminantes serem
encontrados facilmente nos ambientes, em alguns pacientes susceptíveis, eles assumem o papel de
agente etiológico das micoses oportunistas.
O meio de cultura mais utilizado na micologia é o ágar Sabouraud dextrose, que tem baixo custo. A
maioria dos fungos cresce nele, pois possui pH ácido (5,8) e elevado teor de glicose, tornando-o mais
seletivo para esses microrganismos. No entanto, esse meio não impede totalmente o crescimento de
bactérias.
ATIVIDADE DE REFLEXÃO
VOCÊ IMAGINA O QUE PODEMOS FAZER OU
ADICIONAR AO MEIO DE CULTURA PARA DIMINUIR
O CRESCIMENTO BACTERIANO E, ASSIM, DIMINUIR
A INTERFERÊNCIA CAUSADA PELAS BACTÉRIAS?
RESPOSTA
Em alguns casos, são acrescidos antibióticos. O cloranfenicol é o antibiótico mais usado pelo seu amplo
espectro de ação e por sua característica de suportar a esterilização por calor úmido da autoclave. Além das
bactérias, em alguns casos, também é necessário impedir o crescimento de fungos contaminantes, por essa
razão, adiciona-se cicloheximida (actidione).
O ágar Sabouraud acrescido de antibióticos é indicado para o cultivo de espécimes clínicos de lesões
suspeitas de dermatofitose. Todavia, a cicloheximida pode inibir o crescimento de fungos oportunistas
como o gênero Aspergillus, leveduras de Histoplasma capsulatum, além das leveduras patogênicas dos
gêneros Cryptococcus e Candida. Por isso, a correlação com a suspeita clínica deve nortear a escolha
do meio utilizado.
Existem ainda meios de cultura que auxiliam indicando a presença de determinados gêneros ou alguns
grupos fúngicos, porém esses meios são a exceção na micologia. Um exemplo é a detecção de
leveduras do gênero Cryptoccocus por meios de cultura, contendo compostos fenólicos, como o ágar
semente de Niger, onde a cultura dessa levedura crescerá com coloração marrom.
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Foto: Djspring / Wikimedia commons/ licença (CC BY-SA 3.0).
 A levedura do gênero Cryptococcus.
 
Foto: Shutterstock.com.
 A partir do metabolismo dos dermatófitos, o meio de cultura mudará de coloração.
Outro caso em que se pode usar esse tipo de meio é para os dermatófitos (Dermatophyte Test Medium),
que mudarão de coloração em virtude do metabolismo desses fungos.
Já para as leveduras do gênero Candida, existe um ágar que funciona por meio de reação enzimática e
colorimétrica (ChromoAgar, Cândida médium, Biggy Ágar entre outras marcas comerciais), que,
dependendo da espécie que crescer, a colônia apresentará uma coloração diferente.
 
Foto: Shutterstock.com.
 As espécies de Candida mudam de cor no meio cromogênico.
 EXEMPLO
C. albicans crescerá de verde-claro a médio, C. krusei cor-de-rosa com bordas esbranquiçadas, C.
tropicalis colorirá de azul-esverdeado a azul-metalizado. Apesar desses meios estarem disponíveis, eles
são mais caros do que o ágar Sabouraud e são mais utilizados para o isolamento primário das
leveduras, principalmente a partir de espécimes clínicos muito contaminados, como urina, fezes e
secreção vaginal. Por auxiliar e ser apenas presuntivo, a identificação do fungo será realizada somente
por meio da análise fisiológica e morfológica.
O isolamento primário é o primeiro crescimento a partir da amostra clínica que, geralmente, é feito em
um meio nutritivo e, muitas vezes, pode não apresentar somente um microrganismo. Por isso, é
necessário um novo isolamento com repique na colônia suspeita para um novo meio de cultura.
Nesse subcultivo, será utilizado o meio de cultura mais adequado para o fungo que cresceu no
isolamento primário; para os dermatófitos, recomenda-se o uso de ágar batata, pois é um meio de
cultura mais pobre que irá estimular a produção dos conídios, que são importantes aliados na
identificação dos fungos filamentosos.
 
