Extração de DNA de Cebola e Desenho de Primers

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Roteiros 
Bioengenharia e Biotecnologia 
Aplicada à Biomedicina
Manual de Estágio
Instituto de Ciências da Saúde
Disciplina: Bioengenharia e 
Biotecnologia Aplicada à Biomedicina
Título da aula: Extração de DNA
AULA 1
ROTEIRO 1
OBJETIVO:
Extração de DNA de cebola utilizando produtos de uso doméstico (detergente para lavar 
louça, sal de cozinha e álcool).
A extração de ácidos nucleicos (DNA e/ou RNA) geralmente é a primeira de várias etapas 
para o estudo da biologia molecular de qualquer organismo. Nesta aula, serão utilizados 
produtos de uso doméstico para a extração de DNA da cebola (Allium cepa), para demonstrar 
que procedimentos para extração de ácidos nucleicos são simples e podem ser executados 
mesmo em laboratórios sem infraestrutura específica para esse fim. 
PROCEDIMENTOS:
1. Rale a cebola e coloque o material ralado em um dos frascos (retirar as sépalas).
2. Adicione 100 mL de uma solução feita com 80 mL de água quente, 20 mL de 
detergente e uma colher de sopa de sal (NaCl) – solução de lise. Misture bem a solução 
com a cebola ralada. 
Aguardar aproximadamente 5-10 min. 
3. Coloque o frasco com a cebola ralada em um banho de gelo (recipiente com um 
pouco de água e gelo). À medida que a suspensão onde está a cebola ralada esfriar, 
deverá ser possível observar que o líquido parece estar “talhando” (formando grumos). 
4. Quando a suspensão com a cebola ralada estiver fria, filtre-a com gaze e colete o 
líquido filtrado em um frasco limpo. 
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5. Incline o frasco de vidro com o líquido filtrado (ângulo de 30º a 40º) e derrame 
vagarosamente, pela parede lateral, o álcool gelado. Você verá que o álcool não se mistura 
prontamente com a solução filtrada, havendo a formação de duas fases (na superior fica 
o álcool). Entre as duas fases, é possível observar a formação de um precipitado com 
aspecto de “fiapos” esbranquiçados, que são os ácidos nucleicos. 
6. Com a ajuda do bastão ou da pipeta de vidro, é possível enrolar os ácidos nucleicos 
que estão precipitando, ou seja, você pode “pescar” o DNA da cebola. 
7. Uma vez enrolados no bastão, os ácidos nucleicos devem secar por alguns minutos ao 
ar para a evaporação do etanol; depois, o material deve ser transferido da extremidade 
do bastão para um tubo com 0,5 mL de água destilada. Assim, a amostra será reidratada 
rapidamente e o DNA em solução poderá posteriormente ser analisado por eletroforese 
em gel de agarose (caso tenha os aparelhos para tal).
MATERIAIS QUANTIDADE
Uma cebola grande ou morangos 4 morangos/grupo ou ½ de cebola/grupo
Ralador 1
Saco zap 1 por grupo
Sal de cozinha (NaCl)
Detergente para lavar louça (líquido ou gel) 
incolor
Água quente (65°C a 80°C)
Papel-filtro ou filtro de café ou gaze
Funil ou suporte para filtro de café
Gelo
Álcool 96°GL gelado
Dois frascos de vidro (~200 mL)
Bastão ou pipeta de vidro
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EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Recipiente (plástico ou isopor) para o banho de gelo
OBS.: a quantidade a ser utilizada deverá ser discutida com o professor.
Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança:
As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente.
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Instituto de Ciências da Saúde
Disciplina: Bioengenharia e 
Biotecnologia Aplicada à Biomedicina
Título da aula: Desenho de 
Oligonucleotídeos (primers)
AULA 1
ROTEIRO 2
OBJETIVO:
Introduzir os bancos de dados de anotação genômica e apresentar as ferramentas 
de bioinformática, como o primer blast. Fundamento: os oligonucleotídeos iniciadores 
(primers) são necessários para a síntese de DNA in vitro. O desenho de iniciadores 
adequados é importante para o bom rendimento da reação de PCR. O iniciador direto 
(forward) amplifica fragmentos na mesma direção da transcrição, enquanto o iniciador 
reverso (reverse) amplifica fragmentos na direção inversa à transcrição. Atualmente, estão 
disponíveis diversos softwares para o desenho de primers. Contudo, certas recomendações 
devem ser seguidas e a análise visual detalhada é primordial para a escolha do par correto. 
