Qualificação 08 08 22

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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI
Programa de Pós-Graduação em Tecnologia, Ambiente e Sociedade
 Tadeu Ferreira Braga Junior
 
 
 
 
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Efeito do extrato aquoso e de inibidores de Proteases da Sterculia estriata na modulação da resposta antitumoral in vitro e in vivo em modelo murino de câncer de mama
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Teófilo Otoni
2022
Tadeu Ferreira Braga Junior
 
  
  
  
 
Efeito do extrato aquoso e de inibidores de Proteases da Sterculia estriata na modulação da resposta antitumoral in vitro e in vivo em modelo murino de câncer de mama
 
 
 
 
Qualificação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Tecnologia, Ambiente e Sociedade da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri – Campus Mucuri, como requisito para obtenção de título de Mestre em Recursos Naturais e ambiente (Imunologia e Bioquímica de compostos bioativos).
 
 
Orientador: Profª. Drª. Alessandra de Paula Carli.
Coorientador: Prof. Dr. Caio César de Souza Alves.
 
 
 
 
 
Teófilo Otoni-MG
2022
COLABORADORES s
UFVJM
Alessandra de Paula Carli
Caio César de Souza Alves
Samuel Galvão Barbosa
Beatriz Joia Tabai
Sandra Bertelli Ribeiro de Castro
Gracimério
Jander
Tiago
Mariana Stella Santiago Maia 
UFMG
Paulo Gaio Leite
Fabiana Simão Machado
Orgãos financiadores 
UFVJM
 
AGRADECIMENTOS
A Deus! 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
1. rpmi - 
LISTA DE FIGURAS 
RESUMO
 
O câncer está entre as 4 principais causas de morte no mundo, com estimativa de 1,7 milhões de mulheres diagnosticadas no mundo. Sua manifestação pode ser relacionada ao crescimento desordenado de células nas glândulas mamárias. Os avanços na terapêutica tem resultado na cura das pacientes e redução nas taxas de mortalidade, porém dada à dificuldade do manejo de pacientes com câncer de mama em estadiamento avançado e os tumores triplo-negativos, pesquisas com novos alvos terapêuticos devem ser conduzidas. O estudo de plantas medicinais vem sendo cada vez mais difundido no meio científico na procura de possíveis alvos para fármacos; e, destaca-se, o uso das mesmas como medida preventiva. Devido aos efeitos seletivos encontrados na subfamília Sterculiaceae, o estudo do potencial antineoplásico da espécie Sterculia striata (amendoim-de-macaco), se faz necessário. Assim, o presente estudo propõe avaliar a ação do extrato aquoso Sterculia striata (EASs) e do extrato rico em inibidores de proteases da Sterculia striata (IPSs) em modelo in vivo de câncer de mama. Para isso, serão utilizados camundongos fêmeas BALB/c, de 8 semanas de idade, nas quais será induzido o modelo de câncer de mama e, posteriormente, receberão os tratamentos. Os          animais serão mantidos no biotério da FAMMUC em gaiolas plásticas e acesso, ad libitum, a água e a ração. Para a indução do câncer de mama, serão inoculados de forma subcutânea (s.c.), na almofada de gordura mamária, 1x104 células de adenocarcinoma mamário 4T1 ressuspendidas em 50 μL de RPMI. Os animais controle serão inoculados no mesmo local com 50 μL de solução RPMI. Os animais serão divididos em grupos e receberão tratamento diário, por gavagem, com PBS ou 100, 200 ou 300 mg/kg de EASs ou de IPSs. Após 10 dias da inoculação, serão realizadas as medições do tamanho tumoral, com auxílio de paquímetro, em intervalos de dois dias. No 29º dia após a inoculação os animais serão eutanasiados para coleta de materiais para estudo.
 
Palavras chave: Câncer. Mama. Sterculia striata. Antitumoral. Extrato.
 
ABSTRACT
SUMÁRIO
 
1 Introdução 2
2. Referencial Teórico
2.1 Câncer 	2
2.2 Câncer de Mama 3
2.3  Plantas Medicinais 3
2.4 Inibidores de Proteases 4
2.5 Sterculia striata 5
2.6 Caracterização Química 6
2.7 Carotenoide Licopeno 6
2.8 Flavonoide 7
3. Objetivos 7
3.1 Objetivos Gerais 7
3.2 Objetivos específicos 7
4. Justificativa       8
5. Materiais e Metodos 9
5.1 Coleta do Material 9
5.2 Extração Aguosa 9
5.3 Extração do IP 9
5.4 Ensaio in vitro 10
5.5 Ensaio in vivo 11
5.6 Experimento com Câncer de mama 11
6. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO	13
REFERÊNCIAS  	14
1.	Introdução
 
O câncer está entre as 4 principais causas de morte no mundo, reconhecido como a segunda mais incidente. Essa patologia em nosso país, indica diferentes tipos e formas (BRAY et al., 2018). A replicação celular em mulheres causou mais de 630 mil mortes (WHO 2020). O câncer de mama é característico da glândula e desperta a atenção, devido a sua alta taxa de mortes entre mulheres. Em 2018, ocorreram 2,1 milhões de casos novos de mulheres diagnosticadas no mundo, o equivalente a 11,6% de todos os cânceres estimados. Sua manifestação está relacionada ao crescimento desordenado de células nas glândulas mamárias (INCA 2019). Quando estas células invadem o tecido, observamos o começo de uma metástase. Existem cerca de 100 especialidades de câncer catalogadas pela organização mundial da saúde da OMS. Este estudo prioriza a divisão celular desordenada de células no câncer de mama. Na glândula mamária encontram-se células sem controle de cisão celular que podem invadir glândulas mamárias ocorrendo um câncer chamado adenocarcinoma. Este tipo de câncer está associado à metástase de câncer que fluem para glândulas e tecidos. Apesar dos avanços na prevenção e tratamento, o mesmo ainda apresenta alta taxa de crescimento, podendo dobrar esses números até 2040 (WHO 2020). O tratamento para o câncer de mama depende do estágio do tumor e do tipo de células envolvidas, sendo o câncer de células triplo-negativas o de pior prognóstico e de mais difícil tratamento, mas, independente do tipo, todo o tratamento traz efeitos adversos que podem ser de curta ou longa duração, aumentando inclusive a morbidade e mortalidade das pacientes (BERGIN e LOI 2019; CASTANEDA e STRASSER 2017; ODLE 2014). Nesse contexto, as pesquisas na área oncológica tornam-se essenciais para melhor compreender aspectos patofisiológicos desse conjunto de doenças, no intuito de prevenir novos casos, bem como o tratamento desses pacientes. Sendo assim, esse trabalho se situa no contexto dos estudos envolvendo o câncer, sistema imune, capacidades fitoterápicas dos princípios medicinais sequencialmente retirados do potencial presente na Sterculia striata.Recentes estudos têm demonstrado o potencial do uso de plantas medicinais, e produtos derivados, para o terapêutica do câncer de mama (BUJA et al 2020; SINHA et al 2016), porém ainda são necessários inúmeros estudos para comprovar a eficácia. Alguns estudos, in vitro e in vivo, vêm demonstrando resultados promissores da família Sterculiacea/Malvaceae no tratamento do câncer (FORMIGA 2016; MONTE et al 2014; NGUYEN et al 2019; SILVA et al. 2017; SUN et al. 2018), mas ainda não existem dados sobre o efeito da Sterculia striata, principalmente na terapêutica contra o câncer de mama. Para tal, foram utilizados tumores mamários inoculados na mama de camundongos Balb/c por indução de células da linhagem 4T1. Esse grupo celular pertencente às 4 sublinhagens crescentes em tecido murino são derivados do tumor 410.4, (Pulaski and Ostrand-Rosenberg, 2000). O modelo desperta grande interesse por assemelha-se ao desenvolvimento de tumores ocorridos em seres humanos. Com o aumento do perfil epidemiológico de cânceres cada vez mais agressivos (triplonegativo) que requer um tratamento depreciativo, necessita-se de tratamentos cada vez menos hostis, acarretando interesses ligados à fitoterapia, por ser natural. O aproveitamento das plantas medicinais como ferramenta para este estudo desencadeou uma busca incansável rica em bons resultados que avalia o seu potencial de aplicação no câncer, e assim sequencialmente pretende-se acender a chama de curiosos que buscam melhores resultados satisfatórios para diversas doenças ligadas a esta linha. Listar ou descobrir compostos naturais que há muito não foram divulgados por ancestrais ou culturas antigas, que venha retomar ou provocar o amadurecimentona produção da ciência para o século XXI (Costa 2014 e Associação Brasileira de Fitoterapia – ABFIT). Plantas medicinais apresentam princípios ativos que podem provocar inibições em células cancerosas. Diminuir o ritmo de células com agente cancerígeno trás com sigo tempo de vida e estudo, para ganhar vantagens mapeadas nesta luta. Na espécie Amendoim de Macaco (Sterculia striata), acredita-se que ela possui efeitos citotóxicos seletivos e atividade anticâncer significativa nas células cancerosas que ainda podem ser investigadas com cautela. 
 