Foto: Shutterstock.com.
 O isolamento primário apresenta inúmeros microrganismos que se multiplicam.
Já para os fungos dimórficos que têm um crescimento mais lento (maior que 15 dias), é aconselhado um
meio mais nutritivo, como o ágar infusão de cérebro e coração bovinos (BHI – Brain Heart Infusion) para
estimular o crescimento in vitro.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Processamento micológico realizado com o auxílio do bico de Bunsen.
Os meios de cultura podem ser acondicionados em tubos, com uma taxa de desidratação mais lenta e
menor chance de contaminação ambiental durante a incubação, ou em placas de Petri. A semeadura
deverá ser realizada sempre em condições assépticas dentro de uma cabine de segurança biológica
classe II ou então ao redor da área de segurança do bico de Bunsen. A incubação dos meios semeados,
geralmente, é realizada em temperatura ambiente (aproximadamente 25°C a 30°C), porém alguns
fungos podem se multiplicar mais lentamente nessa temperatura.
Agora que já conhecemos os meios de cultura, vamos entender como devemos realizar a cultura
micológica.
PROCEDIMENTOS PARA A CULTURA MICOLÓGICA
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Foto: Shutterstock.com.
Após a preparação dos espécimes clínicos e a escolha adequada do meio de cultura a ser utilizado, as
amostras deverão ser semeadas na superfície do meio de cultura com o auxílio de uma pipeta Pasteur,
alça de níquel-cromo ou descartável.
A metodologia de semeadura por esgotamento é a mais indicada, pois proporciona um melhor
espalhamento da amostra e, consequentemente, a separação das colônias, facilitando a distinção dos
fungos contaminantes dos patogênicos.
 
Foto: Shutterstock.com.
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Imagem: Pamella Sales.
Essa técnica por esgotamento consiste em fazer movimentos em zigue-zague em toda a superfície do
meio, como ilustra a imagem.
No momento da semeadura, deve-se ter cuidado, pois o material não pode ser colocado em
profundidade no meio sólido, sendo apenas depositado na superfície do ágar.
 