Os primers são muito importantes nas reações de PCR, em tempo real, para o diagnóstico 
da COVID-19. Para a realização dessa reação são desenhados primers específicos para as 
3 regiões do RNA viral, o gene que codifica para o nucleocapsídeo (N), o que codifica para 
RdRp (RNA polimerase dependente de RNA) e o envelope (E). A avaliação desses genes por 
PCR, em tempo real, permite avaliar se o paciente está ou não contaminado pelo vírus.
A seguir, são listadas algumas regras essenciais para o desenho de primers: 
1. Presença de uma extremidade OH livre no carbono 3’; 
2. Conteúdo GC bem distribuído em todo o primer (35% a 60%); 
3. Complementaridade com a fita molde (é tolerável algum mau pareamento ou 
mismatch, exceto na extremidade 3’); 
Manual de Estágio
4. Temperatura de pareamento (52 a 58 ºC, e não passar de 5 ºC de diferença, entre o 
direto e o reverso); 
5. Tamanho do primer (18 a 24 nt); 
6. Distância máxima e mínima entre os primers (20 pb a 20 Kb; média: 100 pb e 5 Kb); 
7. Concentração iônica ideal da solução (50 mM de MgCl2); 
8. Evitar self-annealing (autopareamento) e dimers (dímeros). 
MATERIAL: 
Esta aula deverá ser desenvolvida no laboratório de informática. Os alunos irão precisar 
de acesso à internet.
Tarefas a serem realizadas no computador: 
1. Entrar no site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/; 
2. Escolher a base de dados “genome” e digitar “sars cov 2” na busca; 
3. Discutir com os alunos as informações apresentadas; 
4. Clicar no link que aparece em “RefSeq”; 
5. Após, clicar em FASTA (sequência completa do DNA) e Grafics (Organização genômi-
ca com a posição dos genes). Aproveitar para introduzir o conceito de ORF e discutir 
com os alunos alguns genes apresentados;
6. Copiar a referência do genoma no NCBI  NC_045512.2; 
7. Entrar no site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/; 
8. Colar a referência copiada no primeiro quadro branco que aparece [Enter accession, 
gi, or FASTA sequence (A refseq record is preferred)]; 
9. Clicar em “Get primers”, no final da página; 
10. Aguardar a sugestão de primers pelo programa e discutir com os alunos os parâ-
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metros apresentados (tamanho, temperatura de melting, conteúdo GC, autocomple-
mentariedade); 
11. Cheque os seus resultados e eleja a melhor opção, justificando-a; 
12. Desenhe os novos primers, alterando os parâmetros. 
EXERCÍCIOS: 
1. A qual organismo pertence a sequência trabalhada? A que tipo de produto ela cor-
responde? 
2. Qual seria melhor: um primer com o tamanho igual a 15 ou igual a 23 b (considere 
as condições ideais iguais para os demais parâmetros)? Justifique. 
3. Por que é importante considerar a temperatura de pareamento na hora de confec-
cionar o primer? 
4. Quais parâmetros devem ser analisados na síntese de primers para o PCR?
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Disciplina: Bioengenharia e 
Biotecnologia Aplicada à Biomedicina
Título da aula: Observação de Leveduras
AULA 2
ROTEIRO 1
OBJETIVO:
Observar as leveduras utilizando diferentes técnicas. 
As leveduras ou fermentos são microrganismos de grande importância econômica. Como 
agentes biológicos da fermentação alcoólica, as leveduras participam tanto na produção de 
biocombustíveis (etanol de cana-de-açúcar) como na indústria de alimentos (pães, bolos, 
bebidas alcoólicas). 
PROCEDIMENTOS:
A. Observação macroscópica
Observar e comparar a textura, a cor e o cheiro do fermento seco e do fermento fresco. 
B. Observação microscópica
Observar, no microscópio, um pouco de levedura fresca em uma gota de água. 
