8ª Aula

Prévia do material em texto

•  Papel da hormona antidiurética e da AQ2 na reabsorção da água a nível renal. 
Diabetes insipidus nefrogénica e aquaporinas. Mercúrio como agente diurético. 
•  Utilização das energia de activação na discriminação entre transporte por difusão 
simples e transporte mediado por proteínas. 
Bibliografia 
•  Lodish H., Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., and Darnell J., Molecular Cell Biology (4ª 
Ed.), Freeman W.H. and Company (USA), Cap 15 (2000). 
•  Berg, Stryer, Tymoczko - Biochemistry (6th edition), Freeman W.H. and Company (USA), Cap 12 (2011). 
•  Nelson D.L., and Cox M.M., Lehninger – Principles of Biochemistry (4ª Ed.), Freeman W.H. and Company 
(USA), pp 406-408 (2005). 
•  Nelson D.L., and Cox M.M., Lehninger – Principles of Biochemistry (4ª Ed.), Freeman W.H. and Company 
(USA), pp 406-408 (2005). 
•  Shechter E., Biochimie et biophysique des membranes. Aspects structuraux et fonctionnels (2º Ed.), 
Masson,Paris, pp 155-157 (1997). 
Aquaporinas - descoberta 
- a existência de canais para água nas membranas foi prevista em 1957 
 por V.W. Sidel e A.K. Solomon 
 - a proteína responsável por esse transporte não tinha sido isolada 
 - Agre et al, 1987: Primeiro artigo sobre aquaporinas 
AQUAPORINAS 
•  O Prémio Nobel da Química de 2003 foi atribuído a um cientista 
norte-americano cuja investigação ajudou a esclarecer como a água 
é transportada através das biomembranas. 
•  A existência de canais específicos transportadores de água era 
apenas uma suspeita até meados dos anos 80. Em 1988 Peter Agre 
conseguiu isolar uma proteína da membrana plasmática com essas 
características – as AQUAPORINAS. 
Peter Agre 
Peter Agre Receives 2003 Nobel Prize in Chemistry 
RNA mensageiro 
de CHIP 28 
Ovócitos de Xenopus laevis Membrana de Oócito expressando 
a proteína CHIP 28 
CHIP 28 - Channel forming membrane integral protein of 28 kD 
Eritrócitos e células renais — (alta permeabilidade a H2O) 
Xenopus laevis 
- A permeabilidade à água dos ovócitos aumentou 100x 
- Proteína renomeada AQUAPORINA-1 (AQP1) 1ª 
Proteína envolvida — CHIP 28 
Oócitos de rã que não expressam aquaporina (em baixo – CONTROLO) 
Oócitos microinjectados com m-RNA de eritrócitos codificante de 
aquaporina (em cima). Incubação durante 2 dias para dar tempo a que a AQP seja 
expressa 
Os oócitos foram transferidos de uma solução salina isotónica para uma 
solução salina hipotónica 
A aquaporina é um canal aquoso – demonstração experimental 
Permeabilidade à água de ovócitos expressando AQP1 
  Injectou-se mRNA codificando AQP1, em ovócitos de Xenopus 
  Após a expressão da proteína diminuiu-se a osmolaridade do meio (solução. hipotónica) 
  Registou-se a velocidade de entumescimento em função do tempo 
  A cruz representa o momento da ruptura da célula 
  O entumescimento é menos nítido se os ovócitos forem incubados com HgCl2 
  A experiência controlo é realizada com ovócitos que não expressam AQP1 
Ovócitos de Xenopus laevis 
Outra experiência:
Permeabilidade à água de lipossomas e de proteolipossomas 
reconstituídos com AQP1 – Determinação da E (energia de activação) 
•  O transporte de água é induzido por um choque hiperosmótico 
 A permeabilidade foi determinada a partir da velocidade de contracção 
 dos lipossomas e dos proteolipossomas. 
 Velocidade inicial do transporte da água em função do inverso da 
 temperatura absoluta (T). O declive das rectas representa a 
 energia de activação. 
A
 B
A
B
Slope = -E/R 
Modelo Estrutural da Aquaporina: Proteína tetramérica 
composta por 4 subunidades idênticas. Cada subunidade 
forma um canal aquoso. 