2. Referencial Teórico
2.1 Câncer
Conhecida por ser um desordem profunda que ocorre no crescimento de células que compartilham esse efeito simultâneo ( Robbins 2010). Tais alterações que ocorrem no genoma, levam a uma ocorrência de progressão celular ocasionada por sequências de mutações identificados nos genes de determinadas sequências celulares (DeVita 2015). Essa doença é conhecida como divisão celular sem controle ou células desordenadas que invadem diferentes tecidos. Existem mais de 100 diferentes tipos de câncer diagnosticados e que podem se espalhar para outros órgãos segundo INCA (2019).	
O levantamento feito pela ONU (Organização da Nações Unidas) que administra a OMS ( Organização mundial da Saúde) indica que haverá uma aumento na taxa da população com câncer não por ser uma doença transmissível, mais por ser crônica, onde se faz necessário procedimentos preventivos e novos métodos evitáveis (BRAY et al., 2018).
 
2,2 Câncer de Mama
 	O câncer de mama por sua vez é reconhecido pelo INCA como crescimento desordenado de células nas glândulas mamárias (INCA 2019). Qualquer mulher é passível de apresentar esta doença em diferentes estágios por ser de origem desconhecida. Em casos raros homens também apresentam essa patologia. Outro fator é que fica mais difícil de tratar por ser diagnosticada tardiamente (INCA 2019). Segundo Zevallos (2020) o câncer de mama apresenta estágios agressivos que podem está relacionado com a desordem dos hormônios, receptores de progesterona, estrógenos e a proteína HER2 nas regiões das glândulas.
 
2.2.1 Sintomas e Prevenção
 
Alguns sinais podem ser percebidos pelo corpo através de nódulos próximos às glândulas mamárias. Esse caroço pode ser fixo ou indolor, o que geralmente pode aparecer nas axilas ou próximo ao pescoço. Outros sintomas são manchas vermelhas na pele e alterações como grãos ou líquidos espontâneos saindo dos mamilos.  Ficar atento às mudanças do corpo, textura da pele, secreções com sangue e observar pequenas alterações, são maneiras importantes para se notar modificações peculiares no corpo.
 
Diagnóstico e Detecção
 
Sinais no corpo podem ser percebidos ao visualizar e reconhecer modificações no próprio corpo desde os primeiros anos.  Treinamentos de grupos de apoio, capacitam e facilitam identificar e reconhecer sinais no corpo que são encontrados através do conhecimento adquirido. A OMS sugere a mamografia, entre outros exames, que auxilia mulheres a reconhecer as alterações em seu corpo com antecedência. Caso for detectado no corpo algum caroço ou corpo estranho, não significa sempre ser um câncer. Exames mais profundos sobre a coleta do material, são primordiais para evitar o estresse e ansiedade desnecessária. O diagnóstico com antecedência contribui para um tratamento menos agressivo que pode levar a uma diminuição significativa do câncer.
 
Tratamentos
 
Com a evolução da ciência, muitas terapêuticas surgiram na última década. De acordo com o diagnóstico prescrito pelo especialista responsável e com estágio da doença será elaborado um quadro de propostas, usando tratamentos sistêmicos e locais. Ao passar dos anos surgem novos tratamentos ligados a cirurgia, radioterapia, quimioterapia, hormonioterapia e terapia biológica (terapia alvo). Com avanço da fitoterapia ao passar dos anos, uso natural de compostos menos nocivos.
 
2.3  Plantas Medicinais
 
Alguns conceitos de grandes representantes da ciência em nosso planeta como a Organização Mundial da Saúde (OMS) define como planta medicinal "todo e qualquer vegetal que possui um ou mais órgãos vegetais, (flores, caules, frutos, raízes ou folhas), substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semisintéticos" (OMS, 1998). Os componentes presentes em uma planta medicinal podem atuar no organismo indicando respostas que favoreçam as ações imunológicas. (Garlet 2009).
Plantas são continuamente alvos para fármacos brasileiros. Seus compostos podem ser extraídos e usados para uma boa avaliação ao auxílio medicinal (ITOKAIAS 2008). Muitas substâncias bioativas são retiradas de plantas medicinais para diversas atividades fitoterápicas como anti-inflamatórios, anti tumorais , analgésicos entre outros diferentes  efeitos  sobre mediadores de preparações para cada parte das plantas. (DEVIENNE et al., 2004).
Algumas formas no uso das plantas medicinais podem ser de forma externa ou interna. A ingestão geralmente é por meio de chás ou xaropes. O meio tópico geralmente é usado na pele ou nas mucosas das cavidades naturais. Grandes exemplos como a maceração, cataplasma, tintura entre outros são formas de aplicar ao corpo de forma natural. Avalia-se outros métodos que separam apenas o componente específico encontrado na planta como os princípios ativos. (Garlet 2009).
Os princípios ativos são substâncias químicas presentes em ervas medicinais que provocam reações nos organismos. Essa composição química é um resultado da transformação da luz, gases e nutrientes retirados e produzidos pela vegetação que extrai nutrientes do solo e elabora várias produções de princípios ativos (Garlet 2009).
Assim, a área da ciência que estuda esses componentes medicinais nas plantas é chamada de fitoterapia. Este campo está à procura de descobertas  para sempre evoluir e atingir os princípios de uma investigação farmacológica, que ainda não foi desvendada por meio de uma pesquisa científica. Geralmente para uma ação contra fatores patológicos (Garlet 2009).
 
2.4            Inibidores de Proteases (IP) 
Inibidores de protease estão relacionados a proteínas encontradas em plantas, microrganismos e animais capazes de formar complexos com enzimas proteolíticas, promovendo a inibição da atividade dessas proteases, podendo variar de tamanho (CÁMPANO et al. 2013). Os inibidores de proteases podem ser classificados em dois grandes grupos: os inibidores de baixo peso molecular e os inibidores peptídicos com uma ou mais cadeias polipeptídicas, sendo que os de ocorrência natural são majoritariamente polipeptídeos. Esses grupos também podem ser classificados de acordo com o tipo de protease que inibem, por exemplo: inibidores de serino, cisteíno, aspártico, treonino e metaloproteases (COLARES, 2016).
Existem muitos inibidores de proteases de plantas de uso medicinal que podem auxiliar e servir de subsídio no combate a processos fisiológicos ou patológicos. Essa extração serve de recurso terapêutico para a população. O câncer é uma proliferação celular patológica que pode ser inibido por proteases extraídas das plantas medicinais (CARLI 1999).
  	Algumas plantas cultivadas popularmente na região mineira são utilizadas como fitoterápicos. Muitos mineiros utilizam seu potencial ativo para o combate a diversas patologias. Existem diversos métodos de extração de seus inibidores. O método utilizado por plantas medicinais como coadjuvante no tratamento de patologias apresenta um bom exemplo de extração de inibidores de plantas medicinais (GUARNEIRE 2018).
  	A aplicação de plantas medicinais necessita ser observado alguns critérios , como a identificação da espécie pois existem muitas espécies  parecidas e que podem ser confundidas com a espécie real do estudo devido a sua indicação no quadro clínico e  os cuidados com a preparação adequada das proteases (Garlet 2009).
 
2.5            Sterculia striata
 
A Sterculia striata é uma planta arbórea, cuja a indicação de Silva (2001), sugere popularmente ser conhecida como, xixá, chichá do cerrado,amendoim-de-macaco, castanha-de-macaco, mendubi-guaçu, castanheiro-do-mato, arachachá, pau-rei e pertence à família Malvaceae (Silva 2001). Essa árvore pode ser encontrada em diferentes regiões brasileiras como Região Centro-Oeste e nos Estados do Maranhão, Bahia, Piauí, Minas Gerais, São Paulo, Pará e Tocantins (Brasil 2015).
Sua origem é por meio da amazônia, caatinga, cerrado e mata atlântica. Conhecida por ser uma espécie com potencial para o mercado de nozes, devido ao seu baixo teor de gorduras em comparação a outras nozes e pode ser indicada como um meio “light” para o consumo (Embrapa 2018). Essas sementes são consumidas por populações locais de formas torradas, cruas e cozidas. Indígenas conhecidos como “etnia norte-americana Kofán” utilizam seu extrato para erupções cutâneas (Brasil 2015). 
Um dos seus principais constituintes químicos são os licopenos e o princípio ativo flavonoide (Rocha 2013).  Segundo Moritz (2006), carotenoide licopeno é considerado um agente que auxilia no combate ao câncer. Sendo um precursor a esta investigação. O teor de antocianina, óleos, vitamina C são constituintes químicos que podem contribuir para os dados farmacológicos presentes na espécie em estudo (Rocha 2013). Outros componentes foram determinados, os ácidos graxos, os esteróis e os álcoois triterpênicos (Chaves 2004).
 
