DIVERSIDADE MICROBIANA B

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DISCIPLINA: SISTEMÁTICA E BIOLOGIA DE MICRO-ORGANISMOS
AULA: ESTUDO DA DIVERSIDADE DIVERSIDADE MICROBIANA.
Prof. Dr. Ilio Fealho de Carvalho
SECRETARIA DE ESTADO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA
UNIVERSIDADE DO ESTADO DE MATO GROSSO
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE TANGARÁ DA SERRA
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Diversidade Microbiana 
Definição:
A diversidade biológica, ou biodiversidade, refere-se à variedade de vida no
planeta Terra.
 Inclui:
 a variedade genética dentro das populações e espécies;
 a variedade de funções ecológicas desempenhadas pelos organismos nos
ecossistemas;
 e a variedade de comunidades, habitats e ecossistemas formadas pelos
organismos ;
Existem: três níveis de diversidade:
 a genética,
 a de espécies e
 a de ecossistemas.
A biodiversidade refere-se tanto ao número (riqueza) de diferentes categorias
biológicas quanto à abundância relativa (constância) dessas categorias.
Esta inclui:
 a variabilidade ao nível local (alfa diversidade),
 a complementaridade biológica entre habitats (beta diversidade)
 e a variabilidade entre paisagens (gama diversidade).
Diversidade Microbiana 
Análise ecológica de um habitat natural 
Tem o objetivo:
 determinar quais e quantos micro-organismos estão presentes;
 Requer: a identificação,
 A classificação e a enumeração desses seres.
A identificação de suas atividades individuais:
 requer o conhecimento das fontes de carbono e energia,
 produtos metabólicos,
 habitats de crescimento e
 reprodução dos organismos.
As atividades são conduzidas de modo a obter uma medida quantitativa do
complexo inteiro, assim como seus componentes individuais.
Coleta
Antes de realizar a coleta:
 Deve-se determinar o local e as condições de coleta,
 Assim como o substrato para isolamento dos micro-organismos
 A melhor metodologia a ser utilizada (métodos dependentes de
cultivo ou independentes de cultivo).
 Deve-se também verificar o “n” amostral necessário para estudos de
diversidade com micro-organismos.
 Caso possível, os micro-organismos de- vem ser depositados em
Coleções de Culturas e identificados.
Métodos utilizados na ecologia microbiana:
Análises dependentes de cultivo:
1- Enriquecimento e isolamento em cultura pura
2- Análise de características fenotípicas
Análises independentes de cultivo (molecular)
1- Viabilidade e quantificação - técnicas de coloração
2- Corantes genéticos
3- PCR - associação de genes específicos a micro-organismos específicos.
Medida das atividades microbianas
1- Respiração,
2- ATP,
3- produção de calor,
4- atividade enzimática;
e outros.
Figura 1. O esquema evidencia os métodos utilizados no estudo da diversidade microbiana de 
um habitat. 
Taxonomia
A taxonomia é a área da microbiologia que estuda a classificação
(agrupamento em taxa), a nomenclatura (espécie, gênero ou família) e a
identificação dos organismos.
Características usadas na classificação
1- Fenotípicas:
inclui características:
morfológicas,
estruturais
e metabólicas.
http://portaldoprofessor.mec.gov.br/storage/discovirtual/galerias/imagem/0000000092/
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Genotípicas:
tem o objetivo de determinar o grau de parentesco entre as
moléculas de DNA das amostras em classificação.
Características usadas na classificação
Taxonomia polifásica
A taxonomia bacteriana clássica tradicionalmente empregava análises fenotípicas
como base para classificação.
A filogenia de procariotos apenas emergiu após análises genotípicas.
A taxonomia atual não é mais baseada somente em critérios fisiológicos, mas sim
em uma combinação de critérios fenotípicos e genotípicos.
Taxonomia filogenética
Algumas macromoléculas celulares correspondem a cronômetros
evolutivos, como por exemplo o RNA ribossomal, cuja sequência molecular
pode ser empregada como medida comparativa da divergência evolutiva.
A distância evolutiva entre dois organismos pode ser medida:
pelas diferenças encontradas nas sequências de nucleotídeos ou
aminoácidos dos monômeros de macromoléculas homólogas deles isoladas.
O número de diferenças encontradas na sequência de uma molécula é
proporcional ao número de mutações estáveis, fixadas no DNA de um
micro-organismo.
Estudos filogenéticos requerem a seleção de moléculas corretas para
sequenciamento.
