refrigeração de sêmen equino e Inseminação artificial em éguas

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Aula de Reprodução 2
Exame Andrológico:
Glândulas anexas e acessórias (estudar)
5° parte do exame 
Comportamento sexual – 
· Cortejo 
· Ereção 
· Protusão do pênis 
· Procura 
· Introdução 
· Ejaculação 
· Período refratário 
Colocar 2 ou mais vacas em estro com cada touro 
Anotar todas as manifestações do macho num período de 10 min 
Escores de 0 a 10 
Animais que já montaram, as avaliações devem ser mais críticas 
Animais cobrindo pela primeira vez, as avaliações de comportamento são mais brandas 
Frequência ótima de serviço depende:
- Condições físicas do reprodutor: nem debilitado e nem obeso 
- Qualidade seminal e reserva de sptz 
Depende da produção e eliminação diária de sptz 
Machos com boa qualidade de sêmen podem e devem ser usados maciçamente 
- Manejo reprodutivo 
Esperar 48 horas (período refratário) para uma nova coleta e saber ao certo a motilidade espermática.
Esporadicamente não tem problema coletar um dia seguido do outro, só não pode se tornar rotina. 
O touro mesmo já se organiza fisiologicamente para cobrir um dia sim e um dia não.
Animais mais velhos ou muito novos ou até que possuam um testículo menos desenvolvido podem ter um sêmen de menor qualidade, menor número de paletas. Podendo ser coletado um dia sim e dois não. 
Um touro cobre em média 30 a 34 vacas.
- Comportamento da estação de monta: baixa libido, mas não sptz
Por que se o período for feito da forma correta, o animal chega a um ponto que a libido dele começa a ficar normal (da uma diminuída)
- Comportamento individual.
- Espaço disponível.
Se o animal estiver em um pasto muito grande com pouca sombra por exemplo, você vai ver que esses touros não vão conseguir cobrir todas as vacas, por conta do excesso de calor, ou por conta do animal ter que andar de mais até chegar nas vacas. 
Ex: Touro nelore já é mais adaptado ao calor, já o gado europeu vai sofrer mais para conseguir cobrir todas as vacas. 
Na coleta de sêmen é do mesmo jeito, quando o animal está em um ambiente onde não tem uma vaca para ele cobrir esse estímulo sexual cai, já quando a fêmea tá do lado ele tem um estimulo maior, produzindo uma maior quantidade de ejaculado.
- Estímulo sexual presentes 
 
6° etapa 
Espermograma 
· Avaliação do reprodutor 
· Colheita do sêmen 
· Analise do sêmen 
Avaliação do reprodutor 
· Qualidade zootécnica 
· Sanidade geral 
· Sanidade reprodutiva 
· Sanidade genética 
Métodos de colheita de sêmen 
A) Massagem das ampolas dos ductos deferentes e das glândulas vesiculares (glândulas acessórias)
Sêmen não sai com boa qualidade 
B) Coleta manual 
Usado em suínos e cães 
Pode ser feito c/ presença de fêmea ou manequim 
Cuidado com choque térmico – Média da temperatura do recipiente de coleta é de 37 graus 
C) Eletroejaculação: ruminantes e silvestres 
-Indução artificial do reflexo de ereção e ejaculação 
- Centros controlares – região sacral da medula 
- Sêmen geralmente é mais diluído 
- Não necessariamente de condicionamento
 
D) Vagina artificial: ruminantes e equinos 
- Sêmen de melhor qualidade 
- Presença da fêmea ou manequim 
- Pouca variação das condições naturais 
- Permite controle de choques térmicos 
- Permite o melhor controle de contaminação 
O sêmen do cachorro a fresco deve ser usado em até 2 horas no máximo, e se for resfriado pode durar até 48 horas. 
48 a 50°C é a temperatura usada na água que vai dentro da vagina artificial de coleta de equinos.
Preparação do laboratório:
Deixar tudo pronto para a recepção do sêmen. 
Lavagem do pênis:
Esperar o animal chegar próximo da égua para ele expor o pênis e facilitar a lavagem 
Sempre que for lavar é da base do pênis para traz, por último lavar a glande com uma toalhinha limpa. 
Lavar com água morna.
Secar com algodão ou toalhinha. 
Nunca esquecer de pôr a peia na égua para evitar que ela der coice no cavalo na hora da monta, e cachimbo. 
Manipulação no laboratório:
1° tirar a camisinha e avaliar a cor do sêmen para identificar se tem urina, sangue, pus ou sujeiras. 