2.6   Caracterização Química  
 
São substâncias conhecidas como princípios ativos, extraído das plantas para uso medicinal, podem ser chamados de compostos químicos secundários, sintetizados pelas plantas, por meio da água, luz, nutrientes entre outros processos. Oferecem efeitos químicos ou biológicos sobre as reações para o organismo. Nem todos os princípios ativos foram analisados ainda, por isso alguns ainda podem ser examinados para um resultado satisfatório. Desde que não apresenta efeitos tóxicos graves (Garlet 2019). Existem vários princípios ativos que merecem ser investigados como:
 
2.7  Carotenoide Licopeno
 
Carotenóides é um grupo de pigmentos encontrados na natureza. Facilmente encontrado nas plantas algas, bactérias, fungos e na dieta e plasma de seres humanos (Faure 1999).  Existem cerca de 600 carotenóides pigmentados na natureza e 25 tipos encontrados no plasma de seres humanos (Khachik 2002). Investigações relacionadas a ação dos carotenóides, ao longo dos anos vem gradativamente aumentando devido a sua capacidade de ser um agente quimiopreventivo (Sendão 2004).
Os carotenóides complementam os pigmentos na fotossíntese e na fotoproteção devido a sua estrutura conjugada de polieno que absorve a luz através desta molécula. Alguns grupos são reconhecidos com hidrocarboneto (caroteno) e outros chamados de xantofilas, que são grupos funcionais oxigenados (WILLIS e WIANS, 2003).
 O Licopeno é um carotenóide cíclico que contém 11 ligações duplas conjugadas, 2 ligações não conjugadas, arranjadas linearmente em sua composição química. Pertence a família do betacaroteno. Encontra-se no grupo dos carotenóides constituídos de carbono e hidrogênio (Moritz 2006). Possui a habilidade de capturar radicais livres e contém a capacidade sequestrante do oxigênio (Shami 2004).
 
2.8  Flavonoides
 
É um componente presente em plantas medicinais, que em sua maioria são plantas que apresentam flores (Kandaswami  2007) . Sua  estrutura química consiste em 15 carbonos organizados em dois anéis aromáticos, ligados por uma cadeia de três carbonos (Garlet 2019). Algumas enzimas de transdução, parecem ser candidatas promissoras como agentes anticâncer (Kandaswami  2007).
Alguns mecanismos de ação dos flavonoides,  incluindo inativação de carcinógenos, antiproliferação, parada do ciclo celular, indução de apoptose e diferenciação, inibição da angiogênese, antioxidação e reversão da multirresistência ou uma combinação desses mecanismos são indicados em alguns estudos (Rew 2003).
 
Células 4T1
 	Células 4T1 são conhecidas por pertencer as 4 sublinhagens crescentes em tecido de camundongos derivadas do tumor 410.4. (Pulaski and Ostrand-Rosenberg, 2000). Fred Miller e seus colaboradores foram um dos primeiros cientistas a começarem a isolar e incentivar o uso destas células em camundongos BALB/c ainda na década de 80. (Dexter et al., 1978; Miller, F.R., Miller B.E., Heppner, G.H., 1983; Miller,F.R., 1983). Observou-se tumores altamente invasivos, causando metástases a partir do tumor primário em diversos tecidos e orgãos. (Pulaski and Ostrand-Rosenberg, 2000). Ao passar dos anos varias pesquisa começaram a adotar esta proposta de células em suas pesquisas por serem um modelo experimental animal adequado como modelo do câncer de mama ( Gonçalves 2019) . 
A linhagem de células 4T1 é um modelo murino (pertence a camundongos) comum de ser usado para estudar mecanismos que desenvolvem carcinoma de mama celular tumoral transplantável, sendo utilizado em hospedeiro de linhagem correspondente, denominado transplante singênico. Sendo um meio indicado de se cultivar. Reconhecido por ser um método de cultivo que se assemelha ao estágio avançado próximo ao que ocorre em humanos e  por também apresentar metástases (Gonçalves 2019). Seu uso é recomendável e vem aumentando nos últimos anos pela grande propensão celular em diferentes sítios no corpo dos camundongos Balc/c (CAFFARO, 2016). Sendo indicada para serem injetadas de forma orto topicamente no tecido subcutâneo mamário (Zhang Et. Al 2018).    Células da linhagem 4T1 são altamente tumor gênicas e invasivas, causando metástases a partir do tumor primário em diversos tecidos, incluindo linfonodos, sangue, figado, pulmões, cérebro e ossos (Pulaski and Ostrand-Rosenberg, 2000 e Gongalves 2019).
 	Essa linhagem se origina de um processo espontâneo de tumorigênese, descartando modelos celulares com DNA modificado o que facilita uma pesquisa pré-clínica. Podem ser facilmente transplantadas em glândula mamária o que mimetiza o crescimento tumoral experimental em humanos, apresenta uma progressão espontânea de metástase e se espalham nos linfonodos e demais órgãos, semelhante as neoplasias ao que ocorre em seres humanos. (Pulaski and Ostrand-Rosenberg, 2000 e Gonçalves, 2019).
  
3       Objetivos
 
OBJETIVO GERAL
 
Analisar o efeito do extrato aquoso da Sterculia striata e do extrato rico em inibidores de proteases da Sterculia striata na modulação da resposta antitumoral em modelo de câncer de mama.
 
Objetivos específicos
 
·   teste in vitro     
 Induzir modelo de câncer de mama com células 4T1 em camundongos BALB/c;
	histologia
 identificar, comparar e confirmar
 das neoplasias e análise dos órgãos para a detecção de possíveis metástases ou reduções do volume celular.
citometria
 Avaliar a atividade imunomoduladora dos extratos na resposta antitumoral.
Quantificar os mediadores da resposta celular observado.
 
4       Materiais e Métodos
 
4.1 Coleta do Material
 
A Sterculia striata foi coletada no ano de 2020 e 2021, na zona rural da cidade de Berilo – MG no vale de Jequitinhonha.  Partes da espécie foram separadas como a para o uso específico deste estudo.  Os instrumentos de coleta foram tesoura de poda, facão e podão. As amostras (sementes e casca) coletadas foram lavadas e submetidas à secagem em estufa a uma temperatura média de 40°C por 02 horas conforme técnicas sugestivas por Fonseca (1984) e Monteiro e Siani (2009).
Foram realizadas análises morfológicas da planta, com auxílio de materiais como lupas, pinças, agulhas histológicas, e ainda, comparadas com exsicatas de coleções virtuais botânicas brasileiras e mundiais (Herbário Virtual Reflora (2018), New York Botanical Garden (2018) e o Royal Botanical Gardens Kew (2018). Em seguida, a identificação foi realizada pelo Herbário Dendrológico Jeanine Felfili e a espécie foi depositada sob  número de registro e o material cadastrado no SisGen sob número de registro. ligar no herbário.
 
4.2 Preparações do extrato aquoso de Sterculia striata 
Após o processo de secagem e identificação da espécie, as cascas e as sementes da Stercilia striata foram trituradas e moídas em liquidificador industrial.Pesou-se 200g do material e diluiu em 400ml de água destilada, homogeneizando-os e mantendo em recipiente fechado por 48h. Foram filtrados em bomba de vácuo e acondicionados em freezer em temperatura de -80°C por 24 horas. Em seguida, foram liofilizados por 48 horas e recondicionados em freezer a -80°C Figura 5. A obtenção do extrato foi obtida conforme orientações de Gomes e colaboradores (2016).
Figura: Esquema representativo da preparação do extrato de aquoso de Sterculia striata
colocar suas fotos
Fonte: tadeu
4.Preparação do extrato enriquecido com inibidores de protease da Sterculia striata
Para realizar a detecção e extração de inibidores de proteases, baseou-se no trabalho de Gomes e colaboradores (2016). As cascas e sementes da planta foram selecionadas e trituradas em liquidificador. As proteínas foram extraídas, acrescentando-se 10% p/v de etanol a 60%, aquecidos à 55°C com agitação constante por 1 hora. Após este período, o material foi filtrado em gaze, e acidificado à pH 5,3. O filtrado foi precipitado por dois volumes de acetona, em seguida centrifugou-se a 4600 x g por 30 minutos, desprezou-se o sobrenadante e o precipitado resultante foi ressuspendido em 10 ml de água destilada e armazenado à – 80°C. Posteriormente, o material foi liofilizado e armazenado em freezer-20.
Figura: Esquema da Preparação do extrato enriquecido com inibidores de protease de Sterculia striata 
Fonte: tadeu fundo branco e caixa preta
Inibidor de protease usado 
1 Trituração com 600 ml de álcool 
2 Aquecimento à 55º C por 1 hora 
3 Filtração 
4 Acidificação com PH 5.3
5 Precipitado por dois volumes de acetona 
6 resfriado por 24hs em caixa de gelo
7 Centrifugar com 3.640 RPM por 30 min ( descartar o sobrenadante e armazenar o precipitado a 80º C
8 Liofilizar 
9 Calcular as doses finais para cada camundongo 
Fazer o protocolo anexo 2
4.1.3 Preparação dos extratos para os testes in vitro
 
4.4 Ensaio in vitro
Os macrófagos foram cultivados por 06 horas (citocinas) e 48 horas (NO) na presença ou ausência do extrato aquoso nas concentrações de 200, 50 e 10 µg/mL ou IP nas concentrações de 100, 10 e 1 µg/mL e estimulados com LPS (1µg/mL) e IFN-γ (0.9 ng/mL). Após os períodos de incubação, os sobrenadantes serão coletados para posterior análise. Para controle, as seguintes culturas serão realizadas: células estimuladas sem os tratamentos, células não estimuladas na presença dos tratamentos e células não estimuladas na presença de DMSO.
Células MDA e MCF-7 (2x105 células/mL) foram cultivados em placas de 96 poços em RPMI-1640 suplementado com 2mM L-glutamina, 100 µg/mL de antibiótico (estreptomicina e penicilina), 5% de soro fetal bovino, mantido a 37 °C em 5% de CO2.
Para análise de citotoxicidade foi realizado o teste do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil tetrazolium – MTT.  As células MDA e MCF-7  serão plaqueadas na concentração de 2 x 105 células/mL em placas de 96 poços. Serão incubadas por 48 horas e 72 horas em estufa de 5% de CO2 a 37ºC na presença dos extratos da Sterculia striata nas concentrações de 200, 50 e 10 µg/mL. Em seguida, foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos e retirado o sobrenadante. Será adicionado 100 μL de RPMI-suplementado e 10µL (5 mg/mL) de solução de MTT em cada poço e incubadas por mais 4 horas. As placas serão novamente centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos e o sobrenadante gentilmente retirado. O precipitado será então diluído em 100 μL de DMSO e a absorbância será lida a 560 nm. A citotoxicidade (%) será obtida pela fórmula 100-((X1/X2)*100), considerando X1 e X2 a média da OD (560nm) nos poços de células tratadas e células não tratadas, respectivamente. Foi determinado por regressão não linear a concentração inibitória média (IC50) e os pertinentes intervalos de confiança (IC95%).
4.5  Preparação  de células 4T1
 