Esquema da topologia de 1 subunidade relativamente à membrana 
3 pares de α-hélices transmembranares homólogas (A e A’; B e B’; C e C’) 
estão orientadas em sentidos opostos relativamente à membrana e estão 
ligados por 2 “loops” hidrofílicos contendo pequenas hélices não-
membranares. 
Na AQP1, 4 monómeros de Mr 28 000 formam cada um deles um canal aquoso com um 
diâmetro (≈3Å) que permite a passagem das moléculas numa única fila (5 x 108 moléculas/s). 
Características Estruturais da AQP1 
  Os “loops” que conectam os segmentos transmembranares (2 e 3) e (5 e 6) contêm vários 
aminoácidos altamente conservados e o motivo característico Asn-Pro-Ala (NPA). Os “loops” 
inclinam-se para o interior da cavidade formada por 6 α-hélices transmembranares 
encontrando-se no centro para fazer parte do canal selectivo a água. 
Vista lateral do poro numa subunidade da aquaporina (vêem-se várias 
moléculas de água). O canal contém resíduos de histidina (H) e arginina (R) 
(altamente conservados) e 2 resíduos de asparagina (N) (a azul), cujas 
cadeias laterais formam ligações de H com as H2O transportadas. As H2O 
transportadas também formam ligações de H com o grupo carbonilo de um 
resíduo de cisteína da cadeia principal.
A baixa energia de activação para a passagem da água através da AQP1 (∆G++< 15KJ/mol) 
sugere que a água se move através dos canais sob a forma de um fluxo contínuo. 
Canal de água numa subunidade de AQP1 
(a)  Restrição de tamanho. 8 Å acima do ponto médio do canal, o poro estreita-se para um diâmetro 
de 2,8 Å (aproximadamente o diâmetro de uma molécula de água). 
(b) Repulsão eletrostática. Resíduos conservados (R, Arg-195; H, His-180) na constrição mais 
estreita do poro, fornecem cargas positivas fixas que impedem a passagem de cátions, incluindo 
protões. 
(c) Reorientação do dípolo da água. Duas hélices parciais encontram-se no ponto médio do canal, 
fornecendo dípolos carregados positivamente que reorientam uma molécula de água quando 
passa por este ponto. Quebra de pontes de hidrogênio na fila unitária de moléculas de água 
impede a condutância a protões por “hop-turn” (salto-rotação).
Selectividade do canal para água: Três características do canal 
Moléculas de H2O são alinhadas pela interacção com as Asn nos locais de constrição. 
Quebra das ligações de H impede a condutância a H+ através do canal. 
AQUAPORINA – Canal para água 
A água é um dípolo eléctrico
Cadeias de Ligações de Hidrogénio (“cabo condutor” para H+) 
Mecanismo de Condução de H+ 
Improvável 
“Salto” e “Rotação” 
Esquema da transferência de H+ numa proteína (verde) através de um “fio condutor de protões”. O fio consiste 
de uma cadeia de ligações de hidrogénio de moléculas de água e de resíduos de aminoácidos ionizáveis. Um 
H+ entra a partir do topo e as setas azuis mostram a propagação da carga positiva através de “saltos” 
sequenciais através da cadeia. Em resultado, um H+ sai no fundo. Antes do próximo H+ ser transferido os 
componentes da cadeia devem “rodar” (setas vermelhas) para rearranjar a cadeia na sua configuração original. 
Esta representação é uma visão simplificada da situação real onde a cadeia pode não estar sempre presente 
(as moléculas de água podem reorienta-se para as posições correctas durante o processo). 
Estrutura do local de inibição do Hg++ (APQ1-Hg++). Representação de uma única 
molécula de H2O no ponto mais estreito do poro. Resíduos circundantes arginina-195 
(Arg) e histidina-180 (His) fornecem cargas positivas que repelem protões. Cisteína-189 
(Cys) é o local da inibição do mercúrio (Hg). Phe-56 e Glu-142 são outros resíduos 
importantes da região do poro.
Como se realiza o transporte de água 
 Aquaporina 1 - poro passivo - passagem água movida pelo gradiente osmótico 
 A água é selecionada pelo tamanho e pela carga eléctrica. 