A temperatura de incubação do isolamento primário é recomendada que seja em temperatura ambiente
(25°C a 30°C), pois esta permite o crescimento inclusive de microrganismos oportunistas e é fácil de ser
conseguida em muitas regiões do Brasil, sem a necessidade de utilizar estufas do tipo BOD
(Biochemical Oxygen Demand) para controlá-la. Se amostras ditas contaminadas, como urina,
secreções respiratórias ou vaginais e fezes, forem incubadas a 37°C, poderão diminuir
consideravelmente a sensibilidade da cultura, pois essa temperatura estimula a proliferação bacteriana
que interferirá diretamente no sucesso do isolamento.
O tempo de crescimento das colônias dependerá da espécie fúngica, do tipo e da qualidade do meio de
cultivo, do processamento prévio da amostra clínica, da temperatura de incubação e da presença de
contaminantes ou inibidores no material. O isolamento primário de leveduras pode apresentar
crescimento rápido em torno de 24 horas, por outro lado, fungos dimórficos podem demorar até 4
semanas para começarem um crescimento visível no ágar. Por isso, para minimizar o risco da liberação
de falsos-negativos, é necessário esperar até 30 dias, dependendo da suspeita clínica, para liberar o
resultado definitivo das culturas.
Como já vimos em todo o processo do diagnóstico micológico, o êxito do isolamento primário também
depende de inúmeros fatores. A qualidade do espécime clínico é influenciada diretamente pela coleta
adequada, de acordo com a suspeita clínica.
 EXEMPLO
A coletaequivocada de líquido de vesículas em caso de suspeita de dermatofitose ou crostas em lesões
suspeitas de esporotricose diminui muito a chance de isolamento do agente etiológico.
Outro fator a ser considerado é a quantidade de material coletado, pois, em algumas micoses, a carga
fúngica na lesão é muito pequena, o que dificulta ainda mais o isolamento do fungo, aumentando os
riscos dos falsos-negativos.
IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS
Após o processamento da amostra, os tubos ou placas onde foram semeados deverão ficar em
incubação com verificação periódica, sendo realizada no mínimo três vezes por semana ou diariamente,
o que é mais recomendado. Essa verificação periódica é extremamente importante, pois, assim que for
observado o crescimento de uma colônia com características sugestivas da suspeita clínica, ela poderá
ser transferida para um cultivo secundário, evitando que contaminantes impeçam a viabilidade desse
fungo e sua correta identificação.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Durante a incubação, deve-se realizar a verificação periódica dos cultivos.
Em alguns cultivos, pode ser difícil identificar e decidir qual será o possível fungo patogênico, já que, em
espécimes clínicos contaminados, é comum o crescimento de muitos tipos diferentes de
microrganismos. Por isso, nesses casos em que não se sabe exatamente qual colônia poderá ser
descartada e qual seguirá sendo analisada, recomenda-se que todas as colônias suspeitas sejam
isoladas e identificadas até a definição do provável agente etiológico baseado na suspeita clínica.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Verificação de uma colônia ao microscópio com uso do corante na lâmina.
Tão pronto quando observado o crescimento sugestivo do agente etiológico, pode-se realizar uma
verificação prévia em microscópio óptico. Uma porção da colônia suspeita deve ser removida em
ambiente estéril, com o auxílio de uma alça de níquel-cromo em “L”, e colocada em uma lâmina de vidro
com lactofenol azul de algodão, para fungos hialinos e, ou somente, lactofenol, para fungos demáceos.
O ácido lático dessa solução preserva as estruturas do fungo, enquanto o fenol inviabiliza os
microrganismos vivos e o azul de algodão cora a quitina, abundante na parede celular fúngica.
FUNGOS HIALINOS
São aqueles que não são pigmentados, apresentando suas hifas transparentes ou com colorações
que não apresentam contraste ao serem observadas em microscópio óptico. É necessária a
utilização de um corante que contrastará, facilitando a sua observação.
FUNGOS DEMÁCEOS
São fungos pigmentados com muita melanina em suas estruturas e apresentam colocação que
varia do marrom ao negro. Não é necessário corantes para sua observação em microscópio.
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Esta verificação auxilia na escolha dos posteriores métodos de identificação que serão empregados.
Após essa verificação prévia, a colônia pode ser transferida com o auxílio de uma alça para um novo
meio de cultura visando a um crescimento puro. Essa nova semeadura será o cultivo secundário.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Transferência de colônia suspeita para um novo ágar.
Nesse cultivo secundário, além de se obter um único tipo de fungo, também é possível uma melhor
observação macroscópica, pois o fungo tem uma maior superfície para o crescimento não competindo
com os possíveis contaminantes presentes no cultivo primários.
Você imagina como é feita a identificação dos fungos? Será que é da mesma forma que a
identificação das bactérias, utilizando provas bioquímicas?
A identificação da maior parte dos fungos filamentosos ocorre pela observação da morfologia de suas
estruturas de reprodução, por isso é importante ter uma cultura secundária pura para que não ocorra
confusão nesse momento da verificação das estruturas de reprodução. Além disso, a escolha correta do
meio de cultura também terá influência direta na produção dos esporos, pois muitos fungos quando
crescem em meios ricos deixam de criar estruturas de reprodução. Logo, nesses casos, é importante
ofertar um meio mais pobre, como o ágar batata dextrose, que favorecerá a formação dos esporos.
Alguns analistas mais experientes conseguem identificar o gênero de alguns fungos já no isolamento
primário, principalmente se for um fungo filamentoso e apresentar as estruturas de reprodução nesse
primeiro cultivo. Por isso, a observação macro e microscópica é tão relevante. Entretanto, a identificação
da maioria dos fungos necessita de uma avaliação mais completa da macro e micromorfologia a partir
dos cultivos secundários puros e, no caso das leveduras, há a necessidade de testes fisiológicos, já que,
muitas vezes, sua morfologia não difere de uma espécie para outra.
IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS FILAMENTOSOS
A maioria dos fungos filamentosos são identificados com base em suas características macro e
micromorfológicas. Para tanto, é necessário observar algumas estruturas que podem definir os gêneros,
ou até mesmos as espécies, em alguns casos. Muitas vezes, as colônias não apresentam
características morfológicas de uma determinada espécie ou gênero, porém essa observação
acrescenta informações importantes quando associadas a outros aspectos para completar a
identificação.
Vamos saber mais sobre essas características abaixo:
TEXTURA
 
Foto: Shutterstock.com.
Algodonosa ou cotonosa: o micélio aéreo é proeminente e volumoso. As colônias algodonosas lembram
pelos e tufos.
 
Foto: Shutterstock.com.
Velutínea ou aveludada: o micélio aéreo está bem aderido à superfície do ágar com aspecto aveludado.
 
