Relatório_Final_PIBIC_Karolaine_Martins (1)

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RELATÓRIO FINAL DE ATIVIDADES DO ESTUDANTE BOLSISTA E VOLUNTÁRIO DO PIBIC/CNPq – UFPE
1. IDENTIFICAÇÃO
	Nome do(a) Orientador(a):
	Tercilio Calsa Júnior
	Nome do(a) Estudante:
	Karolaine Martins da Silva Santos
	Área do projeto:
	Genética Vegetal
	Título do projeto:
	Avaliação da expressão dos genes da família pht1 em cana-de-açúcar inoculadas com fungo micorrízico arbuscular submetido ao déficit hídrico
	ID do projeto
	210217386
2. Resumo 
	A cana-de-açúcar é uma monocotiledônea rica em sacarose, sendo bastante utilizada na produção de açúcar destinado a alimentação e na produção de etanol. Esta planta demanda uma alta quantidade de recursos hídricos e nutrientes, principalmente fósforo e nitrogênio. A associação simbionte com os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) promove melhor absorção e utilização de nutrientes, e podem conferir maior tolerância ao estresse hídrico aumentando o desenvolvimento e crescimento das plantas e melhorando a produtividade, sendo uma proposta a ser explorada pela indústria. Na análise apresentada a seguir, pode-se notar que a absorção de fósforo (P) nas variedades RB867515 e RB111443 depende de fatores como situações de estresse hídrico, solo do plantio e interação entre fungo e planta. Os resultados se mostraram positivos quanto a melhora da absorção de P em planta inoculada com FMAs e em período de déficit hídrico, sendo também um indicativo da estimulação da regulação gênica para a família PHT1. As médias de absorção da variedade RB867515 foram: sem FMA irrigadas – 374,4 mg/kg; SFMA em déficit hídrico – 179,6 mg/kg; SFMA, reidratação – 394,6 mg/kg; FMA, inoculado com Dentiscutata heterogama – 317,6 mg/kg; FMA DH, déficit hídrico – 577,2 mg/kg; FMA DH, reidratação – 252,6 mg/kg; FMA inoculado com Claroideoglomus etunicatum, irrigado – 358,1 mg/kg; FMA CE, déficit hídrico – 483,9 mg/kg; FMA CE, reidratação – 82,22 mg/kg. E da variedade RB111443 foram: SFMA, irrigado – 147,1 mg/kg; SFMA, déficit hídrico – 126,9 mg/kg; SFMA, reidratação – 244,5 mg/kg; FMA DH, irrigado – 313,5 mg/kg; FMA DH, déficit hídrico – 451,5 mg/kg; FMA DH, reidratação – 110,6 mg/kg; FMA CE, irrigado – 203,9 mg/kg; FMA CE, déficit hídrico – 302,5 mg/kg. Sendo assim, os valores de absorção se mantiveram numa média de 100 a 500 mg/kg, um valor considerável para raízes de cana-de-açúcar.
3. INTRODUÇÃO
Cana-de-açúcar é uma gramínea originária do sudeste asiático, presente em todas as regiões tropicais e subtropicais do mundo (CHEAVEGATTI-GIANOTTO, 2011). O Brasil é o maior produtor, com aproximadamente nove milhões de hectares plantados, e média de produção estimada nos dois últimos anos de 73.273 kg/ha (CONAB, 2020). Está monocotiledônea possui metabolismo do tipo C4 que confere grande capacidade fotossintética (LANGDALE, 2011), tornando-a uma grande produtora de açúcar e etanol. Contudo, a maioria dos custos da produção da cana-de-açúcar, advém da necessidade de alta disponibilidade hídrica (INMAN-BAMBER; LAKSHMANAN; PARK, 2012) e da utilização de fertilizantes, visto que, os solos brasileiros possuem deficiência nutricional, principalmente de fósforo (P) (PALM et al, 2007). O Fósforo é um nutriente de baixa disponibilidade nos solos, presente em diversas macromoléculas, como os nucleotídeos, sendo essencial para o metabolismo e desenvolvimento das plantas, participando de diversas vias bioquímicas, como a fotossíntese e respiração. Contudo, este elemento encontra-se escasso na natureza, devido a sua crescente utilização, cerca de 90 %, para a fabricação de fertilizantes fosfatados (PANTANO et al., 2016).
