fluorimetria- 15032019

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FLUORIMETRIA
LA – 2019 - Oceanografia
Fluorimetria é uma técnica extremamente sensível, 
muito usada por químicos analíticos, bioquímicos e 
na área de clínica.
Para entender como ocorre o processo, é necessário 
lembrar que toda a vez que uma molécula absorve 
energia radiante, esta energia tende a ser dissipada 
na forma de calor, que é consumido via colisões.
Para cerca de 95% das moléculas, este é o processo 
de dissipar a energia.
No entanto, para certas moléculas (~5%), quando 
energias radiantes mais intensas (geralmente UV) 
ocorre um fenômeno adicional:
Parte da energia é perdida via colisões, outra parte 
excita os elétrons para níveis mais elevados, que ao 
retornar ao estado fundamental, vão emitir luz. 
LUMINESCÊNCIA
Emissão de fótons de estados eletrônicos excitados
UV e visível
fluorescência fosforescência
singleto  singleto tripleto  singleto
  10-8 s   10-3 - 100 s
Cromóforos - moléculas que absorvem luz
Fluoróforos - moléculas que fluorescem
Geralmente possuem elétrons delocalizados/duplas 
ligações/anéis
Na realidade, além da fluorescência, temos a 
fosforescência e a quimioluminescência, todos 
processos que ocorrem à baixa temperatura.
Fotoluminescência: Engloba a fluorescência e a 
fosforescência, cujos processos de excitação são 
similares (absorção de fótons) mas com 
decaimentos diferentes
Quimiluminescência: Emissão de luz gerada por 
uma reação química.
Fluorescência e fosforescência são processos de 
emissão de luz em baixas temperaturas. Nos dois 
processos, ocorre absorção de energia e sua 
reemissão em forma de luz visível.
Diferenças entre fluorescência e fosforescência:
Substâncias fluorescentes emitem luz durante o 
período que recebem luz. Cessando a chegada de 
luz, cessa o processo de emissão.
Substâncias fosforescentes emitem luz durante e 
depois de cessada a chegada de luz.
Vagalumes: Luz emitida, baseada em uma oxidação biológica. 
A reação química que ocorre envolve:
O2 + Luciferina + ATP, na presença da enzima luciferase Luz
Fluorescência, fosforescência e quimioluminescência são 
casos especiais de luminescência.
Ocorre sempre em baixas temperaturas.
Existe também a termoluminescência.
Na termoluminescência também há emissão de luz.
Só que neste caso, as temperaturas são bastante elevadas.
UM POUCO DE HISTÓRIA
Para entender como o processo de fluorescência ocorre, é 
importante considerar o diagrama abaixo:
- Neste diagrama, são representados os processos que ocorrem quando uma 
molécula é excitada e fluoresce.
- Moléculas expostas à luz (geralmente UV), recebem fótons, que 
promovem a transição de elétrons para níveis de energia superior. 
- A maior parte destes elétrons vão ser promovidos para os níveis S1 e S2 (há 
níveis superiores, mas são pouco significativos).
- Rapidamente ocorrem conversões internas e ao alcançar o nível S1 os 
elétrons retornam rapidamente (10-6 a 10-9 s), emitindo luz.
- Para algumas moléculas, pode ocorrer a reversão de spin, migrar para um 
estado menos energético (cruzamento intersistema).
- Nesta situação, o menor nível vibracional é atingido e a molécula pode 
retornar ao estado inicial, emitindo fótons mais lentamente
Que moléculas são capazes de fluorescer?
Moléculas com transição  * geram maior fluorescência.
Muitos hidrocarbonetos aromáticos não substituídos fluorescem 
em solução. Nestes, a eficiência quântica aumenta com o 
aumento do número de anéis e com o grau de condensação.
Heterocíclicos simples como piridina, furano, tiofeno e pirrol 
não fluorescem.
Exemplos de compostos onde ocorre fluorescência são 
quinolina, isoquinolina, indol e fluoresceína.
O que há 
de comum 
nestas 
moléculas?
COMPONENTES DE UM FLUORÍMETRO
FONTES DE RADIAÇÃO:
- Lâmpadas de mercúrio (mais comum para fluorímetros), 
- Lâmpadas de deutério, tungstênio e xenônio (espectrofluorímetros)
- Diodos emissores de luz (450-475nm) 
- Lasers 
SELETORES DE : 
- Filtros de absorção ou interferência 
- Monocromadores de rede 
CÉLULAS DE MEDIDA: 
- Cilíndricas/retangulares (podem ser de vidro, sílica ou quartzo) 
DETECTORES: 
- Fotomultiplicadoras
Aplicações:
Fluorimetria se destaca pela sua elevada sensibilidade. 
É muito comum que se alcance sensibilidades na faixa de 
ppb (partes por bilhão).
Outro aspecto que diferencia a fluorimetria é a elevada 
seletividade desta técnica.
Um analito, na presença de dezenas de outros pode ser 
distinguido, visto que raramente outra espécie tem 
espectro de excitação e de emissão coincidentes. 
Limitações:
Fluorimetria requer baixas concentrações para dar 
respostas lineares. [ ] requerem cuidados especiais: 
(evaporação, adsorção, instabilidade do analito, reação com traços de impurezas, com O2 dissolvido, etc)
Elevadas [ ], produzem desvio de linearidade (“self-adsorption”).
Determinadas espécies presentes na solução podem 
causar “quenching”. Estas espécies impedem que a 
fluorescência aconteça. (ex: I- é um quencher extremamente eficiente).
Substâncias coloridas podem também atuar como 
quenchers. 
Espectros de excitação e de emissão de uma determinada espécie
Aplicações:
Determinação de espécies inorgânicas
- Direta – Form. de complexos fluorescentes
- Indireta: Supressão da fluorescência
Determinação de espécies orgânicas
- Extratos de plantas, esteroides, vitaminas
Sensores óticos para determinar metais pesados
- Pode-se fazer uso da formação de complexos
- Pode ser explorada a supressão de fluorescência
Medição de oxigênio
- Sensores de oxigênio usando fibra ótica