Foto: Shutterstock.com.
Pulverulenta ou granular: a superfície da colônia é plana, friável com aspecto de poeira e se fragmenta
facilmente por causa da alta produção de conídios. Os fungos com aparência pulverulenta lembram uma
poeira em sua superfície.
 
Foto: Shutterstock.com.
Cérea ou glabrosa: micélio aéreo escasso e com superfície lisa.
TOPOGRAFIA
 
Foto: Shutterstock.com.
A topografia da colônia dos fungos filamentosos na maioria das vezes está encoberta pelo micélio aéreo,
então, para observá-la, é indicado o reverso da colônia.
O reverso da colônia pode ser plano sem rugosidades ou sulcos, ou então apresentar uma das
características abaixo:
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Rugosa: apresentando sulcos profundos, ranhuras ou estrias que são distribuídas irregularmente a
partir do centro da colônia.
Umbilicada: elevação central que pode conter estrias.
Verrucosa: apresenta superfície ondulada com dobras.
REVERSO DA COLÔNIA
O reverso da colônia é a parte de trás, seja embaixo da placa de Petri seja atrás do tubo.
COR
 
Foto: Shutterstock.com.
Os aspectos referentes à coloração devem ser observados no verso (frente da colônia) e no anverso
(atrás da colônia), além da presença de padrões como anéis concêntricos. Importante salientar que a
coloração da cultura pode variar de acordo com a idade da colônia. Alguns fungos apresentam colônias
jovens com coloração clara que tendem a escurecer com o amadurecimento do cultivo, por isso deve-se
atentar à idade do cultivo quando fizer esse tipo de observação.
TERMOCONVERSÃO
O dimorfismo térmico é a capacidade de um fungo assumir, tanto a forma filamentosa quanto a de
levedura. Essa mudança ocorre por múltiplos fatores e o principal deles é a temperatura, por isso é
possível estimular essa mudança em laboratório. Caso a hipótese clínica seja de uma micose causada
por fungo dimórfico, as colônias suspeitas em sua fase filamentosa devem ser semeadas em meios ricos
como BHI e incubadas a 37°C, com a finalidade de verificar se começarão a crescer como leveduras.
MICROMORFOLOGIA
A identificação dos fungos filamentosos é baseada, majoritariamente, pela observação de tamanho,
formato, disposição e coloração dos conídios ou esporos. Caso esses sejam ausentes, é necessário o
uso de técnicas mais complexas baseadas no estudo do DNA ou exoantígenos do fungo, já que a mera
observação das hifas vegetativas não agrega muita informação ou distinção entre os gênerosfúngicos.
Inúmeros fatores podem causar a ausência de esporulação, como fungos provenientes de pacientes que
estavam sobre tratamento prévio com antifúngico ou subcultivos frequentes. Em alguns casos que o
isolamento primário não apresente esporulação, é preciso mudar o meio no cultivo secundário para um
meio mais pobre, como o ágar batata ou ágar fubá.
 
Foto: Shutterstock.com.
Algumas vezes, uma alíquota diretamente do cultivo primário ou secundário é suficiente para observar
em microscópio as estruturas de reprodução dos fungos filamentosos. No entanto, a maioria perderá seu
arranjo original, que dificultará sua identificação, por isso a técnica de microcultivo é indicada. Essa
técnica consiste em semear porção de uma colônia pura para que ela cresça sem interferência no seu
arranjo facilitando a identificação. A fim de conhecer melhor a técnica do microcultivo, não deixe de
visitar o Explore +, lá você conhecerá com mais detalhes como executá-la.
 