C. Observação de colônias
1. Abrir um pacote de fermento e, com uma espátula bem limpa, transferir uma pitada 
de fermento para um tubo de ensaio com 5 mL de água esterilizada.
2. Molhar um cotonete na suspensão de leveduras.
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3. Em condições assépticas, abrir a placae deslizar o cotonete sobre a superfície do 
meio nutriente.
4. Fechar a placa.
5. Incubar a temperatura ambiente de 48 a 72 horas.
6. Observar as colônias. 
7. Desenhar ou fotografar as colônias.
8. Pode-se fazer coloração de Gram ou tinta nanquim.
Discutir sobre o uso de leveduras em biotecnologia com artigos.
Recomenda-se a leitura do artigo disponível em: http://www.biotecnologia.com.br/
revista/bio12/proteinas.pdf.
MATERIAIS QUANTIDADE
Fermento de padaria fresco
Fermento de padaria seco instantâneo
Conta-gotas 1 por grupo
Cotonetes
Placa de Petri com meio nutriente de Sabouraud estéril preparado 
como indicado no Guia 30 (meios de cultura: Sabouraud para fungos)
1 por grupo
Tubo de ensaio com 5 mL de água destilada 1 por grupo
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Microscópio
Lâminas e lamínulas
Tubos de ensaio com 5 mL de água estéril
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OBS.: a quantidade a ser utilizada deverá ser discutida com o professor.
Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança:
As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente.
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Disciplina: Bioengenharia e 
Biotecnologia Aplicada à Biomedicina
Título da aula: As proteases nos produtos 
comerciais
AULA 2
ROTEIRO 2
OBJETIVO:
Identificar a presença de proteases nos produtos comerciais para a lavagem de roupas. 
As enzimas nas máquinas de lavar roupas.
Nos produtos comerciais para a lavagem de roupas, as enzimas se encontram em 
proporção de 1% a 2%, às vezes ainda menor. No entanto, essa quantidade é considerada 
suficiente porque, sendo catalisadores, as enzimas se recuperam intactas ao finalizar a 
reação química que promovem. Seu papel é aproximar as moléculas, diminuindo a energia 
necessária para formar ou romper uma ligação química. 
Além de eficientes, as enzimas são específicas. Como um sistema de chave e fechadura, 
cada uma exerce sua ação sobre um substrato específico: as proteases atuam sobre as 
proteínas; as amilases, sobre o amido; as lipases, sobre gorduras e azeites; e as celulases, 
sobre a celulose. As enzimas são proteínas e, por conseguinte, biodegradáveis. 
As enzimas incluídas nos produtos para lavagem de roupas eliminam a necessidade de 
esfregar, um trabalho pesado e que desgasta as roupas. Contudo, é necessário deixar as 
peças de molho durante um tempo para facilitar a ação das enzimas. Estas hidrolisam as 
substâncias orgânicas específicas, fragmentando-as e facilitando sua remoção. 
Na lavagem de roupas, as enzimas utilizadas respondem a condições determinadas de 
temperatura (200 a 500 ºC) e pH (alcalino, entre 9 e 11). Evita-se, assim, o aquecimento 
da água para lavar a roupa, assegurando-se também a coexistência da enzima com o 
surfactante. 
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A remoção de manchas
As manchas podem ser constituídas por proteínas, amido e outros carboidratos, ácidos 
graxos e lipídios, sais inorgânicos, argila e pigmentos. 
As principais enzimas das máquinas de lavar roupas são as proteases e as amilases. Em 
geral, estas hidrolisam seus respectivos substratos quando os encontram na roupa, mas 
também eliminam as manchas por digestão das proteínas que as grudam ao tecido. 
Durante a lavagem, as lipases não eliminam mais do que a quarta parte das manchas 
específicas; porém, elas apresentam um efeito de tipo residual particularmente interessante. 
Adsorvidas pelos lipídios, as lipases não são eliminadas totalmente no enxágue. Além de 
continuar agindo durante a secagem, facilitam a remoção da mancha na lavagem seguinte. 
Também são incluídas celulases para remover as fibrilas que formam bolinhas 
desagradáveis no tecido, com o objetivo de melhorar o aspecto das roupas, suavizando-as 
ao tato e realçando suas cores.