O descongelamento das células 4T1 (seguiu o protocolo do anexo 2) contidas no crio tubo, foram retiradas da câmara de nitrogênio a - 196 °C e levadas para o fluxo laminar esterilizado. Sequencialmente foi enriquecida com 1 ml de RPMI suplementado e realocado para um tubo falcon com 20ml de RPMI e levado para centrifugação por 10 min a 5ºC por 12 000 RPM (seguindo o protocolo do anexo 3). O sobrenadante foi descartado e o pélete diluído em 1 ml RPMI suplementado e transferido para uma garrafa com 50 ml de RPMI suplementado. Posteriormente, armazenado a uma câmara de 37° C de gás carbônico por 95% em 48 hs.  
 As células de adenocarcinoma mamário 4T1, gentilmente fornecidas pela Profª Fabiana Simão Machado e o Doutorando Paulo Gaio Leite (Laboratório de Imunologia- UFMG). A alíquota da linha celular de câncer de mama murino 4T1, armazenada 80ºC, foi descongelada em banho maria a 37ºC por 1min. O conteúdo do tubo adicionado a uma garrafa de cultura, com RPMI (1X) suplementado de soro bovino fetal, em concentração de 10%, 1% de penicilina-estreptomicina. No dia seguinte, o meio de cultura da garrafa foi trocado, e após isso a manutenção destas células ocorreu a cada dois dias  em um fluxo laminar. Para a troca do meio de cultura das garrafas foram  feitas 2 lavagens com RPMI utilizando uma pipeta de 10ml. O meio é então descartado, um novo meio é colocado (RPMI completo) e a garrafa é guardada e mantida em estufa de CO2 a 37ºC.
Para manutenção das células 4T1, foi realizado o repique afim de não atingir a confluência. Neste procedimento o meio de cultura foi removido do frasco com o auxílio de uma pipeta Pasteur sendo aspirado e descartado. Sequencialmente após 8 dias de observação, das colônias de 4T1 em uma fina camada turva no frasco, foi colocado 1 mL de tripsina por 3 a 6 min de observação a fim de desprender as células fixadas do frasco. Após este tempo, acrescentar 10 ml de RPMI completo, aspirar todo o meio da  garrafa e colocar em um tubo de falcon 50 ml. Levar o tubo da centrífuga por 10 min a uma velocidade de 1200 RPM a 4ºC e com break 4. Descartar o sobrenadante e ressuspender com RPMI completo em volume de 1ml. Contar na câmara de neubauer para determinar a concentração de células adquiridas. No repique devolver para uma garrafa de 100 μl de células.
Ajustar a concentração de células 4T1 para 1 x 10 / 50μl de RPMI para cada camundongo (Zhang Et. Al 2018).  Com o animal anestesiado foi injetada diretamente sobre a na mama caudal esquerda dos camundongos, a solução contendo a célula utilizando uma agulha de 13x4,5 e seringa de 1mL.
4.4 Ensaio in vivo
Todos os ensaios realizados nesta pesquisa em animais serão realizados de acordo com protocolos experimentais aprovados pelo comitê de ética animal nº 08-2021 R, sob o protocolo n° 158/2018 (ANEXO I) e está em conformidade com o guia recomendado pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) para o cuidado e uso de animais de laboratório CEUA da UFVJM. 
Os Camundongos BALB / c fêmeas de 8 semanas de idade; 25 g foram adquiridos no biotério da UFMG e mantidos a 25-30 °C num ciclo claro / escuro de 12h, alimentados com ração para roedores e água ad libitum.
Os animais do grupo controle foram inoculados no mesmo local com 50 μL de solução RPMI. No quinto dia após a inoculação, os animais foram divididos em grupos:
 
I.                   Grupo CTN: Grupo controle negativo; sem inoculação, tratados com PBS.
II.                Grupo CTP: Controle Positivo Inoculação de 4T1 e tratamento com PBS.
III.             Grupo EASs 300mg/kg: Inoculação de 4T1 e tratamento com 100 mg/kg de extrato aquoso de Sterculia striata (EASs).
IV Grupo IPC 300 mg/kg: Inoculação de 4T1 e tratamento com 300 mg/kg de extrato rico em inibidores de proteases da casca de Sterculia striata (IPC).
V.                Grupo IPS 300mg/kg: Inoculação de 4T1 e tratamento com 300 mg/kg de extrato rico em inibidores de proteases da semente de Sterculia striata (IPS).
VI.              Grupo IPC 500 mg/kg: Inoculação de 4T1 e tratamento com 500 mg/kg de extrato rico em inibidores de proteases da casca de Sterculia striata (IPC).
VII.         Grupo IPS 500mg/kg: Inoculação de 4T1 e tratamentocom 500 mg/kg de extrato rico em inibidores de proteases da semente de Sterculia striata (IPSs).
 