Foto: Shutterstock.com.
Com a lâmina pronta após o processamento do microcultivo, alguns aspectos precisam ser observados
em microscópio óptico, primeiramente, com a objetiva de 10x e, depois, com a de 40x, como:
Coloração das hifas, se são hialinas ou demáceas.
Estrutura das hifas, se são septadas ou sem septos aparentes (asseptadas ou cenocíticas).
Arranjo e forma dos conídios no conidióforo.
Presença ou ausência de macro- ou microconídios.
Outras estruturas ou projeções típicas, como rizoides (Rhizopus sp.), células podais (Aspergillus
spp.) ou hifas em forma de gavinha (Trichophyton mentagrophytes).
Forma e inserção dos conidióforos nas hifas vegetativas.
De posse dessas informações, mais as características macroscópicas e a suspeita clínica, o analista
consegue, na maioria das vezes, sugerir o gênero e, em alguns casos, a espécie do agente etiológico da
micose.
IDENTIFICAÇÃO MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DE
LEVEDURAS
As leveduras fazem parte da microbiota normal da pele, mucosa vaginal, oral e trato intestinal, por isso o
isolamento desses microrganismos deve ser criterioso, já que podem não ter qualquer significado
clínico. Entretanto, em pacientes com fatores predisponentes ou debilitados, as leveduras podem
assumir o papel de patógenos oportunistas. Quando as leveduras são isoladas de determinadas
amostras clínicas, tal como liquor, biopsias, hemoculturas, líquidos biológicos, normalmente, estéreis ou
de isolamentos consecutivos de pacientes imunocomprometidos, são significantes e devem ser
adequadamente identificadas.
Ao contrário do observado para os fungos filamentosos, as leveduras não apresentam características
morfológicas marcantes de modo que os gêneros sejam facilmente diferenciados. Logo, a simples
observação macro e microscópica pode não trazer tanta informação diagnóstica.
Nos casos suspeitos de doenças causadas por leveduras, assim como para os fungos filamentosos, a
identificação deve ser realizada a partir de uma cultura pura isenta de bactérias, ou outros fungos
contaminantes, de forma que não haja interferência e dúvidas na determinação do agente etiológico. A
escolha do teste que será realizado para a identificação da levedura depende da suspeita clínica, dos
resultados obtidos nos exames direto e de algumas características macromorfológicas que podem dar
algum indício do agente etiológico.
 
Foto: Shutterstock.com.
 As espécies de leveduras apresentam características macro e microscópica muito parecidas.
Como já aprendemos, para as colônias suspeitas de leveduras do gênero Cryptococcus, a pesquisa da
cápsula com tinta nanquim evidencia o halo formado por essa estrutura juntamente com os brotamentos.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Formação de um tubo germinativo a partir da célula leveduriforme.
A prova morfofisiológica mais comum para o gênero Candida é a produção de tubo germinativo que é
característico da espécie C. albicans e que as outras espécies de Candida (C. não-albicans) não
produzem.
Outro teste que pode ser realizado para diferenciar as leveduras é o cultivo em lâmina, que evidenciará
a produção de hifas verdadeiras ou pseudohifas.
 
Foto: Jojoe Wang / Shutterstock.com.
 O cultivo em lâmina.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Hifas fragmentadas formando artroconídios.
Caso esse teste apresente hifas hialinas, sem fragmentação e ramificadas, sugere o gênero Candida;
porém, se apresentar clamidoconídios, é indicativo da espécie Candida albicans. Se as hifas ramificadas
verificadas no cultivo em lâmina se fragmentarem em artroconídios, sugerem os gêneros Trichosporon e
Geotrichum.
A maioria da identificação a nível de espécie ocorre por meio de provas bioquímicas, que são
necessárias para identificar espécies intrinsicamente resistentes a algum antifúngico. Por exemplo, a
levedura Candida krusei é resistente ao fluconazol, antifúngico normalmente prescrito para candidíase.
A prova da urease, comumente empregada na rotina da bacteriologia, também pode ser utilizada para
auxiliar na identificação das leveduras. Leveduras do gênero Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula e
algumas espécies de Candida são urease positivas, mas, quando associadas a outras informações
morfológicas, é possível diferenciar as duas, já que a colônia da Rhodotorula tem coloração laranja ou
avermelhada.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Prova da urease.
As provas de assimilação de fontes de nitrogênio e carbono (auxanograma) e de fermentação de
carboidratos (zimograma) devem ser aplicadas para auxiliar na identificação das leveduras, caso
técnicas mais simples, como a verificação morfológica, não conduzam a um diagnóstico presuntivo.
Nesses testes, as leveduras são semeadas em meios contendo apenas um tipo de fonte de carbono ou
nitrogênio, e será verificada a capacidade dessa levedura de crescer ou produzir gás a partir da
fermentação realizada na ausência de oxigênio. Já existem kits comerciais e alguns automatizados que
auxiliam na identificação das leveduras, fornecendo um diagnóstico prático e rápido para uma liberação
mais ágil do laudo, que orientará o tipo de tratamento que o paciente receberá.
METODOLOGIAS AUXILIARES
Para a maioria das micoses, os métodos convencionais de diagnóstico baseados no exame direto e na
cultura micológica apresentam boa sensibilidade e vantagens econômicas. No entanto, existem alguns
casos que essas técnicas clássicas demoram muito para liberar o resultado, não conseguem a definição
do diagnóstico ou identificação do patógeno sozinhas. Isso acontece principalmente em microrganismos
emergentes ou oportunistas. Por esse motivo, algumas doenças fúngicas necessitam de testes que
realizam a observação indireta da presença do fungo utilizando métodos imunológicos ou moleculares.
TESTES IMUNOLÓGICOS
A pesquisa de antígenos e anticorpos no soro dos pacientes tem servido de grande auxílio para o
diagnóstico, prognóstico e para o monitoramento do tratamento. Os testes que buscam determinar a
titulação de anticorpos presentes seja no soro seja no liquor são úteis, principalmente, nas micoses
sistêmicas, mas não são tão eficazes para outras infecções fúngicas. Por isso, a pesquisa de anticorpos
no soro, no liquor e na urina é importante para o diagnóstico de micoses como coccidioidomicose,
paracoccidioidomicose, criptococose e histoplasmose.
Várias técnicas podem ser empregadas para a pesquisa dos anticorpos séricos, as mais comuns são as
técnicas de imunodifusão e de fixação do complemento. Mesmo que o valor diagnóstico baseado nessas
técnicas seja limitado, são indicadas, principalmente, quando não é possível evidenciar o fungo no
exame direto ou cultura micológica. A imunodifusão em gel de ágar é sensível, prática e específica no
diagnóstico das micoses sistêmicas, bem como no acompanhamento da evolução e conduta terapêutica.
Além da imunodifusão, também é possível utilizar testes ELISA e Western-blot devido à sua
sensibilidade.
 