2° filtrar o sêmen para uma maior pureza desse sêmen e descartar o gel na hora da filtragem. 
3° colocar o sêmen no bequer 
4° o volume se mede na proveta (graduada de 1 em 1) ou na balancinha 1ml = 1g de sêmen.
5° tirar a amostra para fazer a contagem dos sptz e também tirar uma amostra para avaliar a motilidade espermática. 
6° diluir o sêmen o mais rápido possível para proteger os espermatozoides dos efeitos deletérios que o próprio plasma seminal causa nos sptz. 
7° a diluição é feita de 1:1 para proteger os sptz por até 1hr enquanto é feita a análise.
Análise Física:
- Aspecto 
- Volume 
Varia Inter e intra-espécie 
Aumento de volume = fêmea em estro; eletroejaculador; contaminação com água ou urina 
Diminuição de volume = animais jovens; uso excessivo; vesiculite (+ comuns em touros e garanhões).
Touro (5 a 7ml); Garanhão (30 a 100ml); Varrão/suíno (200 a 300ml); Carneiro e bode (0,5 a 1,5 ml); cão (2 a 8ml).
- Motilidade (total e progressiva)
% de sptz moveis 
Uma gota de sêmen em aumento de 100 a 400X
Para doação de sêmen (que acabou de ser coletado): >70%
Para sêmen congelado: >50%
- Concentração espermática 
Varia com fatores intrínsecos e extrínsecos (ex: método de coleta) espectrofotômetro, contador eletrônico (sperm conter) ou câmara de Neubauer
[] normal média de sptz/ml 
Bovinos (1 bilhão); Suínos (100 milhões); Equinos (120 milhões); Cão (300 milhões); Carneiro e Bode (3 bilhões).
Câmara de Neubauer – espelhada 
Tem 25 quadrados e cada quadrado dos 25 tem outros quadrados. 
Desses 25 é necessário contar 5 na diagonal ou um em cada lateral e um no meio. 
Depois faz a fórmula. 
[]=______n_______ []=sptz/mm³
 1x 1 x 5 x 1
10mm 25mm² 20 
A diluição padrão é 1:20 (1 gota de sêmen: 19 gotas de água) p/ equinos, suínos e cães
Para bovinos a diluição é de 1:100 (e ai multiplica o cálculo por 5)
1:200 é a diluição para Ovinos e Caprinos (e aí multiplica o resultado por 10)
Contas que irão cair na prova (pode trazer calculadora) 
- Vigor 
Vitalidade do movimento do sptz 
Escala de 0-5 (ideal >3)
- Turbilhonamento 
Formação de ondas em uma gota de sêmen relaciona-se com concentração, motilidade e vigor, com escala de 0-5 (ideal >3). Análise em M.O. em 100x (é na objetiva de 10x)
Não é desclassificatório, utilizamos somente em ruminantes. 
Concentração X Volume é = ao total de SPTZ por ejaculado. 
Aula 2:
Características morfológicas 
O sêmen com motilidade nem sempre é um sêmen bom, pois a motilidade significa que ele está vivo, mas não quer dizer que eles têm ou não defeitos, e quanto mais defeitos, menor o potencial de fertilidade. 
Ascendente = pais 
Descendentes = filhos 
Pode ser feita com a lâmina de preparação húmida (que precisa de um microscópio com a luz de contraste de fase) é uma lâmina muito boa e da maior visibilidade, a luz facilita ver os contrates e os detalhes. (DIC- microscópio de contraste de interferência diferencial) um microscópio top, porém custa uma média de 15 mil reais. 
E pode ser feito por esfregaço corado (coloração) que pode ser analisado pelo microscópio convencional, o único defeito dessa técnica é que tem algumas patologias que não é possível de visualizar porque o corante acaba impedindo a visualização desses pequenos detalhes.
Quando é feita a análise de morfologia:
1° é feita com a objetiva de 100 
2° é feita com a objetiva de 1000 
Formas de contar:
 Ou 
Quando visualizamos os defeitos, precisamos identificar qual a origem desses defeitos, para poder entender como tentar tratar.
Eles podem ser:
1° Primários (na produção dos testículos), 2° secundários (que são problemas provindos de uma epididimite, ou seja, defeitos que não são dos testículos, são do epidídimo para frente) ou 3° Terciários (patologias causadas durante a manipulação desse sêmen)
 Depois de visualizar é separado os defeitos maiores (que impedem os espermatozoides de serem férteis ou fertilizar) os defeitos menores (defeitos que não interferem na hora de fertilizar, ou seja, pouco prejudiciais).