 Após 08 dias da inoculação, quando o tumor se encontrava palpável, iniciou -se-á a medição deste com o auxílio de paquímetro, tratamento e peso. A medição ocorreu em intervalos de 48hs. Os animais de todos os grupos foram eutanasiados no 29º dia após a inoculação. O tratamento é iniciado no 8º dia seguido de tratamentos feitos de forma diária por 18 dias de tratamento. Os animais foram eutanasiados tomando por referência o tamanho máximo dos nódulos, alcançando volume de 800 mm3 .
O número de animais utilizados foi o mínimo necessário para permitir resultados reprodutíveis e estatisticamente confiáveis. A eutanásia foi realizada por exsanguinação após aprofundamento de anestesia, para a coleta dos tumores, linfonodos inguinais, pulmões e baço. 
Inoculação das células 4T1 
Após a contagem em câmara de Neubauer, as células foram diluídas em meio de cultura completo de modo a ser obtido 1x104 células/50μL. Os animais com 8 semanas de vida do grupo experimental foram inoculados de forma subcutânea (s.c.) na almofada de gordura mamária do lado esquerdo de adenocarcinoma mamário 4T1 ressuspendidas em 50 µL de RPMI e solução tampão fosfato-salino (PBS 1X) estéril. Os animais do grupo controle foram inoculados no mesmo local com 50 µL de solução tampão fosfato-salino (PBS 1X) estéril.
Após a remoção cirúrgica do tumor, o mesmo foi colocado em tubo cônico de centrifugação de 15 mL (Falcon®), pesado para ser armazenado em formol por solução tamponada. Sequencialmente retirou-se um fragmento para análise de citocinas por ELISA. Com o auxílio de um bisturi, o tumor foi fragmentado mecanicamente em partes menores e transferido para um novo tubo cônico de poliestireno de centrifugação de 2 mL (Eppendof). 
Padronização do Modelo Tumoral
 Os animais - BALB/c (Mus musculus) com 8 semanas de idade, pesando entre 18 e 20 gramas – foram inoculados com uma concentração (1x104 células/50 µL PBS 1X e RPMI) de células 4T1 ressuspendidas em solução (PBS 1X) filtrado (0.22 µM). Após 29 dias de desenvolvimento das células tumorais, os animais foram eutanasiados, a massa tumoral extraída, processada de acordo com os protocolos vigentes e verificado o número de células através da técnica ELISA, análises histomorfométricas e comparações por pesos, volumes e tamanhos dos órgãos.
Análise de histopatologia em hematoxilina e eosina
As amostras foram fixadas pelo período de 24 horas em formalina a 10% tamponado, passando por uma técnica de inclusão de parafina dando início ao álcool com seis trocas em diferentes concentrações (70%, 85%, 95% e 100%), três trocas com xilol e inclusão em parafina. 
 Cortes seriais de 5 μm obtidos dos blocos de parafina foram corados com hematoxilina e eosina (HE) para a identificação, comparação e confirmação das neoplasias e análise dos órgãos para a detecção de possíveis metástases ou reduções do volume celular.
Eutanásia 
Após o período correspondente a 29 dias, os camundongos foram eutanasiados pela aplicação intraperitoneal (i.p.) de solução anestésica 200 mg/kg Cetamina (Syntec®, Santana de Parnaíba, Brasil) e 5mg/kg Xilazina (Syntec®, Santana de Parnaíba, Brasil). 
 Volume e Peso tumoral 
Após a retirada, o tumor foi pesado em balança analítica e aplicativo software ImageJ (NIH, USA).especifico (tal ) o volume mensurado com o auxílio de um paquímetro (Zaas-1.0004®) após os dias 28 dias de indução, sendo o utilizado a seguinte fórmula descrita por 
descrever a análise histopatológica
descrever a análise citocinas (Manu)
descrever a parte de caracterização química
descrever a parte estatística
RESULTADOS
Ensaio in vitro
   A presente equipe realizou teste in vitro com a S. striata (dados não publicados) onde foi possível observar uma redução de 50% na viabilidade em linhagem de células de câncer de mama após tratamento.Possibilitando uma indução da análise dos efeitos de novos compostos para o tratamento do câncer de mama.
Ensaio in vivo 
A padronização da concentração de células para o desenvolvimento tumoral e extração de células intratumorais foi de 1x104 . Com objetivo de confirmar se a inoculação de células 4T1 na almofada de gordura mamária dos animais acarretaria em crescimento do tumor conforme descrito na literatura (Zhang,2018) assim como verificar se diferentes concentrações de células afetariam no crescimento tumoral obtidos após processamento tumoral, inoculamos (s.c) animais fêmea da linhagem BALB/c (Mus musculus) com 8 semanas de idade com tratamento distintos, células 4T1, respectivamente e acompanhamos o crescimento durante o período de 14 dias. Após este período, os animais foram eutanasiados, os tumores extraídos e processados, e suas células coletadas de acordo com os protocolos estabelecidos.
Peso do Tumor 
A partir da análise dos dados, observamos a maior diferença estatística (*) presente no grupo IPsSs-500mg/kg. Em comparação com o controle positivo ( inoculado) ouve uma redução do peso de aproximadamente 50% do peso do tumor. 
Diferença estatística expressiva na massa tumoral após 22 dias de tratamento. 
Afim de avaliar o crescimento das células de adenocarcinoma 4T1, os animais pertencentes ao grupo tumor foram inoculados na almofada de gordura mamaria com a concentração de 1x104/50μL de células 4T1. Ao atingir o volume aproximado de 800 mm3, os animais foram eutanasiados e os tumores extraídos, sendo o peso mensurado em balança analítica e volume tumoral calculado a partir do comprimento e largura do tumor.
Conforme verificado pela figura X B abaixo, foi observado que não houveram diferenças visuais acentuadas entre o grupo controle e IPsSs-500mg/kg . Apesar disso, diferença é pouco notável e significativa. 
Ainda que a analise visual não tenha demonstrado grandes diferenças, foi verificado a diferença estatística expressiva da massa tumoral após 22 dias de tratamentos. Alteração estatisticamente significativa entre os pesos de cada grupo. A partir da análise dos dados, observamos a maior diferença estatística (*) presente no grupo IPsSs-500mg/kg de aproximadamente 50% do peso do tumor em comparação com o grupo de controle positivo (inoculado). 
Para os grupos IPcSs 300mg/kg e IpsSs 300mg/
Figura x. Peso tumoral em comparação com grupo de menor redução tumoral 
(A) Gráfico em barra representando o peso dos tumores de camundongos BALB/c com 8 semanas de idade com 25 dias de indução (B) Comparação do tamanho do tumor formado pelo crescimento de células de adenocarcinoma 4T1 em camundongos da linhagem BALB/c pertencentes aos grupos controle positivo e tratamentos retirados no dia da eutanásia. 
Baço induzido por células 4T1 aumenta o seu tamanho em 25 dias 
Afim de verificar o tamanho do baço e compara-lo se ele é afetado pelo desenvolvimento tumoral, camundongos BALB/c foram eutanasiados após 25 dias do transplante de células 4T1. O baço foi extraído, a presença de alterações visuais foi verificada e o seu tamanho foi medido por régua.
Ao comparar o peso do baço foi verificado a diferença estatística após 22 dias de tratamentos. Alteração ocorre em uma leve redução estatisticamente significativa entre os pesos de cada grupo. A partir da análise dos dados, observamos a maior diferença estatística presentes entre os grupos IPsSs-500mg/kg e IPcSs 500mg/kg do peso do baço em comparação com o grupo de controle positivo (inoculado). 
Ao observar que a análise visual tenha demonstrado diferenças, foi verificado que o baço dos camundongos induzidos com células tumorais 4T1 (Inoculados) e grupo IPsSs-500mg/kg tornou-se progressivamente maior em função do grupo controle negativo. Este aumento foi visualmente significativo quando comparado por imagens (Figura X).
Tornou-se evidente que o aumento da área do baço está intimamente associado a expansão da massa tumoral. 
Figura X. Peso do baço e comparação de seu tamanho
 
(A) Gráfico em barra representando o peso dosbaços de grupos camundongos BALB/c com 8 semanas de idade com 25 dias de indução de células de adenocarcinoma. (B) Fotos representativas do baço de camundongos da linhagem BALB/c pertencentes aos grupos controle negativo, C. positivo e IPsSs-500mg/kg. (C) Gráfico em barra representando o tamanho dos baços, em centímetro medidos por régua dos grupos de camundongos controle negativo, Controle positivo e IPsSs-500mg/kg. 
Peso do Pulmão 
Peso animal 
Volume tumoral dos grupos
Volume do Tumor - Grupos tratado com Casca
Volume do Tumor - Grupos tratado com IP de Semente 
Extrato Aquoso 
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 26/05/2022
	Fórmula do Volume [V = (L × W2) / 2]
	Média dos grupos
	Grupo
	Camundongo
	V(m m3)
	Peso (g)
	Média do Volume
	Média do Peso 
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	3
	----
	24,8
	--
	23,9
	
	4
	----
	23,0
	
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	789,48
	25,0
	714,12
	23,5
	
	2
	521,80
	22,1
	
	
	
	3
	954,13
	24,1
	
	
	
	5
	591,09
	22,8
	
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	412,07
	22,9
	667,27
	22,53
	
	2
	690,07
	21,09
	
	
	
	3
	779,60
	21,08
	
	
	
	4
	787,37
	25,05
	
	
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	612,62
	22,05
	620,58
	22,77
	
	2
	810,07
	21,01
	
	
	
	3
	620,95
	23,0
	
	
	
	4
	438,69
	25,05
	
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300g
	1
	642,09
	20,07
	586,79
	22,04
	
	2
	582,43
	24,01
	
	
	
	3
	629,01
	22,03
	
	
	
	4
	644,29
	22,05
	
	
	
	5
	436,17
	22,06
	
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 200g
	1
	575,67
	21,09
	698,56
	22,45
	
	2
	588,23
	22,03
	
	
	
	3
	661,80
	22,05
	
	
	
	4
	991,47
	25,01
	
	
	
	5
	676,61
	22,07
	
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 200g
	1
	380,31
	22,07
	596,31
	22,66
	
	2
	565,23
	23,07
	
	
	
	3
	663,41
	23,06
	
	
	
	4
	661,12
	22,05
	
	
	
	5
	711,49
	23,05
	
	
	Caixa 8 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 100g
	
	2
	646,79
	21,09
	587,02
	22,59
	
	3
	527,25
	24,09 
	
	
	
	
Somando caixa 2 (4 camundongos) + caixa 8 com (2 camundongos) = média do tumor seria 671, 75
	Data 26/05/2022
	Peso do Baço – Tadeu
	Grupo
	Camundongo
	Peso (g)
	Média do Peso 
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	
	4
	0,128
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	0,674
	
	
	2
	0,381
	
	
	3
	0,811
	
	
	5
	0,507
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	0,478
	
	
	2
	0,535
	
	
	3
	0,587
	
	
	4
	0,860
	
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	0,591
	
	
	2
	0,850
	
	
	3
	0,556
	
	
	4
	0,422
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300g
	1
	0,707
	
	
	2
	0,717
	
	
	3
	0,478
	
	
	4
	0,498
	
	
	5
	0,457
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 200g
	1
	0,389
	
	
	2
	0,487
	
	
	3
	
	0,473
	
	
	4
	0,568
	
	
	5
	0,428
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 200g
	1
	0,379
	
	
	2
	0,498
	
	
	3
	0,471
	
	
	4
	0,537
	
	
	5
	0,664
	
	Caixa 8 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 100g
	
	2
	0,522
	
	
	3
	0,563
	
	
	
	Data 26/05/2022
	Peso do Tumor – Tadeu
	Grupo
	Camundongo
	Peso (g)
	Média do Peso 
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	
	4
	--
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	0,648
	
	
	2
	0,831
	
	
	3
	1,258
	
	
	5
	0,954
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	0,376
	
	
	2
	0,587
	
	
	3
	0,881
	
	
	4
	0,610
	
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	0,798
	
	
	2
	0,623
	
	
	3
	0,519
	
	
	4
	0,585
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300g
	1
	0,701
	
	
	2
	0,726
	
	
	3
	0,775
	
	
	4
	0,419
	
	
	5
	0,508
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 200g
	1
	0,824
	
	
	2
	0,492
	
	
	3
	0,686
	
	
	4
	0,713
	
	
	5
	1,032
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 200g
	1
	0,411
	
	
	2
	0,566
	
	
	3
	0,591
	
	
	4
	0,565
	
	
	5
	0,804
	
	Caixa 8 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 100g
	
	2
	0,914
	
	
	3
	0,487
	
	
	
	
	Peso do Pulmão – Tadeu
	Data 26/05/2022upo
	Camundongo
	Peso (g)
	
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	
	4
	0,184
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	0,216
	