 Íons não a atravessam por estarem hidratados 
Aquaporinas ocorrência: 
11 isoformas de Aquaporinas em mamíferos 
Bactérias Plantas Animais 
Aquaporinas não TransportamApenas Água
A família das AQUAPORINAS divide-se em : 
*Aquaporinas – Selecionam apenas água 
*Aquagliceroporinas - Água e Glicerol 
-  AQP 3 transporte de GLICEROL para o eritrócito 
-  AQP 7 tecido adiposo transporte de glicerol originado dos TAG 
-  AQP 9 captação de glicerol pelo fígado para formação de glicose 
Subtipos de AQPs de mamíferos expressos em células/tecidos específicos 
Água e solutos dos túbulos colectores movem para o interior do vaso sanguíneo (vasa recta) 
AQP2 - Localizada nos túbulos colectores renais 
nefrónio 
Diabetes insipidus nefrogénica: pode ser causada por mutação no gene que codifica AQP2 
A reacção de resíduos de cisteína com HgCl2 fecha os canais à água da AQP2 – Base da antiga utilização 
terapêutica do mercúrio como diurético (inibe a reabsorção da água filtrada pelo rim). 
ADH estimula a inserção da AQP2 na membrana plasmática da célula principal dos túbulos colectores 
AQP2
AQP4
nefrónio 
Concentração da urina regulada pela hormona ADH (hormona antidiurética) 
ADH estimula a inserção da AQP2 na membrana plasmática da célula 
principal dos túbulos colectores 
Diabetes insipidus nefrogénica: pode ser causada por mutação no gene que codifica AQP2 
A reacção de resíduos de cisteína com HgCl2 fecha os canais à água da AQP2 – Base 
da utilização terapapêutica passada do mercúrio como diurético (inibe a reabsorção da 
água filtrada pelo rim). 
AQP2 - Localizada nos túbulos colectores renais 
nefrónio 
AQP2 
  Participa nas etapas finais da concentração da urina nos ductos 
colectores. Em condições de diurese encontra-se em vesículas 
intracelulares. Por acção da vasopressina é exocitada para a membrana 
apical permitindo a reabsorcão da água do filtrado glomerular 
  Indivíduos com mutacões no gene de AQP2 sofrem de uma forma 
severa de Diabetes Nefrogénica Insípida e podem chegar a libertar até 
20 L de urina por dia. 
  A sobreexpressão de AQP2 poderá contribuir para estados de retenção 
de líquido encontrados em pacientes com insuficiência cardíaca ou 
grávidas. 
  membrana basolateral → permeável mesmo sem ADH → AQP3 e AQP4 
Neurohormonas do hipotálamo são armazenados na neurohipófise 
Hipófise (armazena as 
hormonas para as 
lançar posteriormente 
no sangue) 
As funções do NEFRÓNIO são vitais para a vida e são 
reguladas pelo sistema endócrino por hormonas, tais como a 
hormona anti-diurética e a hormona paratiróide. 
ENERGIA DE ACTIVAÇÃO
Difusão transmembranar de solutos
ENERGIA DE ACTIVAÇÃO 
As energias de activação calculadas para 
glicol, glicerol e eritritol correspondem às 
energias que se conhecem serem necessárias 
para a desidratação das moléculas. 
Para uma molécula se mover passivamente em resposta a um gradiente químico, a 
barreira energética mais importante reflecte provavelmente a necessidade da 
molécula perder a sua água de hidratação antes de passar através da barreira 
polar das cabeças dos fosfolípidos membranares. 
1 caloria = 4,184 Joules
Alterações de Energia Associadas à Passagem de um Soluto 
Hidrofílico Através da Bicamada Lipídica de uma Membrana Biológica 
(a)  Na difusão simples a remoção da camada de 
hidratação (solvatação) é altamente 
endergónica (∆G>0) e a energia de activação 
(∆G++) para a difusão através da bicamada é 
muito elevada; 
(b) A proteína transportadora reduz a ∆G++ para a 
difusão transmembranar do soluto visto este 
ter acesso a um meio hidrofílico favorável à 
sua passagem. 
A proteína transportadora forma interacções 
não-covalentes com o soluto desidratado 
para substituir as ligações de H com a água 
(a ∆Gligação< 0 equilibra a ∆Gdesidratação> 0) e 
fornece uma passagem transmembranar 
hidrofílica (via alternativa para atravessar a 
bicamada lipídica sem ter de interagir com o 
interior hidrofóbico membranar)