Como estamos calculados os defeitos, sempre o espermatozoidetiver mais de um defeito, nós só vamos contar 1 defeito, que no caso seria o defeito maior. 
No equino não é considerado defeito quando o espermatozoide tem uma implantação de calda abaxial (quando a calda não fica no centro da cabeça, fina na lateral)
É considerado normal quando tem até 30% de defeitos totais e no máximo 20% de defeitos maiores. 
· 30% de defeitos totais = 20% defeitos maiores e 10%defeito menores = aceito 
· 30% = 30% de defeitos menores= aceito 
· 30% = 30% de defeitos maiores = não aceito 
Quando for avaliar um sêmen congelado esses limites de defeitos são maiores, ou seja, até 10% a mais de defeitos. 
· Degeneração testicular: maior defeito encontrado nos animais, devido ao estresse térmico.
· 1° - Queda na concentração espermática e na uma queda leve na motilidade 
· 2°- Aumento de gota citoplasmática (proximal e distal) e um aumento de patologias. 
Quando o espermatozoide chega no epidídimo, ele já chega com a gota citoplasmática e essa gota é eliminada na passagem pelo epidídimo 
Quando a gota é proximal, o defeito é na espermatogênese, essa gota fica aderida e isso significa um defeito nos testículos. 
Quando o animal tem uma disfunção no epidídimo: ele tem alta concentração espermática, motilidade bem baixa que varia de 5 a 10 % no máximo, e isso é importante de avaliar porque significa que esses espermatozoides morreram durante a passagem pelo epidídimo. Alto percentual de defeitos de calda que também são bem presentes e calda citoplasmática distal, porque esses espermatozoides não conseguem eliminar a gota. 
Análise de integridade de espermatozoides é importante: por ser um teste mais completo onde é avaliado a funcionalidade das peças do espermatozoide. (teste de fluorescência). 
Aula3:
Biotecnicas de refrigeração de sêmen – 
Dia 29 – provinha valendo 2 pontos e aula prática 
Dia 05 – prova p1
O sêmen pode ser usado de 3 maneiras 
· O sêmen fresco – usado no máximo em uma hora, pois logo após esse período os espermatozoides começam a morrer (dura 48 horas dentro do útero da égua)
· O sêmen refrigerado – depois de coletar e avaliar, ele é diluído e refrigerado a 15G° (dura até 24 horas) ou a 5G° (dura até 48 horas). (Dura até 24 horas dentro do útero da vaca)
· O sêmen congelado – depois de coletar e avaliar, se dilui em meios de congelamento e em seguida ele é refrigerado para ser congelado em botijões com nitrogênio. (dura de 6 a 12 horas dentro do útero da fêmea).
Passo a passo do refrigeramento: 
1°- Preparar o laboratório 
2°- Aquecer a vagina artificial 
3°- Preparar o pênis do animal, higienizar com água morna dentro de um balde até chegar a 30 e poucos graus, você vai umedecer um algodão ou paninho que não esfarela para poder limpar bem, vindo da base e indo descendo. A glande é onde se deve ter mais cuidado, o ideal é pegar uma toalhinha limpa só para higienizar a glande. Depois que estiver bem higienizado você deve secar bem para evitar o contato da água com os espermatozoides. 
4°- Efetuar a coleta 
5°- Voltar com o sêmen para o laboratório para avaliar o aspecto, e em seguida filtrar o sêmen, parar retirar a fração gel e deixar somente o ejaculado. 
6°- Separar a dose de 1:20 em um ependorf com 19 gotinhas de água e 1 gotinha de sêmen, que é a amostra para a contagem e avaliação. 
7°- Diluir o sêmen com um meio de diluição 1:1 (dura até 1 hora em T° ambiente) para evitar que os espermatozoides sofram com o plasma, pq o próprio plasma começa a ser deletério parar os espermatozoides. Sempre tomar cuidado com o choque osmótico, que pode ser evitado colocando o diluente em frações e ir misturando com o sêmen aos poucos, para não danificar eles. 
8°- Em seguida é montada a câmara de Neubauer e esperar pelo menos 3 min, para avaliar a concentração, para eles poderem descerem e decantarem. 
9°- Depois de avaliar a motilidade e vigor, ai vai colocar a câmara de Neubauer e contar a concentração, ai fazer o esqueminha que ele deu na ultima aula, e ai vai pegar o número total de espermatozoides. 