ATIVIDADE PRÁTICA
Os produtos para lavagem de roupas comprados em armazéns e supermercados têm sua 
composição detalhada na embalagem. Nem todos levam enzimas. As proteases são enzimas 
que fragmentam as proteínas que pigmentam algumas manchas, facilitando sua remoção. 
Como identificar a presença de proteases em um produto? 
PROCEDIMENTOS:
1. Rotular os copos (controle, produto 1, produto 2, produto 3 e produto 4).
2. Preparar a gelatina conforme as instruções da embalagem. 
3. Distribuir quantidades iguais nos 5 copos e completar os passos 4, 5 e 6. 
4. Colocar 1 colher de água em um dos copos (controle) e misturar bem.
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5. Colocar 1 colher do primeiro produto no copo correspondente e misturar bem. 
6. Repetir o item anterior com os produtos restantes.
7. Depois de duas horas, colocar na geladeira, até que a gelatina do copo controle so-
lidifique. 
8. Observar se a gelatina solidificou ou não nos copos restantes.
9. Interpretar os resultados.
O procedimento não apresenta maiores dificuldades. Se a gelatina não solidificar, 
o produto contém proteases. Contudo, se a gelatina solidificar, o resultado pode ser 
considerado ambíguo: o produto não tem proteases ou simplesmente não conseguimos 
detectá-las (devido ao tempo insuficiente de incubação, por exemplo).
Como as proteases são as enzimas mais frequentes nos produtos para lavar roupas, é 
provável que algum deles forneça um resultado positivo. Um bom indício relativo à presença 
de proteases é o conselho, na embalagem, de evitar o uso do produto para lavar lã e seda. 
Dependendo do contexto, pode-se realizar essa atividade como um teste cego, 
identificando os produtos só quando finalizar a atividade.
MATERIAIS QUANTIDADE
Envelope de gelatina branca
5 copos e 5 colheres de plástico
1 colher de sopa de 4 produtos comerciais para lavagem de roupas
Água
1 pilot
OBS.: a quantidade a ser utilizada deverá ser discutida com o professor.
Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança:
As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com água corrente.
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Disciplina: Bioengenharia e 
Biotecnologia Aplicada à Biomedicina
Título da aula: Bioplásticos/plásticos de 
amido 
AULA 2
ROTEIRO 3
OBJETIVO:
Preparar um bioplástico a partir de amido e óleo vegetal.
A transformação de um polímero de origem biológica em bioplástico ocorre quando se 
altera sua estrutura com alguma substância dispersante. Nesta atividade, o óleo vegetal 
cumpre a função de agente dispersante do amido (polissacarídeo). 
PROCEDIMENTOS:
1. Misturar em um saco plástico 2 colheres de sopa de amido, 2 colheres de sopa de 
água e umas gotas de corante para alimentos. 
2. Acrescentar 4 ou 5 gotas de óleo vegetal no saco plástico e misturar muito bem o 
conteúdo.
3. Fechar o saco, deixando uma abertura na ponta.
4. Esquentar no micro-ondas por 30 ou 40 segundos.
5. Aguardar até a temperatura abaixar e distribuir em formas. 
6. Deixar secar a temperatura ambiente. 
7. Analisar algumas das características do bioplástico obtido (dureza, flexibilidade, de-
gradabilidade, por exemplo).
Controle: repetir o procedimento, substituindo, no item 2, o óleo vegetal por água.
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Trata-se de uma atividade muito simples que sempre tem sucesso. Na hora de retirar o saco 
plástico do forno micro-ondas, devem-se extremar os cuidados para evitar queimaduras. À 
medida que o plástico vai secando, perde a flexibilidade e, depois de um ou dois dias, fica 
rígido.
Comparar os bioplásticos obtidos com diferentes fontes: maisena, farinha de trigo, 
fécula de batata, fécula de mandioca etc.
Comparar os bioplásticos obtidos com diferentes dispersantes: óleo de soja, óleo de 
girassol, óleo de milho etc.
Modificar as proporções de maisena e óleo.
MATERIAIS QUANTIDADE
Maisena
Água
Óleo vegetal
Corante alimentar
Sacos plásticos
OBS.: a quantidade a ser utilizada deverá ser discutida com o professor.
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Forno de micro-ondas
Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança:
As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia, com águacorrente.