No Brasil, estes fertilizantes são usados principalmente no cultivo de milho, soja e cana, culturas imprescindíveis para a economia e alimentação humana (WITHERS et al, 2018). Entretanto, o fósforo aplicado rapidamente se complexa com outros compostos presentes no solo, ficando indisponível para a plantas, sendo necessário uma grande quantidade de adubo fosfatado para a manutenção das plantações, como nos canaviais, que são utilizados entre 100 a 150 kg de P2O5/ha para as plantas de primeiro corte (RODRIGUES et al, 2016; ROY et al, 2016).
O fósforo é um elemento essencial para o desenvolvimento da cana-de-açúcar, pois é necessário para enraizamento, perfilhamento, crescimento do colmo e acúmulo de sacarose, desta forma sua deficiência pode comprometer a sua produtividade (SOUSA et al, 2015). A maioria do fósforo que é absorvido pelas plantas está na forma de fosfato (PO4³), havendo nestas, genes específicos responsáveis por controlar a absorção e transporte de fosfato. Os genes família de proteónas transportadoras de fósforo (PHT1) estão incluídos nessa classe de transportadores de fosfato inorgânico de alta afinidade, ou seja, são capazes de promover um grande aumento na absorção deste nutriente, e o aumento de sua expressão está associado à uma baixa disponibilidade de fosfato inorgânico no solo (REMY et al., 2012). Desta forma, plantas que possuem transportadores ativos de alta afinidade por fosfato não necessitam altos teores de fosfato no solo, reduzindo os custos com aplicação de adubos fosfatados.
A disponibilidade hídrica é um fator limitante para o crescimento e desenvolvimento das plantas, ocasionando na produção de cana-de-açúcar perdas de 30 % (INMAN-BAMBER et al, 2016) que podem atingir valores próximos a 70 % como ocorreu em alguns canaviais do estado de Pernambuco em 2017. O déficit hídrico gera diversas alterações, como fechamento de estômatos que promove redução na fotossíntese, redução na transpiração e aumento da temperatura foliar (AKHTAR; NAZIR, 2013). Além disso, promove o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio [superóxido (O2•-), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (OH-) e oxigênio singleto (O2)] que podem gerar desnaturação proteica, oxidação dos aminoácidos, peroxidação dos lipídios e danos aos ácidos nucleicos (CHAN et al,2016; OSAKABE et al 2014). Para atenuar os efeitos deletérios do déficit hídrico, pesquisas evidenciam que uso de microrganismos simbiontes, como bactérias diazotróficas e fungos micorrízicos arbusculares, e aplicação de nutrientes, como fosforo (JIN et al, 2005; TARIQ et al, 2017; TARIQ et al, 2018), podem conferir a tolerância as plantas quando submetidas a este estresse, pois contribuem gerando alterações bioquímicas e fisiológicas nas plantas.
Os fungos micorrízicos arbusculares (FMA) são endossimbiontes que colonizam as raízes das plantas e contribuem para o seu crescimento. Os vegetais fornecem açucares para o desenvolvimento do FMA, que em troca promovem melhor captação de água e sais minerais. Além disso, os FMAs estimulam o aumento na produção de metabólitos secundários, conferem defesa contra patógenos, promovem ajustamento osmótico, aumento na produção e atividade de enzimas antioxidantes e tolerância a estresses bióticos e abióticos (MEHNAZ, 2012; OLIVEIRA; CAMPOS; SILVA, 2014; MIRSHAD; PUTHUR, 2016). Além disso, os FMAs estimulam nas plantas respostas moleculares como regulação de genes, principalmente, os genes das famílias de transportadores de fosfato inorgânico de alta afinidade. Estudos com diversos membros da família Poaceae evidenciam que as plantas colonizadas por micorrizas apresentaram maior expressão dos genes da família PHT1 do que as plantas não-colonizadas e um maior aproveitamento do fósforo presente no solo (TIAN et al, 2013; SISAPHAITHONG et al, 2013; GLASSOP; SMITH; SMITH, 2005). Portanto, o objetivo do presente trabalho é avaliar a absorção de fósforo em raízes de cana-de-açúcar colonizada ou não pelos FMAs.