Cálculos: 
Ex:
O animal ejaculou 
50ml 
Ai foi contato 100 x 10 a 6° sptz / ml (100 milhões por ml).
Motilidade de 80%
Sptz moveis totais: 50 x 100 x 0,80 = 4.000 x 10 a 6°
Número de doses: 4.000 x 10 a 6° = 4 doses (12,5 ml cada)
 1000 x 10 a 6° 
A dose mínima inseminante é de 1.000 x 10 a 6° sptz moveis 
A primeira regra da refrigeração é que a diluição mínima é de 1:2 ou seja uma parte de sêmen para 2 de diluente. 
Para cada 10°G de redução na temperatura, o metabolismo celular é reduzido em 50% 
Todo sêmen refrigerado quando vai ser avaliado ele precisa ser aquecido a 37 graus para saber qual é a verdadeira motilidade e vigor dos espermatozoides. 
O cálculo da diluição: 
De 25 a 50 x 10 ao 6° / ML
Ex: 
100x10 a 6° sptz/ml 
100 / 25 = 4 partes (3 partes de diluente e 1 parte de sêmen)
100 / 33,3 = 3 partes (2 partes de diluente e 1 parte de sêmen)
Componentes dos diluentes:
· Leite em pó desnatado: proteção da membrana 
· Acucares: fonte de energia e crioproteção 
· Bicabornato: ajusta o PH
· Antibióticos: inibe o crescimento bacteriano 
Sempre que centrifugar o sêmen vai ressuspender ele em 100 milhões por ml 
Condicionamento:
1- O sêmen deve ser acondicionado em tubos plásticos apropriados 
2- O material deve estar sempre identificado com:
a. Nome do garanhão 
b. Data e hora da colheita 
c. Concentração/ML ou total de SPTZ
d. Volume total 
e. Motilidade, vigor 
f. Diluição (se for centrifugado, escrever que foi centrifugado) (se não foi, deve colocar a conta da diluição, tipo 3:1 ou 2:1)
Quando colocar o sêmen na bisnaguinha, você vai espremer ela até sair todo o ar (a vácuo), para não espumar e não pegar reação do ar nos SPTZ.
Como minimizar os danos aos SPTZ?
1- Manipulação correta do sêmen 
2- Diluição o mais rápido possível 
a. Para minimizar efeitos deletérios do plasma seminal 
3- Diluir o sêmen corretamente
a. O diluidor protege o sêmen durante a queda da temperatura 
4- Taxa de refrigeração adequada 
a. Evitar curvas de refrigeração rápidas 
b. Evitar oscilação de temperatura 
Sempre que eu mandar o sêmen com dois gelos eu devo por duas garrafinhas de água e uma de sêmen para evitar uma queda muito brusca da temperatura do sêmen 
Estudos em evolução relacionados a refrigeração de sêmen:
Adequar protocolo para a raça mangalarga e garanhão de outras raças que refrigeram mal 
· Retirada do plasma seminal 
· Diluentes com estimulantes de motilidade 
· Curvas de refrigeração 
· Efeito da suplementação com ômega3 e L-CARNITINA (resultados visíveis somente após 60 dias).
Análise do sêmen refrigerado 
· Ao receber o sêmen há que homogeneizá-lo 
Revisão – Patologias espermáticas 
1°- Os gametas sofrem transformações estruturais durante a espermatogênese que ocorre no parênquima testicular. 
2°- Sofrem transformações bioquímicas durante o trânsito no epidídimo, para ter maturidade e habilidade de alcançar o ovócito e participar do processo de fecundação. 
 = Se ocorrer algum problema no processo de transformação devido ao mau funcionamento do epidídimo ou do parênquima testicular, pode acabar prejudicando a competência funcional dos espermatozoides devido a anormalidades morfológicas na cabeça, no núcleo e no flagelo. 
SPTZ saem do ejaculado > Maduros > Cromatina completamente condensada > Membrana acrossomal íntegra e sem deformação > Peça intermediaria sem danos > Flagelo livre de gota citoplasmática. 
Quando chegam na cabeça do epidídimo > SPTZ com gota citoplasmática proximal (junto a inserção da cabeça) começam a perder essa estrutura > A Gota migra para a região distal do flagelo.
Ainda na passagem pelo epidídimo > Pode ocorrer a diminuição do tamanho do acrossoma > Modificações no flagelo dos SPTZ.