Taxonomia filogenética
Características do cronômetro evolutivo
Regiões 16S e 23S rRNA:
Os RNA ribossomais são moléculas com sequências conservadas ao longo de
gerações.
Possuem tamanho ideal em relação a confiabilidade e custo (cerca de 1500 pb) e
o grau de similaridade entre as sequências de rRNA de dois organismos indica
sua relação evolutiva relativa.
Requer análises comparativas das sequências por meio de análises
computacionais de sequências alinhadas e construção de árvores filogenéticas
(fig. 2) com indicação do posicionamento evolutivo mais provável dos organismos,
uns em relação aos outros.
Figura 2. Árvore filogenética universal, determinada pelo seqüenciamento comparativo de rRNA. 
Métodos fenotípicos 
Caracteriza-se os produtos da expressão gênica para a diferenciação das
cepas.
Em decorrência de envolverem a expressão do gene, estas propriedades podem
variar devido alterações das condições de crescimento e mutações
espontâneas.
A utilização de métodos fenotípicos possui algumas desvantagens:
 Os procedimentos podem ser longos e ambíguos e os resultados podem ser
afetados pelas condições do meio.
 Problemas técnicos que dificultam a interpretação dos resultados (pouco
crescimento; presença de substâncias instáveis nos meios de cultura, etc.)
podem acontecer.
 Culturas mistas também não permitem a diferenciação de espécies e a
quantidade de micro-organismos pode ser subestimada (100 a 1000 vezes
menor quando comparado à preparação microscópica).
Técnica de enriquecimento
Na natureza os organismos estão dispostos em comunidades.
Os ecologistas microbianos tiveram que desenvolver métodos e procedimentos
para isolar e cultivar os micro-organismos de seu interesse.
Para uma cultura de enriquecimento são escolhidos um meio e um conjunto
de condições de incubação que sejam seletivos para o micro-organismo
desejado.
As culturas de enriquecimento reproduzem da maneira mais fiel possível os
recursos e condições de um nicho particular.
Numa cultura de enriquecimento típica, o organismo mais adaptado ao conjunto
de condições selecionadas torna-se dominante.
Entretanto, o micro-organismo selecionado em cultura pode ser um componente
de menor importância no ecossistema.
Quando uma diluição seriada é utilizada antes do enriquecimento um micro-
organismo diferente é selecionado.
Acredita-se que a diluição elimina a presença de espécies “indesejadas”, dando
oportunidade ao desenvolvimento de outros membros da comunidade microbiana.
Essa técnica tem sido bastante utilizada.
Técnica de enriquecimento
Exemplo de cultura de enriquecimento:
é a coluna de Winogradsky,
utilizada para o isolamento de bactérias púrpuras ou verdes fototróficas,
redutoras de sulfato e outros organismos anaeróbicos.
Corresponde a uma miniatura de um ecossistema anóxico e pode ser utilizada
como uma fonte duradoura de bactérias.
É uma coluna preenchida por lodo e recoberta com água, que imita um lago,
onde várias bactérias se desenvolvem durante vários meses.
O lodo é suplementado com carbonato de cálcio e sulfato de cálcio, que atuam
como tampões.
As colunas são utilizadas no enriquecimento de vários procariotos, tanto
aeróbios
Técnica de enriquecimento
Figura 3. Diluição seriada do substrato do qual se deseja isolar o microrganismo. Acredita-se que a diluição dê oportunidadeao
desenvolvimento de outros membros da comunidade microbiana. Após a diluição a cultura é inoculada em um meio de enriquecimento.
Isolamento em cultura pura
Semeadura por esgotamento
A semeadura por esgotamento é uma técnica rápida e simples.
Consiste em semeaduras repetidas de uma colônia isolada a partir da coleta até a
obtenção de uma cultura pura.
Figura 4. Semeadura por esgotamento. Uma colônia isolada deve ser inoculada em um meio de cultura e, a partir dela, devem ser
realizadas estrias por toda a placa. O processo deve ser repetido até que uma cultura pura seja obtida 
Proteínas e anticorpos fluorescentes como marcadores celular
A utilização de anticorpos fluorescentes permite a identificação e rastreamento de
um micro-organismo específico em um ambiente complexo.
Esse tipo de estudo é mais adequado para micro-organismos de importância
clínica.
A utilização de proteínas com um marcador celular fluorescente verde torna
possível realizar o rastreamento de células introduzidas em um ambiente.
Isso é possível quando um gene codificador de uma proteína fluorescente
verde (GFV) é inserido numa bactéria, que fica verde quando o gene é expresso,
quando observada em um microscópio de luz ultravioleta.