Foto: Darreenvt / Wikimedia commons/licença (CC BY-SA 4.0)
 Imunodifusão.
 
Foto:Shutterstock.com.
 Testes intradérmicos.
É possível realizar também testes intradérmicos (o famoso PPD) com a injeção de antígeno na face
anterior do antebraço com a finalidade de pesquisar o grau de sensibilidade do paciente aos antígenos
do fungo. Esse exame é, geralmente, aplicado no diagnóstico de manifestações alérgicas, por exemplo,
nos casos de broncopneumonia por Aspergillus sp. Além disso, pode ser empregado para investigações
epidemiológicas para delimitação de áreas endêmicas de determinado fungo, porém sem grande valor
diagnóstico, uma vez que não é possível diferenciar infecções presentes e passadas.
A investigação de antígenos fúngicos circulantes é uma metodologia estudada mais recentemente e tem
se mostrado satisfatória no diagnóstico de meningites causadas por Cryptococcus neoformans e
algumas infecções por Candida albicans. A detecção no soro ou liquor do antígeno polissacarídico do C.
neoformans é um método rápido para o diagnóstico baseado na aglutinação de partículas de látex.
Atualmente, diversos kits comerciais estão disponíveis, porém, ocasionalmente, alguns resultados falso-
negativos ou falso-positivos podem ocorrer.
 