4.OBJETIVOS DO PROJETO 
· Avaliar a absorção de fósforo em raízes das variedades RB867515 e RB111443 de cana-de-açúcar colonizada ou não pelos FMAs Claroideoglomus etunicatum e Dentiscutata heterogama;
· Avaliar a expressão dos genes PHT1.1, PHT 1.4, PHT 1.6 e PHT1.8 em raízes de cana-de-açúcar nas diferentes condições hídricas;
· Validar por meio de ferramentas bioinformáticas as proteínas PHT1.1, PHT1.4, PHT1.6 e PHT1.8 de cana-de-açúcar.
5. METODOLOGIA
	1. Materialvegetal e Inóculo 
Os rebolos de cana-de-açúcar das variedades RB867515 (a variedade mais plantada no Brasil) e RB111443 foram gentilmente fornecidos pela RIDESA (Rede Interuniversitária para o Desenvolvimento do Setor Sucroenergético). Os inóculos de fungo micorrízico arbusculares utilizados foram das espécies Claroideoglomus etunicatum e Dentiscutata heterogama, gentilmente fornecidos pelo Laboratório de Biologia do Solo do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA). 
2. Delineamento Experimental 
O experimento foi conduzido em uma casa de vegetação no Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA). Segmentos de colmo de cana-de-açúcar variedades RB867515 e RB111443, gentilmente cedidos pela RIDESA, foram tratados termicamente para desinfecção segundo TOKESHI (1997). Em seguida, propagados em bandejas contendo solo do tipo argissolo vermelho-amarelo autoclavado, previamente analisado (Tabela 1). Após dez dias de plantio, foram transplantados em vasos contendo 8 kg de solo do tipo argissolo vermelho-amarelo autoclavado. No momento do transplantio, 6 dos 12 vasos foram inoculados, na região das raízes com 200 esporos de FMA. As plantas foram regadas com solução de Hoagland (1/2 força) (HOAGLAND E ARNON, 1938) e água destilada em dias alternados. Após 45 dias do transplantio, metade das plantas foram submetidas à supressão de rega por 7 dias. Plantas controle permaneceram com irrigação constante, a 70 % da capacidade de campo. O delineamento experimental foi do tipo inteiramente casualizado, em arranjo fatorial de 2x2, com quatro tratamentos: 1- plantas irrigadas não inoculadas, 2- plantas irrigadas e inoculadas com Claroideoglomus etunicatum, 3- plantas submetidas ao déficit hídrico não inoculadas, 4- plantas submetidas ao déficit hídrico e inoculadas com Claroideoglomus etunicatum e Dentiscutata heterogama, em 3 repetições totalizando 12 unidades experimentais. Após 52 dias de transplantio, foram coletadas as raízes para determinar a colonização do FMA, e as raízes de cana-de-açúcar inoculadas e não inoculadas para as análises moleculares e dosagem de fósforo.
