Relatório - HPLC Laís Ricette 201637514-9

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Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro 
IC 636 – Cromatografia 
Docente Rosane Nora Castro 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório: 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Discente Laís Ricette da Silva 
Matrícula 201637514-9 
 
 
 
 
Seropédica - RJ 
21 de julho de 2022 
Aula ministrada pelo aluno de doutorado Lucas Pires, onde o mesmo fez uma demonstração de 
HPLC, instrumental. Observamos dois tipos de escala, a semi-preparativa e a analítica. Onde o 
na escala semi-preparativa, tem por objetivo isolar e/ou caracterizar substâncias de capacidade 
de até 1mL de injeção. E na escala analítica, tem por objetivo analisar substâncias de capacidade 
de 50 microlitros. 
Partes do aparelho de HPLC: 
Unidade de comunicação (CBM) - responsável pelos dados, comunica o software (que gera o 
cromatograma) com o aparelho de HPLC. 
Coluna - diferenças na Espessura da coluna indicara a escala, se a mesma é analítica ou 
preparativa. O comprimento é basicamente o mesmo, porém coluna semi-preparativa 
apresenta uma largura maior se comparado com a coluna analítica. Pode-se concluir então que 
a coluna semi-preparativa apresenta uma maior quantidade de fase estacionária se comparado 
com a coluna analítica. E é isso que define o aumento da capacidade da coluna, colunas maiores 
conseguem separar misturas de substancias em escalas maiores. 
Na escala analítica observamos a coluna inserida dentro do aparelho de HPLC, em um forno, 
devido ao comportamento físico-químico de algumas amostras, que podem possuir diferentes 
coeficientes de solubilidade e com a variação na temperatura levaria a cristalização o que 
ocasionaria a perda da mesma. 
 Coluna na escala analitica, dentro do forno. 
Já a coluna na escala semi-preparativa se encontra fora do aparelho, em temperatura ambiente. 
 
 Coluna da escala semi-preparativa 
Bomba de alto pressão - e a espessura da coluna está intimamente relacionada com a 
capacidade da bomba, ou seja, o trabalho que a bomba exerce para puxar o solvente e fazer a 
eluição também será diferente. Colunas maiores apresentam um fluxo maior e com isso um 
maior volume para levar ao preenchimento da coluna, sendo assim a bomba exercera uma força 
maior se comparado com uma bomba de uma coluna menor. 
 Bomba de Alto pressão. 
Unidade de injeção automática - injetor automático, o aparelho faz tudo. 
 Injetor automático 
Injetor manual - injeção fixa que depende da capacidade do loop, ou seja, o loop precisa ter o 
volume suficiente para conseguir comportar a amostra. 
Modo loud – a amostra se encontra no loop, sem estar em contato com a fase móvel. 
Modo injet – ocorre a troca das válvulas, a amostra entra em contato com a fase móvel e é 
arrastada para dentro da coluna. 
Detectores - trabalha diretamente com o tipo de amostra com que está se analisando e o 
objetivo da análise. No caso do HBPL do laboratório é de UV. 
Que se apresenta em dois tipos de detecção – Arranjo de fótons de iodos e ultravioleta fixo. 
Ultravioleta fixo, dizer para o mesmo o comprimento de onda que será analisado. Não é capaz 
de detectar todos os comprimentos de ondas possíveis. 
Arranjo de fótons - Policromador – recebe a luz, fraciona a mesma em diferentes espectros e a 
substancia a ser analisada vai absorver um ou mais espectros de luz. Levando a uma diferença 
de absorção, que o software é capaz de traduzir. 
O interessante do HPLC que foi observado durante a demonstração é que o mesmo é capaz de 
acoplar detectores de outras naturezas juntamente com o de UV, como por exemplo detectores 
de índice de refração, de massa. 
Solventes – puros, de natureza espectroscópica, utilizado para limpar a coluna. O mesmo é 
utilizado antes e depois de se utilizar o HPLC. Pois qualquer traço, impurezas, é capaz de alterar 
o resultado visto se tratar de um processo bastante sensível. 
A HPLC que foi observada é de Fase reversa, sendo assim a mistura de solventes utilizados é de 
solventes orgânicos polares como Metanol, THF, Acetonitrila, Alcool isopropílico e solventes 
aquosos. 
 Frascos de Solventes 
 
 
 
 
 
Filtros para solventes - de dois tipos diferentes, filtro de nylon/celulose para solventes orgânicos 
e filtro aquoso que são de polímero HAWP. 
Unidade de filtração: contendo uma placa porosa 
(filtro),insere o filtro escolhido de acordo com o solvente e embaixo temos a unidade de 
armazenamento. E depois de filtrado, preenche os frascos de solventes que se encontram em 
cima do HPLC. A capacidade de filtragem da placa porosa é limitada. 
 Filtros 
Cuidados: empacotamento definitivo, ou seja, se ocorre algum problema com a coluna a mesma 
precisa ser descartável não possuindo mais utilidade. À medida que se vai usando a coluna a 
mesma vai perdendo a resolução, perdendo sua fase estacionária. Vida útil limitada. Sendo 
assim os cuidados com a coluna são de extrema importância. A escolha do solvente a ser 
utilizado também, de acordo com a fase (normal ou reversa). 
Tudo que é feito no HPLC passa por uma etapa da cromatografia clássica, ou seja, CCDA por 
exemplo. 
 Analise Analítica 
 Analise semi-preparativa 
 
Exemplos de Cromatogramas – analises estas realizadas no laboratório: 
Um mesmo software comporta uma quantidade significativa de aparelhos conectados, 
permitindo a analise simultaneamente de quatro analises. 
Acompanha em tempo real da amostra isolada na escala preparativa e analisa a mesma na 
escala analítica (pureza, separação). 
 
Cromatogramas preparativos apresentam picos mais largos/mais robustos e maiores. 
 Cromatogramas analíticos apresentam os picos 
mais finos, menores e compridos. 
Essa diferença nos picos se dá pela capacidade de amostra que a coluna comporta. A altura e a 
largura do pico são proporcionais a concentração da amostra que está sendo injetada/ 
analisada.