Foto: Neha Shrestha, Mahesh Adhikari, Vivek Pant, Suman Baral, Anjan Shrestha, Buddha Basnyat,
Sangita Sharma e Jeevan Bahadur Sherchand / Wikimedia commons/ licença (CC BY 4.0).
 A aglutinação em látex.
MÉTODOS MOLECULARES
As técnicas moleculares que são empregadas em muitas outras áreas também podem ser utilizadas na
micologia. Embora sejam técnicas caras, necessitem de pessoal especializado e, muitas vezes, sejam
restritas aos laboratórios de pesquisa, apresentam alta sensibilidade e especificidade.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Técnicas moleculares, apesar de sensíveis e específicas, ainda possuem alto custo.
O sequenciamento do DNA baseado a partir da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR - Polymerase
Chain Reaction) é ferramenta útil na identificação depois do isolamento e crescimento em cultivo.
Atualmente, existem vários protocolos para a preparação da amostra, mas ainda não existe um método
universal ideal para a extração, purificação e concentração do DNA do fungo a partir dos espécimes
clínicos. As limitações relacionadas à análise realizada diretamente das amostras clínicas ocorrem, pois,
muitas vezes, o número de células fúngicas na lesão é limitado ou possui populações mistas. Além
disso, podem conter RNases ou DNases que degradam o material genético fúngico, ou outros inibidores
que podem interferir nos passos da amplificação.
A utilização a partir do espécime clínico ainda é muito limitada, sendo necessário o cultivo e isolamento
do agente etiológico. Outra dificuldade na pesquisa molecular de fungos é a extração do DNA, que
necessita de protocolos complexos e que utilizam reagentes tóxicos e nocivos.
Um dos marcadores moleculares usados é o sequenciamento da região ITS (Internal Transcribed
Spacer), que pode ser amplificado utilizando primers específicos. Essa região é amplamente estudada
por ser uma região muito conservada entre os gêneros fúngicos, mas são variáveis nas espécies,
proporcionando a distinção intraespecífica. Para aumentar a confiabilidade, outras regiões também
podem ser analisadas com o sequenciamento dos genes da β-tubulina, calmodulina e fator de
elongação.
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS
(ANTIFUNGIGRAMA)
Para o tratamento das doenças fúngicas, existem alguns fármacos com atividade antifúngica, diferentes
espectros de ação e alvos terapêuticos. Dentre eles, podemos citar algumas classes como os azólicos
(itraconazol, cetoconazol, voriconazol, entre outros), as equinocandinas (micafungina, caspofungina e
anidulafungina), as alilaminas (terbinafina) e os polienos (anfotericina B e nistatina).
Os testes de sensibilidade aos antifúngicos podem ser realizados por discodifusão ou por microdiluição
em caldo, dependendo do protocolo a ser seguido ou do microrganismo estudado. No teste de
discodifusão, pode-se utilizar placas de Petri com o ágar Muller-Hinton (suplementado com 2% de
dextrose e 0,5 µg/mL de azul de metileno). Para tanto, uma determinada concentração do fungo é
semeada em toda superfície desse meio de forma homogênea. Imediatamente após, é acrescido um
disco de papel filtro contendo o antifúngico a ser pesquisado. Depois da incubação, é verificado o halo
de inibição ao redor do disco que indicará a ação do antifúngico.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Discodifusão.
 
Foto: Shutterstock.com.
 Microdiluição em caldo
Já na microdiluição em caldo, o antifúngico é acrescido do meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute)
e, em placa de 96 poços, é realizada a diluição seriada. Posterior à diluição do antifúngico, o fungo é
adicionado a todos os poços. A leitura feita após o período de incubação marcará o CIM (Concentração
Mínima Inibitória, ou em inglês MIC), que será a primeira concentração capaz de inibir o crescimento do
microrganismo.
Ao longo dos anos, após complexas análises, os testes de sensibilidade aos antifúngicos foram
padronizados e atualmente dois institutos elaboraram protocolos aceitos internacionalmente, são eles o
CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute – Estados Unidos) e o EUCAST (European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing – Europeu). Mais recentemente, criou-se o BrCAST, que é o comitê
brasileiro que organiza todas as informações sobre os testes de sensibilidade dos microrganismos. Para
conhecer mais sobre o BrCAST e os protocolos que estão disponíveis gratuitamente, não deixe de
visitar o Explore +.
Além da padronização das técnicas para os diferentes agentes fúngicos, essas entidades também
delimitam o breakpoint, que é o ponto de corte para a interpretação do resultado se o fungo será
resistente ou sensível ao antifúngico. A determinação do breakpoint é extremamente complexa, por isso,
atualmente, os mais conhecidos são para leveduras do gênero Candida e para os fungos do gênero
Aspergillus. Outra limitação é que não existe um protocolo padronizado para avaliar o perfil de
sensibilidade dos fungos dimórficos.
Ao contrário do que é visto com as bactérias, em que, rotineiramente, são realizados antibiogramas para
verificar os perfis de resistência; para os fungos, essa técnica não é tão empregada na rotina clínica.
Geralmente, o antifungigrama é utilizado para determinação do perfil de sensibilidade das leveduras do
gênero Candida, enquanto importante agente das micoses nosocomiais. Ou ainda, nos casos em que o
paciente não responde bem ao tratamento proposto e é necessário verificar o aparecimento de cepas
resistentes ou então uma possível alternativa terapêutica.
 SAIBA MAIS
Infecções nosocomiais são as infecções adquiridas durante a internação hospitalar (infecção
hospitalar), normalmente causadas por fungos e bactérias.
No vídeo a seguir, veja a especialista explicando o processamento dos espécimes clínicos e
identificação de possível agente etiológico da micose.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. O DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO PODE SER FEITO UTILIZANDO INÚMERAS
METODOLOGIAS, A FIM DE DESCOBRIR QUAL É O AGENTE ETIOLÓGICO DA
MICOSE. DENTRE OS TESTES REALIZADOS, QUAIS SÃO OS TESTES
CONSIDERADOS CLÁSSICOS?
A) Exame direto e cultura micológica
B) Teste sorológico e cultura micológica
C) Análise molecular e exame direto
D) Histopatológico e cultivo secundário
E) Teste sorológico e análise molecular
2. ATUALMENTE, AS MICOSES SÃO DOENÇAS QUE VÊM DESPONTANDO COMO
GRAVE PROBLEMA DE SAÚDE PÚBLICA. OS FUNGOS FILAMENTOSOS SÃO
AGENTES ETIOLÓGICOS DE MUITAS DESSAS MICOSES. QUAIS
CARACTERÍSTICAS PRECISAM SER OBSERVADAS PARA IDENTIFICAR ESSES
MICRORGANISMOS?
A) Topografia das hifas e a macromorfologia das colônias
B) Coloração das colônias e a micromorfologia das hifas
C) Micromorfologia dos micélios vegetativos e macromorfologia das hifas
D) Textura da superfície da colônia e micromorfologia da colônia
E) Macromorfologia das colônias e micromorfologia das estruturas de reprodução
GABARITO1. O diagnóstico micológico pode ser feito utilizando inúmeras metodologias, a fim de descobrir
qual é o agente etiológico da micose. Dentre os testes realizados, quais são os testes
considerados clássicos?
A alternativa "A " está correta.
 