Essas células marcadas podem ser introduzidas em um ambiente e
acompanhadas com a microscopia, possibilitando o estudo in situ dos micro-
organismos.
Na microscopia, células muito pequenas podem não ser percebidas
.
Além disso, há uma grande dificuldade em diferenciar células vivas de células
mortas e de materiais inanimados;
A morfologia não permite avaliar a diversidade genética.
Limitações da microscopia
Métodos genotípicos
Identifica-se por meio do genoma, ao contrário dos métodos biológicos e
imunológicos, que são fenotípicos e detectam os produtos codificados pelo
genoma.
Ácidos nucléicos são universais em biologia celular, e a sequência de bases de
nucleotídeos das moléculas não são influenciadas pelas condições de cultivo.
A análise dos ácidos nucléicos é a base dos métodos de identificação por meio
de técnicas de biologia molecular, e possuem a vantagem da reprodutibilidade.
Os métodos genotípicos são mais promissores para uma rápida e acurada
identificação.
Como isolar e identificar fungos endofíticos
Coleta e isolamento
O isolamento dos fungos endofíticos ocorre a partir do interior de tecidos e órgãos
sadios,.
Deve ser feita também uma desinfecção da superfície do fragmento da planta para
eliminar os epifíticos.
O local da coleta, o N amostral, número de indivíduos e a parte da planta a ser
coletada devem ser cuidadosamente planejados.
Cuidados para a correta identificação da espécie vegetal a ser coletada e da
localização precisa desta também devem ser tomados.
Os dados do GPS (localização) e da época(s) de coleta (estação seca, chuvosa)
devem ser anotados.
.
Fig. 3 – Hifas de fungos emergindo das partes internas de um pecíolo de Anibia roseadora Ducke
Fonte :Tiago. Lab Microb.
Como isolar e identificar fungos endofíticos
Folhas, caules e raízes devem ser limpos superficialmente com detergente neutro,
água e enxaguados com água destilada em abundância.
Os fragmentos devem ser mergulhados em álcool a 70% por 1 minuto, depois em
hipoclorito de sódio 2% por 3 minutos e, finalmente, em água destilada por 2
minutos.
Em seguida os fragmentos devem ser transferidos para placas de Petri contendo
meio ágar batata (BDA) suplementado com o antibiótico cloranfenicol.
As placas devem ser incubação a 28º C, por até 60 dias e os isolados transferidos
para placas com meio BDA para purificação
Como isolar e identificar fungos endofíticos
1 - Metodologia clássica
a) Leveduras: para a identificação das espécies de leveduras isoladas é testada a
capacidade de crescimento (assimilação) em meios com diferentes fontes
de carbono e nitrogênio (“réplicas”), Yarrow (1998).
Chaves taxonômicas, Kurtzman & Fell (1998) são utilizadas.
b) Fungos filamentosos: para a identificação dos fungos filamentosos é feito um
microcultivo para observação de estruturas reprodutivas e características
morfológicas.
Chaves taxonômicas também são utilizadas.
Para o microcultivo é necessário utilizar meios adequados que favoreçam a
esporulação.
Identificação de fungos endofíticos
Identificação de fungos endofíticos
Figura 6. Exemplo de teste de assimilação de diferentes 
fontes de carbono e nitrogênio utilizada na identificação 
das leveduras.
Figura 7. Microcultivo – técnica utilizada na 
identificação dos fungos filamentosos.
Um isolado de cada fungo com morfotipo distinto é selecionado e submetido ao
sequenciamento das regiões ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA.
A região transcrita interna (ITS) é uma região não codificadora, que, portanto,
sofre menos pressão seletiva, e tem sido muito utilizada para fins de filogenia
por ser conservada entre espécies e com baixas variações dentro de um
mesmo gênero.
Seu sequenciamento é indicado para diferenciar espécies.
Os iniciadores (primers) comumente utilizados são o ITS1
(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e o ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC).
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Técnicas de Biologia Molecular
Leveduras com perfis fisiológicos e bioquímicos idênticos podem ser
agrupadas e, posteriormente, um exemplar de cada grupo é submetido ao
sequenciamento da região D1/D2 da subunidade maior do DNA ribossomal
Os iniciadores normalmente utilizados no PCR são o NL-1 - 5’-
GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’ e o NL-4 - 5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-
3’.
Geralmente é observada uma maior diversidade em ambientes tropicais e não
impactados.
Técnicas de Biologia Molecular