Tabela 1: Análise dos nutrientes presentes no solo do tipo argissolo vermelho-amarelo. P: Fósforo; Ca: Cálcio; Mg: Magnésio; Na: Sódio; K: Potássio; Al: Alumínio; H: Hidrogênio; S: Extrator de Fosfato monocálcico em ácido acético.
	mg/dm3
	cmolc/dm3
	pH (H2O)
	P
	Ca
	Mg
	Na
	K
	Al
	H
	S
	
	10
	0,8
	0,7
	0,04
	0,02
	0,05
	3,66
	1,6
	5,8
3. Determinação da colonização micorrízica 
As raízes foram tratadas, lavadas e secas em papel toalha. Em seguida, o material foi submetido ao processo de coloração no Laboratório de Biologia dos Solos (IPA) segundo o método de Philips e Hayman (1970). Inicialmente, as amostras foram submersas em tubos contendo solução de hidróxido de potássio (KOH) (10 %) e foram aquecidas por 30 min. Posteriormente, foram lavadas em água corrente, e submersas em solução de ácido clorídrico (HCl) (1 %) durante 5 min. Em seguida, o HCl foi descartado e foi adicionado uma solução de Azul de Trypan (0,05 %). As raízes foram aquecidas por 10 min e o excesso do corante foi retirado com água destilada. A colonização foi mensurada de acordo com a metodologia de Giovannetti & Mosse (1980). Para a avaliação da colonização, 1 cm de cada amostra de raiz foi depositada e fixada em lâmina com lactoglicerol, cobrindo toda a superfície com lamínula. Esse procedimento é realizado até haver uma quantidade de amostras o suficiente para análise, com resultado expresso em porcentagem de raízes colonizadas.
4. Desenho dos iniciadores para utilização no PCR 
Para o desenho dos iniciadores, inicialmente foi realizada uma busca das sequências de nucleotídeos da família Inorganic phosphate transporter 1 (PHT1) obtidas no banco de dados do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), em formato Fasta. Posteriormente, as sequências obtidas foram submetidas aos programas primer3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/
primer3plus.cgi) e o Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)de forma
consecutiva, com os seguintes parâmetros: tamanho do iniciador entre 18 e 22 pb (tamanho ótimo 20 pb); número máximo de repetições de mononucleotídeos igual a 3; temperatura de melting (Tm) entre 50 e 60 °C (ótimo a 55 °C); diferença máxima entre a temperatura de melting (Tm) dos primers direto e reverso igual a 5; conteúdo GC % entre 40 e 60 %; fator de autocomplementariedade máxima igual a 4. Os iniciadores obtidos foram testados no programa online OligoAnalyzer (https://www.idtdna.com/calc/analyzer/) para análise de predição para autoanelamento, formação de dímeros, homologia cruzada e especificidade. 
5. Caracterização e validação in sílico
O acesso, Q8H6H2 foi utilizado como sonda na ferramenta tBlastn (https://blast.ncbi.nlm.
nih.gov), com o objetivo de identificar sequências gênicas altamente similares. Inicialmente, foram identificados os quadros de leitura e domínios conservados por meio das ferramentas ORFinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder) e CD-search (https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
cdd/wrpsb.cgi), respectivamente. Em seguida, foram utilizadas as seguintes ferramentas: Signal-P (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) para predição e localização de peptídeo sinal, ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) para analisar as sequências quanto ao ponto isoelétrico (pI) teórico e massa molecular (MM), Philius (http://www.yeastrc.org/philius/pages/philius/runPhilius.jsp) para a predição de transmembrana e DeepLoc (http://www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/) para determinação da localização subcelular. 
Posteriormente, utilizou-se o Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/) para a realização do modelo por homologia.