	
	2
	0,173
	
	
	3
	0,237
	
	
	5
	0,211
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	0,220
	
	
	2
	0,176
	
	
	3
	0,209
	
	
	4
	0,237
	
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	0,221
	
	
	2
	0,250
	
	
	3
	0,190
	
	
	4
	0,188
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300g
	1
	0,222
	
	
	2
	0,232
	
	
	3
	0,183
	
	
	4
	0,181
	
	
	5
	0,180
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 200g
	1
	0,209
	
	
	2
	0,190
	
	
	3
	0,222
	
	
	4
	0,227
	
	
	5
	0,214
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 200g
	1
	0,182
	
	
	2
	0,202
	
	
	3
	0,219
	
	
	4
	0,235
	
	
	5
	0,213
	
	Caixa 8 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 100g
	
	2
	0,190
	
	
	3
	0,202
	
	
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 07/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	
	
	21,0
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	15,87
	
	22,8
	
	
	2
	64,89
	
	20,3
	
	
	3
	25,14
	
	23,1
	
	
	5
	15,00
	
	21,9
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	5,85
	
	22,2
	
	
	2
	55,60
	
	22,3
	
	
	3
	41,29
	
	21,5
	
	
	4
	60,12
	
	24,1
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	46,50
	
	22,6
	
	
	2
	38,96
	
	21,2
	
	
	3
	32,89
	
	20,9
	
	
	4
	22,52
	
	20,4
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	40,08
	
	21,3
	
	
	2
	33,22
	
	23,0
	
	
	3
	37,49
	
	21,6
	
	
	4
	55,15
	
	21,8
	
	
	5
	24,12
	
	20,4
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	35,64
	
	21,7
	
	
	2
	46,18
	
	23,3
	
	
	3
	12,57
	
	22,5
	
	
	4
	40,43
	
	23,4
	
	
	5
	40,43
	
	22,2
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	36,79
	
	21,2
	
	
	2
	27,59
	
	21,9
	
	
	3
	30,83
	
	21,9
	
	
	4
	50,13
	
	21,4
	
	
	5
	56,56
	
	22,1
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	41,86
	
	20,9
	
	
	3
	42
	
	22,3
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 09/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	
	
	22,0
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	68,47
	
	23
	
	
	2
	79,50
	
	20,6
	
	
	3
	74,84
	
	23,5
	
	
	5
	14,78
	
	22,0
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	14,78
	
	22,0
	
	
	2
	77,72
	
	21,8
	
	
	3
	68,91
	
	21,4
	
	
	4
	80,05
	
	24,4
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	39,04
	
	22,9
	
	
	2
	84,09
	
	21,4
	
	
	3
	57,27
	
	20,8
	
	
	4
	92,67
	
	20,1
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	56,74
	
	21,3
	
	
	2
	86,72
	
	22,3
	
	
	3
	79,28
	
	22,4
	
	
	4
	115,69
	
	21,3
	
	
	5
	55,0
	
	20,9
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	61,34
	
	23,2
	
	
	2
	71,74
	
	23,4
	
	
	3
	13,64
	
	22,8
	
	
	4
	112,44
	
	23,5
	
	
	5
	65,10
	
	22,3
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	89,03
	
	22,0
	
	
	2
	37,95
	
	21,9
	
	
	3
	69,95
	
	22,5
	
	
	4
	67,58
	
	21,6
	
	
	5
	86,33
	
	19,7
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	75,52
	
	21,1
	
	
	3
	53,14
	
	21,6
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 11/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	 
	
	
	22,0
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	82,45
	
	
	23,4
	
	2
	105,22
	
	
	29,8
	
	3
	103,68
	
	
	23,0
	
	5
	143,99
	
	
	22,5
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	43,93
	
	
	21,0
	
	2
	130,28
	
	22,4
	
	
	3
	176,80
	
	21,4
	
	
	4
	188,44
	
	25,0
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease)300g
	1
	115,62
	
	23,5
	
	
	2
	148,49
	
	21,6
	
	
	3
	132,16
	
	21,0
	
	
	4
	179,40
	
	20,4
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	134,26
	
	21,2
	
	
	2
	137,86
	
	23,0
	
	
	3
	118,33
	
	22,0
	
	
	4
	112,64
	
	21,8
	
	
	5
	54,31
	
	20,6
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	113,69
	
	23,6
	
	
	2
	162,25
	
	23,4
	
	
	3
	35,32
	
	22,9
	
	
	4
	193,58
	
	24,0
	
	
	5
	136,63
	
	22,8
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	131,59
	
	21,4
	
	
	2
	102,69
	
	22,0
	
	
	3
	110,53
	
	22,2
	
	
	4
	157,24
	
	22,1
	
	
	5
	191,81
	
	22,2
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	121,69
	
	21,7
	
	
	3
	99,95
	
	22,2
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 13/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	
	
	22,3
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	158,31
	
	23,9
	
	
	2
	178,78
	
	21,3
	
	
	3
	129,63
	
	24,2
	
	
	5
	206,68
	
	22,4
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	64,56
	
	22,0
	
	
	2
	127,08
	
	22,5
	
	
	3
	229,51
	
	21,8
	
	
	4
	172,25
	
	25,2
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	107,04
	
	23,6
	
	
	2
	153,04
	
	18,9
	
	
	3
	154,45
	
	21,3
	
	
	4
	191,86
	
	20,4
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	116,96
	
	21,2
	
	
	2
	129,45
	
	23,8
	
	
	3
	108,38
	
	22,7
	
	
	4
	107,99
	
	21,4
	
	
	5
	59,23
	
	21,6
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	77,77
	
	23,8
	
	
	2
	174,44
	
	23,6
	
	
	3
	64,82
	
	23,1
	
	
	4
	181,69
	
	24,6
	
	
	5
	152,07
	
	23,1
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	92,91
	
	22,3
	
	
	2
	90,98
	
	23,6
	
	
	3
	118,59
	
	23,3
	
	
	4
	101,01
	
	22,4
	
	
	5
	171,98
	
	23,2
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	281,64
	
	22,3
	
	
	3
	145,01
	
	22,6
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 15/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	
	
	22,1
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	133,85
	
	23,8
	
	
	2
	96,8
	
	21,0
	
	
	3
	178,29
	
	24,5
	
	
	5
	184,69
	
	22,3
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	45,16
	
	22,2
	
	
	2
	152,77
	
	22,2
	
	
	3
	256,86
	
	21,5
	
	
	4
	158,01
	
	25,5
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	95,22
	
	23,2
	
	
	2
	122,57
	
	20,0
	
	
	3
	163,05
	
	21,4
	
	
	4
	142,00
	
	20,1
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	100,37
	
	20,9
	
	
	2
	125,11
	
	23,0
	
	
	3
	111,82
	
	22,3
	
	
	4
	141,44
	
	21,7
	
	
	5
	66,67
	
	21,5
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	94,77
	
	24,0
	
	
	2
	106,28
	
	23,4
	
	
	3
	103,154
	
	22,5
	
	
	4
	180,55
	
	25,0
	
	
	5
	117,53
	
	23,5
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	118,72
	
	21,8
	
	
	2
	103,00
	
	23,4
	
	
	3
	94,65
	
	23,4
	
	
	4
	99,83
	
	22,5
	
	
	5
	129,28
	
	23,1
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	136,50
	
	22,2
	
	
	3
	135,65
	
	23,3
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 17/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	
	
	23,1
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	194,0
	
	24,8
	
	
	2
	160,83
	
	21,5
	
	
	3
	189,99
	
	24,1
	
	
	5
	196,89
	
	22,7
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	84,74
	
	22,1
	
	
	2
	193,21
	
	22,8
	
	
	3
	252,33
	
	21,5
	
	
	4
	144,69
	
	25,6
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	249,19
	
	21,6
	
	
	2
	204,66
	
	20,0
	
	
	3
	201,17
	
	21,1
	
	
	4
	170,32
	
	20,8
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	170,16
	
	21,0
	
	
	2
	158,67
	
	23,6
	
	
	3
	155,84
	
	22,2
	
	
	4
	205,33
	
	21,9
	
	
	5
	148,76
	
	21,2
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	149,67
	
	23,7
	
	
	2
	185,38
	
	23,4
	
	
	3
	128,48
	
	22,8
	
	
	4
	278,22
	
	24,5
	
	
	5
	186,56
	
	23,6
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	139,12
	
	21,7
	
	
	2
	190,41
	
	23,6
	
	
	3
	133,96
	
	21,5
	
	
	4
	184,80
	
	22,0
	
	
	5
	197,15
	
	23,4
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	203,89
	
	23,0
	
	
	3
	175,40
	
	21,9
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 19/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	
	
	22,2
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	240,05
	
	25,2
	
	
	2
	156,63
	
	21,4
	
	
	3
	304,26
	
	24,2
	
	
	5
	255,68
	
	22,9
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	92,03
	
	22,5
	
	
	2
	234,09
	
	22,2
	
	
	3
	282,18
	
	21,6
	
	
	4
	246,66
	
	25,9
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	304,71
	
	22,3
	
	
	2
	287,42
	
	20,6
	
	
	3
	246,74
	
	21,5
	
	
	4
	145,13
	
	20,9
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	239,28
	
	20,8
	
	
	2
	264,66
	
	23,6
	
	
	3
	140,70
	
	22,3
	
	
	4
	245,42
	
	22,1
	
	
	5
	132,80
	
	21,7
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	168,39
	
	23,5
	
	
	2
	253,96
	
	23,6
	
	
	3
	117,75
	
	23,0
	
	
	4
	392,16
	
	24,8
	
	
	5
	203,09
	
	24
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	176,71
	
	22,3
	
	
	2
	201,37
	
	24,1
	
	
	3
	152,15
	
	23,2
	
	
	4
	277,76
	
	23,1
	
	
	5
	293,10
	
	24,3
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	154,75
	
	21,9
	
	
	3
	243,69
	
	23,2
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 21/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	 
	