O exame direto e a cultura micológica são as metodologias clássicas dentro da micologia, sendo
utilizadas há anos e, na maioria dos casos, conseguem definir o diagnóstico.
2. Atualmente, as micoses são doenças que vêm despontando como grave problema de saúde
pública. Os fungos filamentosos são agentes etiológicos de muitas dessas micoses. Quais
características precisam ser observadas para identificar esses microrganismos?
A alternativa "E " está correta.
 
A identificação dos fungos filamentosos é baseada nas características observadas na colônia e nas
estruturas de reprodução, já que as hifas vegetativas não agregam tanta informação.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com o avanço da Medicina, prolongando a expectativa de vida e os tratamentos que interferem
diretamente na imunidade dos indivíduos, as doenças fúngicas começaram a despontar como um grave
problema de saúde pública. Por isso, para o melhor manejo dos pacientes acometidos por micoses dos
mais variados tipos, o diagnóstico laboratorial adequado é primordial.
Como vimos neste tema, o diagnóstico micológico depende de muitas etapas, que compreendem desde
a correta requisição do exame, passando pela escolha adequada do tipo de exame direto, meio de
cultura e técnicas auxiliares de identificação, caso necessário, até chegar à liberação do laudo. Na
micologia, ainda não existem tantos protocolos automatizados e, por isso, depende-se muito de um
analista experiente e dedicado para que o diagnóstico seja um sucesso.
AVALIAÇÃO DO TEMA:
REFERÊNCIAS
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Detecção e identificação de fungos de
importância médica. In: Microbiologia Clínica para o controle de infecção relacionada à assistência à
saúde. Brasília: Anvisa, 2013.
FERREIRA, A. W.; MORAES, S. DO L. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas
e autoimunes. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 6. ed. São Paulo: Atheneu, 2015.
EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema:
Assista ao I Minicurso LIMIP/UFF online: Identificação de fungos e a técnica de microcultivo. Nele,
conseguimos aprender tudo sobre a técnica de microcultivo. Vale pena a visita!
Procure no Google pelo “BrCAST”, veja os protocolos disponíveis e clique em “Subcomitê de
antifúngicos”, para acessar todo o material sobre os testes com antifúngicos.
Leia o artigo Brazil is so far free from Candida auris. Are we missing something?, disponível na
biblioteca virtual em saúde do Ministério da Saúde, e saiba mais sobre o caso de Candida auris no
Brasil, um fungo emergente que representa uma grande ameaça à saúde global.
CONTEUDISTA
Pãmella Antunes de Macêdo Sales
 CURRÍCULO LATTES
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