6. Dosagem do fósforo 
As raízes coletadas foram secas em estufa e pulverizadas em moinho. Posteriormente, o material vegetal foi submetido ao processo de digestão no Laboratório de Energia de Biomassa (Departamento de Energia Nuclear – UFPE) conforme a metodologia de Thomas, Shearrd, Moyer, (1967). Inicialmente, foi pesado 250 mg de cada amostra, no qual foi adicionado 5 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) P.A.. Em seguida, as amostras foram incubadas em placa aquecedora a 350 ºC durante 30 min. Após esse período, as amostras foram resfriadas por 10 min, e adicionado 0,5 mL de H2O2, as amostras retornaram na placa de aquecimento durante 8 min e o processo foi repetido até as amostras ficarem esbranquiçadas. Ao final, as amostras foram incubadas por 30 min para eliminação do H2 O2 restante e em seguida foi adicionado água destilada para completar o volume de 50 mL. A quantificação em espectrofotômetro foi realizada conforme Murphy e Ryley (1962). Previamente, foi feita uma curva padrão com 5 ppm de uma solução de fósforo com os respectivos volumes:0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0mL. Em seguida, foi adicionado P-Nitrofenol em alíquotas de 2 mL de cada extrato obtido na digestão, e o pH foi ajustado com hidróxido de sódio (NaOH) 1,5 N. As amostras foram agitadas até atingir a coloração amarelada, clareada com H2SO4 2,5 N e foi colocado 4 mL da solução de fósforo para atingir a coloração esperada, e adicionado água deionizada para o volume final de 25 mL. A solução foi incubada na ausência da luz durante 40 min para a realização de leitura no espectrofotômetro a 880 nm. 
Após a leitura, foi realizada a análise da estatística no programa GraphPad Prism 9 (https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/). 
6. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO OBJETIVA DOS RESULTADOS OBTIDOS 
6.1 Determinação da colonização micorrízica
Os dados obtidos demonstram alta taxa de colonização nas raízes de cana-de-açúcar pelos isolados micorriza utilizados em relação às plantas não-inoculadas (Tabela 1). Entretanto, foi possível observar uma pequena taxa de colonização nas plantas não-inoculadas, provavelmente o processo de esterilização dos solos não foi tão eficiente para eliminação dos FMAs nativos. Também foi observado que a taxa de colonização da RB111443 é em todas as situações foi inferior a RB867515, aparentemente a RB867515é mais colonizável que a RB111443, sem evidenciar diferença entre a espécie de FMA, situação não observada na RB111443 que evidencia maior interação com FMCE.
Tabela 1:  Determinação da colonização micorrízica em raízes de cana-de-açúcar inoculadas ou não por fungos micorrizos arbuscuares.  S/FMA: Plantas não-inoculadas por FMA. SFMADH: Plantas colonizadas pelo FMA Dentiscutata heterogama: FMACE: Plantas colonizadas pelo FMA Claroideoglomus etunicatum. 
	Variedade
	S/FMA
	FMADH
	FMACE
	RB867515
	13,33 % 
	80 % 
	80 %
	RB111443
	6, 67 % 
	63,33 %
	76,67 % 
6.2 Desenho dos iniciadores para utilização no PCR
	As sequências dos iniciadores para os genes PHT1.1, PHT 1.4, PHT 1.6 e PHT1.8, podem ser observadas na tabela 4. 
Tabela 1: Sequências de oligonucleotídeos para iniciadores, tamanho esperado dos fragmentos e temperatura de anelamento.
	Gene
	Sequência
	GC
	TM
	Tamanho
	PHT1.1
	F
	CCGAACAGCACCACCTTTAT
	50.0 %
	60.0
	160 bp
	
	R
	CATCCGCTTTGCTTTTATCC
	45.0 %
	59.7
	
	PHT1.4
	F
	GGCAGCTTTGGCTTTCTGTA
	50.0 %
	60.5
	185 bp
	
	R
	TCGGTTTCCATTTCTTCCAG
	45.0 %
	60.0
	
	PHT1.6
	F
	CCACCGTGTTTATGGAAACC
	50.0 %
	 60.1
	151 bp
	
	R
	GGCACAATAAAGGTGGTGCT
	50.0 %
	60.0
	
	PHT1.8
	F
	GGCAGCTTTGGCTTTCTGTA
	50.0 %
	60.5
	183 bp
	
	R
	CAGTTCTTCCAGGCTTTTGC
	50.0 %
	60.0
	
6.3 Caracterização das proteínas 
Por meio da caracterização in silico das proteínas de PHT1.1, PHT 1.4, PHT 1.6 e PHT1.8 foi possível observar que todas as proteínas são do tipo transmembrana (Tabela 2) em formato de canal (Figuras 1, 2, 3 e 4), contudo apenas a PHT1.8 está localizada no Vacúolo (Tabela 3), sendo a menor proteína comparação com as demais.