	22,3
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	344,1
	344,1
	25,2
	
	
	2
	230,1
	
	21,3
	
	
	3
	472,9
	
	23,7
	
	
	5
	315,0
	
	22,8
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	169,8
	
	21,9
	
	
	2
	311,9
	
	21,8
	
	
	3
	449,3
	
	21,7
	
	
	4
	346,2
	
	25,9
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	380,9
	
	22,3
	
	
	2
	518,2
	
	20,4
	
	
	3
	354,1
	
	21,9
	
	
	4
	266,9
	
	20,8
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	388,6
	
	20,8
	
	
	2
	313,2
	
	23,7
	
	
	3
	274,2
	
	22,6
	
	
	4
	342,1
	
	22,1
	
	
	5
	232,7
	
	21,9
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	280,5
	
	23,3
	
	
	2
	310,5
	
	23,1
	
	
	3
	329,5
	
	23,3
	
	
	4
	611,93
	
	24,9
	
	
	5
	288,3
	
	22,5
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	245,5
	
	22,5
	
	
	2
	308,7
	
	23,2
	
	
	3
	210,9
	
	22,5
	
	
	4
	285,3
	
	22,6
	
	
	5
	382,6
	
	23,8
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	243,64
	
	21,5
	
	
	3
	281,1
	
	23,7
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 23/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	
	
	22,3
	22,3
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	517,9
	
	25,9
	
	
	2
	265,8
	
	21,8
	
	
	3
	803,26
	
	24,0
	
	
	5
	392,92
	
	23,5
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	219,18
	
	22,2
	
	
	2
	349,64
	
	22,0
	
	
	3
	648,77
	
	21,4
	
	
	4
	425,3
	
	25,2
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	465,52
	
	22,3
	
	
	2
	562,19
	
	20,7
	
	
	3
	410,08
	
	22,2
	
	
	4
	356,30
	
	20,7
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	476,63
	
	20,8
	
	
	2
	353,54
	
	23,8
	
	
	3
	409,47
	
	22,0
	
	
	4
	387,77
	
	22,0
	
	
	5
	288,64
	
	22,1
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	326,41
	
	22,8
	
	
	2
	461,59
	
	23,1
	
	
	3
	422,03
	
	23,8
	
	
	4
	701,94
	
	25,5
	
	
	5
	449,52
	
	23,6
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	282,80
	
	22,0
	
	
	2
	396,47
	
	23,8
	
	
	3
	395,74
	
	22,9
	
	
	4
	448,74
	
	22,5
	
	
	5
	407,63
	
	23,5Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	332,56
	
	21,9
	
	
	3
	395,53
	
	23,6
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 25/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	
	
	22,5
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	615,44
	
	24,9
	
	
	2
	452,55
	
	22,2
	
	
	3
	902,5
	
	24,3
	
	
	5
	468,5
	
	23,3
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	367,73
	
	22,5
	
	
	2
	581,66
	
	21,9
	
	
	3
	728,23
	
	21,7
	
	
	4
	667,55
	
	25,5
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	563,36
	
	22,3
	
	
	2
	668,61
	
	20,8
	
	
	3
	505,41
	
	22,1
	
	
	4
	407,95
	
	21,1
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	595,37
	
	21,0
	
	
	2
	425,64
	
	24,3
	
	
	3
	508,45
	
	22,0
	
	
	4
	575,5
	
	22,3
	
	
	5
	354,92
	
	22,5
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	432,58
	
	21,6
	
	
	2
	501,62
	
	21,7
	
	
	3
	445,75
	
	22,2
	
	
	4
	805,58
	
	24,4
	
	
	5
	543,34
	
	22,1
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	332,93
	
	22,6
	
	
	2
	505,65
	
	23,2
	
	
	3
	532,14
	
	22,9
	
	
	4
	514,89
	
	22,4
	
	
	5
	563,70
	
	23,6
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	443,94
	
	21,8
	
	
	3
	433,51
	
	24,2
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 26/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Média do Volume
	Peso(g)
	Média do Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	4
	
	
	23,0
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	789,48
	
	25,0
	
	
	2
	521,80
	
	22,1
	
	
	3
	954,83
	
	24,1
	
	
	5
	591,09
	
	22,8
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	412,07
	
	22,9
	
	
	2
	690,07
	
	21,8
	
	
	3
	770,60
	
	21,8
	
	
	4
	787,37
	
	25,5
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	612,62
	
	22,5
	
	
	2
	810,7
	
	21,1
	
	
	3
	620,45
	
	23,0
	
	
	4
	438,69
	
	21,5
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300mg/kg
	1
	642,90
	
	20,7
	
	
	2
	582,43
	
	24,8
	
	
	3
	629,01
	
	22,3
	
	
	4
	644,29
	
	22,5
	
	
	5
	438,18
	
	22,6
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 500mg/kg
	1
	575,67
	
	21,8
	
	
	2
	588,23
	
	22,3
	
	
	3
	661,86
	
	22,5
	
	
	4
	991,47
	
	25,1
	
	
	5
	676,67
	
	22,7
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 500g
	1
	380,31
	
	22,2
	
	
	2
	565,23
	
	23,7
	
	
	3
	663,41
	
	23,6
	
	
	4
	661,12
	
	22,5
	
	
	5
	711,49
	
	23,5
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	2
	646,79
	
	21,9
	
	
	3
	527,25
	
	24,9
	
	
	Controle do Volume Tumoral 4T1 – Tadeu
	Data 07/05/2022
	Camundongo
	Volume (mm3)
	Peso (g)
	Caixa 1 – CTL (Controle negativo)
	
	4
	21,0
	
	Caixa 2 – CL (Controle Positivo)
	1
	22,8
	
	
	2
	20,3
	
	
	3
	23,1
	
	
	5
	21,9
	
	Caixa 3 – Grupo EAS
(Extrato aquoso) 300g
	1
	22,2
	
	
	2
	22,3
	
	
	3
	21,5
	
	
	4
	24,1
	
	
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	Caixa 4 – Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 300g
	1
	22,6
	
	
	21,2
	
	
	
	20,9
	
	
	
	20,4
	
	Caixa 5 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 300g
	1
	21,3
	
	
	2
	23,0
	
	
	3
	21,6
	
	
	4
	21,8
	
	
	5
	20,4
	
	Caixa 6 - Tratamento com IP Casca (Inibidor de protease) 200g
	1
	21,7
	
	
	2
	23,3
	
	
	3
	22,5
	
	
	4
	23,4
	
	
	5
	22,2
	
	Caixa 7 - Tratamento com IP Semente (Inibidor de protease) 200g
	1
	21,2
	
	
	2
	21,9
	
	
	3
	21,9
	
	
	4
	21,4
	
	
	5
	22,1
	
	Caixa 8 - Controle Positivo 
	
	2
	20,9
	
	
	3
	22,9
	
	
	
	
Conclusão 
Assim, produzir ciência através do poder da fitoterapia, vem sendo cada vez mais relevante no meio científico e ao decorrer dos anos, devido aos seus preciosos resultados. 
Calculo de dosagens
 
  Tratado com extrato etánolico de  Sterculia striata em pó com a prescrição de 500 mg/Kg em um tubo pela metade de composto já liofilizado.
 
500 mg ------------- 1000g
 	X --------------------25g
X1000= 500 x 25
X 1000 = 12500
X = 12500
	    1000
X= 12.5 mg
Assim é separado do extrato 12,5 mg por camundongo.
·         Como temos 4 camundongos que foram tratados com o composto extraído da casca observa-se 12,5 x 4 = 50 mg ou 0,05g por dia de tratamento.  
·         O mesmo se aplica ao grupo semente.  Foram 4 camundongos que foram tratados com o composto extraído da semente. Observa-se 12,5 x 4 = 50 mg ou 0,05g por dia de tratamento. 
·         O composto é dissolvido em 1 ml se soro fisiológico de 0,9%  e dividido para 4 camundongos ou seja cada camundongo receberá 250 μl através de gavagem por dia.
 
