ODONTOGENÉTICA- TED Manipulação e da análise do DNA

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♥ ODONTOGENÉTICA ♥
TED - Manipulação e da análise do DNA
1. Descreve detalhadamente:
a) Técnica do DNA recombinante para clonagem genética;
A tecnologia do DNA recombinante, ou também chamada de engenharia
genética, desenvolvida na década de 1970, é um conjunto de técnicas que
permite a manipulação do material genético, por meio de cortes e
recombinação de moléculas de DNA de diferentes origens. Nessa técnica,
inclui também processos que realizam a duplicação desse material em
grande quantidade, fazendo assim a clonagem gênica.
Etapas que ocorrem na tecnologia do DNA recombinante:
1° - Corte do DNA que se deseja
utilizar (chamado de exógeno ou de
inserto) do organismo doador,
utilizando nucleases de restrição
apropriadas para a sequência- alvo a
ser clonada.
2° - Fragmentos obtidos devem ser
inseridos em um vetor (um fragmento
de DNA aberto) pela enzima DNA
ligase, gerando o DNA recombinante.
3° - Vetor recombinado deve ser
então inserido em uma célula de
microrganismo, por meio de
mecanismos de transformação gênica.
4° - Célula transformada é colocada
em condições adequadas de crescimento e assim é clonada, passando a
expressar a proteína heteróloga.
Obs.: Tanto o vetor quanto o DNA exógeno devem ser tratados com a
mesma enzima de restrição para que possam ser recombinados pela
DNA ligase. A DNA ligase somente reconhece extremidades coesivas, e não
extremidades cegas
b)Técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR).
A Reação em Cadeia da Polimerase, polymerase chain reaction, (PCR) é
uma técnica capaz de gerar milhões ou bilhões de cópias de uma
determinada sequência de DNA. Essa técnica foi desenvolvida por Saiki e
colaborador, surgiu na década de 1980, e permitiu aos geneticistas obter
milhões de cópias de DNA com maior rapidez e precisão a partir de uma
quantidade muito pequena de amostra biológica.
A evolução da técnica de PCR permitiu, ainda, realizar exames de
diagnóstico de infecções por parasitas, como o vírus da imunodeficiência
humana (HIV).
A técnica de PCR permite
mimetizar a duplicação do
DNA em tubos de ensaio,
contendo diversos
elementos, em banho
 maria com temperaturas
controladas.
Um dos elementos
imprecindíiveis para
reação é a enzima
DNA polimerase, originada
da bactéria Thermus
aquaticus (Taq
polimerase), que
possibilitou a polimerização das novas cadeias de DNA, por se manter
estável em temperaturas elevadas, necessárias durante a reação.
A PCR ocorre em termocicladores e consiste em 30 a 40 ciclos, cada ciclo
dividido em três etapas diferentes de temperaturas.
- Para gerar uma nova cópia a partir da amostra de DNA utilizada, primeiro
a fita dupla deve ser aberta a uma temperatura em torno dos 94°C
(temperatura de desnaturação). A exposição das bases nitrogenadas
permite que as fitas simples sirvam de molde para sintetizar novas
moléculas.
- Em seguida, os oligonucleotídeos iniciadores (primers) se hibridizam
de maneira específica e complementar aos moldes na temperatura de
hibridização (em torno de 50 60°C), a qual é variável por depender de
características específicas do par de primers utilizado em cada reação.
- Na terceira e última etapa de cada ciclo da PCR, ocorre a polimerização
(extensão) da nova fita de DNA, quando a Taq polimerase reconhece e
se associa ao primer hibridizado e à fita molde e realiza a adição dos
nucleotídeos artificiais (desoxirribonucleotídeos – dNTPs)
complementares, a uma temperatura de 72°C.
- Após o término da polimerização, um novo ciclo é iniciado, sempre
nas mesmas condições de temperatura e tempo, até completar o número
de ciclos programados no termociclador.
Ao final de cada ciclo, como resultado, cada DNA molde formará uma nova
fita dupla, a qual servirá como molde no ciclo seguinte, amplificando a
reação em escala exponencial.