Estatística
 
 
 
Gráficos
 
 
 
 
 
Histologia
 
Para para análise de densidade de microvalhos (MVD).e avaliação das células tumorais, calcular a quantidade por tratamento é sugerido uma , montar laminas dos órgão do pulmão, fígado, sangue e glândulas, Os tumores mamários e pulmões foram selecionados para exame histológico. Os tecidos foram dissecados, embutidos em parafina e seccionados (6 μm de espessura). As seções foram manchadas com hematoxilina e eosina (H&E). Anticorpo policlonal de coelho anti-CD31 foi usado para coloração imunohistoquímica (IHC) de tumor mamário e seções pulmonares para análise de densidade de microvalhos (MVD)
 
Orgão utilizado
Luminol para comparação
 
 
Tabelas
Eutanásia usar o D-luciferin Retirar os órgão para analise. Preparar laminas. Usar o luminal,
Colocar introdução refevancia
Colocar a procupaçao de eutanasiar o grupos semente antes da data
Dissertação
Colocar anexos como protocolos ufmg
 
Fotos
 
Montar Calendário do experimento em Abril  
Colocar foto da eutanásia
 
Fazer o protocolo como anexo 2
 
 
 
 
 
4.6 Experimento com Câncer de mama
 
Segundo o experimento com câncer de mama será definido em parceria com o laboratório de imunologia da UFMG.
5        CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO[A8] 
	Ações
	2021
	2022
	2023
	 
	
	2ºBim.
	3ºBim.
	4ºBim.
	5ºBim.
	6ºBim.
	1ºBim.
	2ºBim.
	3ºBim.
	4ºBim.
	5ºBim.
	6ºBim.
	1º Tri.
	2ºTri
	Revisão Bibliográfica
	x
	x
	x
	x
	x
	
	
	
	
	
	
	
	
	 
	Coleta do Material  Vegetal
	x
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	 
	Comitê de Ética
	
	
	x
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	 
	Análise in vitro
	
	
	
	x
	x
	
	
	
	
	
	
	
	
	 
	Interpretação dos Resultados (in vitro)
	
	
	
	
	
	x
	x
	
	
	
	
	
	
	 
	Análise in vivo
	
	
	
	
	
	
	
	x
	x
	
	
	
	
	 
	Quantificação dos Mediadores
	
	
	
	x
	x
	x
	
	x
	
	x
	x
	
	
	 
	Redação da Dissertação
	x
	x
	x
	x
	x
	x
	x
	x
	x
	x
	x
	x
	
	 
	Defesa da Dissertação
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	x
	 
 
REFERÊNCIAS[A9] 
 
Alimentos regionais brasileiros / Ministério da Saúde, Secretaria de Atenção à Saúde, Departamento de Atenção Básica. – 2. ed. – Brasília : Ministério da Saúde, 2015. 484 p. : il. ISBN 978-85-334-2145-5
 
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de Atenção Básica. Alimentos regionais brasileiros / Ministério da Saúde, Secretaria de Atenção à Saúde, Departamento de Atenção Básica. – 2. ed. – Brasília : Ministério da Saúde, 2015.
 
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Siglas
 
EASs -  Extrato aquoso da Sterculia Striata
 
IPSs - Inibidores de proteases de Ster
oms
onu 
 4t1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS- CEUA
DIAMANTINA – MG
 
CERTIFICADO
 
Teófilo Otoni, 02 de fevereiro de 2022.
 
 
Certificamos que a proposta intitulada "Estudo do efeito do extrato aquoso de Sterculia striata e do extrato rico em inibidores de proteases da Sterculia striata na modulação da resposta antitumoral em modelo murino de câncer de mama", registrada com o nº 08-2021 R, sob a responsabilidade de Caio César de Souza Alves - que envolve a produção, manutenção ou utilização de animais pertencentes ao filo Chordata, subfilo Vertebrata (exceto humanos), para fins de pesquisa cientifica (ou ensino) - encontra-se de acordo com os preceitos da Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, do Decreto nº 6.899, de 15 de julho de 2009, e com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal - Concea, e foi APROVADA pela COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA- Mucuri/UFVJM) DA UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI, em 26ª Reunião Ordinária, no
dia 02 de fevereiro de 2022.  sob o protocolo n° 158/2018 (ANEXO I) e está em conformidade com o guia recomendado pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) para o cuidado e uso de animais de laboratório
 
	Finalidade
	( ) Ensino ( X ) Pesquisa Cientifica
	Vigência da Autorização
	13/02/2022 a 13/02/2026
	Espécie/linhagem/raça
	Camundongo isogênico / BALB/c
	Nº de animais
	300
	Peso/Idade
	22g / 6 a 8 semanas
	Sexo
	Fêmeas
	Origem
	CEBIO - Centro de Bioterismo - ICB-UFMG
 
O prazo de validade desse Certificado é equivalente a vigência do Projeto prorrogável por mais 1 ano, desde que seja enviada justificativa a CEUA-Mucuri/UFVJM durante a vigência do projeto.
 
Com o recebimento deste Certificado, o responsável compromete-se a entregar o relatório final da proposta até 60 dias após o término. Em caso de planos de aula, a cada seis meses estes deverão ser revalidados.
 
Ressaltamos que, conforme a Resolução Normativa I, de 9 de Julho de 2010, qualquer alteração no protocolo previamente aprovado, na equipe técnica, bem como acidentes envolvendo os animais, competem ao responsável a comunicação a CEUA-Mucuri/UFVJM.
 
 
Ernani Aloysio Amaral
Vice-Coordenador da Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA-Mucuri/UFVJM
Documento assinado eletronicamente por Ernani Aloysio Amaral, servidor (a), em 03/02/2022, às 11:19, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.
 
A autenticidade deste documento pode ser conferida no site
https://sei.ufvjm.edu.br/sei/controlador_externo.php?acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0, informando o código verificador 0594966 e o código CRC B0AB9F80.
 
Referência: Caso responda este Ofício, indicar expressamente o Processo nº 23086.006746/2021-62                                                  	SEI nº 0594966
Campus JK
Comissão de Ética no Uso de Animais/ UFVJM
Prédio da Reitoria-PRPPG- Rodovia MGT 367 - Km 583, nº 5000 Alto da Jacuba - Diamantina/MG – CEP 39100-000 Telefone: +55 (38) 3532-1200
 
 [A1]MELHORAR
 [Jr2]
 [PGL3]Este texto não está em formato para dissertação OK?
Apenas para você se guiar. A forma de escrita para dissertação é outra.
 [PGL4]Essa foi a referências que eu te passei?
 
Sim
 [Jr5]Eu retirei do artigo que você me passou.
 [PGL6]Temperatura muito fria. Você tem essas informações de onde?
 [PGL7]Isso precisa ser consultado com a Fabiana
 [A8]MELHORAR
 [A9]ABNT
Anexo 2
Extrato de INIBIDOR de Proteases 
1. Higienizar o material 
2. Transferir todo o material triturado em pedaços para liquidificador industrial por 5 min cada 100 g
3. Adicionar 600 ml de álcool 70% a cada 100 g do material triturado
4. Manter aquecido a 55°C por 1 hora no aquecedor eletrônico ( observar e equilibrar a temperatura) 
5. Filtrar com pano novo/peneira esterilizada o material aquecido em um béquer de 2 litros e descartar o excesso
6. Acertar o PH em 5.3 
7. Adicionar 2x o volume de acetona
8. Banho de gelo por 24hs 
9. Descartar o sobrenadante e centrifugar a extração em 3.640 RPM a 5°C por 30 min. 
10. Descartar o sobrenadante e o material precipitado armazenar a 80 °C por 24hs para liofilizar.
 
Anexo 3 - Protocolo equipe câncer de mama 
Protocolo de Certificação
1. identificar todos os materiais que serão armazenados com informações padronizadas:
· UFVJM
· Laboratório
· Nome do responsável
· Conteúdo armazenado 
· Data
2. Usar caneta fixadora ou etiqueta padrão
3. Certificar etiquetas, portas, registros de pressão e tampas ao final de cada experimento
4. Certificar o nível de água na estufa 
Protocolo de higienização 
1. Lavar as mãos e colocar luvas
2. Esterilizar o fluxo laminar com álcool 70% através de movimentos unidirecionais 
3. Aguardar por 30 min o fluxo laminar com a lâmpada de UV ligada para esterilização 
4. Separar e passar o álcool 70% em todo os materiais que serão utilizados ( tubo falcon, garrafa de meio, pipeta, pipetador, ponteira, caneta, etiqueta, parafilme, estante entre outros ) sem abrir as embalagens fora do fluxo laminar
5. Deixar os materiais no fluxo laminar de 10 a 15 min com a lâmpada UV ligada para esterilização. 
6. Abrir as embalagens dentro do fluxo laminar para não contaminar
7. Em casos de reutilizar algum material ( ponteiras ou estantes) levar para autoclave a 120 °C por 20 min e aplicar o início deste protocolo. 
8. Higienizar com álcool éter e lenço (para limpar óculos) o microscópio antes e depois do uso e sequencialmente desligar, retirar da tomada e colocar capa plástica de proteção. 
9. Ao retirar as garrafas de cultura, evitar tocar na tampa e transportar em diagonal
10. Certificar portas, registros de pressão, fluxo laminar e garrafas de culturas bem fechadas (no caso de ter um filtro ou parcialmente aberta para entrada de ar) 
11. Ao final de cada experimento limpar com álcool 70% o local de uso (bancadas e mesas)
Suplementação para RPMI COMPLETO 
1. Após o protocolo de esterilização e a etiquetagem dos materiais a serem utilizados, dentro do fluxo laminar, adicionar aos 500ml de RPMI INCOMPLETO: 
· 10% de soro fetal bovino = 50 ml 
· 1% de aminoácidos = 5ml 
· 0,5% de antibiótico = 2,5 ml 
2. Homogenizar, identificar de acordo com protocolo), vedado com parafilme, 
3. Armazenar na geladeira de acordo com o protocolo de identificação 
4. Transferir 50 ml de RPMI completo para um tubo falcon estéril ( dentro do fluxo) para uso exclusivo da linhagem trabalhada, a evitar contaminações de 500 ml de RPMI completo, que pode ser utilizada em outros experimentos.