Tabela 2. Caracterização in sílico das proteínas transportadoras de alta afinidade por fósforo da família PHT1. PM: peso molecular; N° amin.: número de total de aminoácidos. Valores entre parênteses indicam confiabilidade da predição.
	Proteína
	Acesso
	Score
	Evalue
	N° amin.
	PM
	Localização 
	PHT1.1
	Q8H6H4
	923
	0.0
	495
	54005.33
	Membrana celular (43%)
	PHT1.4
	Q8H6H2
	961
	0.0
	575
	62125.52
	Membrana celular (43%)
	PHT1.6
	Q8H6H0
	588
	0.0
	525
	57560.06
	Membrana celular (40%)
	PHT1.8
	Q8H6G8
	370
	5e-126
	193
	21079.27
	Vacúolo (37%)
Tabela 3. Caracterização in sílico das proteínas transportadoras de alta afinidade por fósforo da família PHT1. P. Sinal: para presença de peptídeo de sinalização; Modelo: código de acesso SWISS-MODEL; Identidade: similaridade da proteína em estudo com a proteína modelo PDB; 
	Proteína
	P. sinal
	Modelo
	Identidade
	pI
	Predição de Proteína
	PHT1.1
	98,18%
	4gby.1.A
	17.37%
	7.07
	Transmembrana (99%)
	PHT1.4
	99,78%
	4j05.1.A
	36.83%
	4.76
	Transmembrana (99%)
	PHT1.6
	0,76%
	6n3i.1.A
	17.36%
	5.09
	Transmembrana (99%)
	PHT1.8
	99,95%
	4j05.1.A
	40.00%
	5.46
	Transmembrana (99%)
Figura 1. Modelo da PHT1.1, gerado no SWISS-MODEL.
Figura 2. Modelo da PHT1.4, gerado no SWISS-MODEL.
Figura 4. Modelo da PHT1.8, gerado no SWISS-MODEL.
Figura 3. Modelo da PHT1.6, gerado no SWISS-MODEL.
6.4 Dosagem de fósforo 
Através da análise estatística obteve-se resultados significativos, sendo observados diferenças na absorção de fósforo dentre as variedades em estudo e a depender dos fatores hídricos. A adsorção se dá pela presença de óxidos e hidróxidos de Fe e Al mesmo em quantidades baixas, em argissolos, essas moléculas possuem uma reação de ligação eletrostática chamada de adsorção de fosfato. A quantidade de P no solo precisa ser o suficiente desde o início do plantio e nas fases sucessivas, pois ele promove o aumento do trifosfato de adenosina (ATP), que gera energia para o desenvolvimento dos tecidos da planta, e consequentemente um bom rendimento da safra. As médias de absorção da variedade RB867515 foram: SFMA, irrigadas – 374.4 mg/kg; SFMA, déficit hídrico – 179.6 mg/kg; SFMA, reidratação – 394.6 mg/kg; FMADH, irrigadas – 317.6 mg/kg; FMADH, déficit hídrico – 577.2 mg/kg; FMADH, reidratadas – 252.6 mg/kg; FMACE, irrigadas – 358.1 mg/kg; FMACE, déficit hídrico – 483.9 mg/kg; FMACE, reidratadas – 82.22 mg/kg. E da variedade RB111443 foram: SFMA, irrigadas – 147.1 mg/kg; SFMA, déficit hídrico – 126.9 mg/kg; SFMA, reidratadas - 244.5 mg/kg; FMADH, irrigadas – 313.5 mg/kg; FMADH, déficit hídrico – 451.5 mg/kg; FMADH, reidratadas – 110.6 mg/kg; FMACE, irrigadas – 203.9 mg/kg; FMACE, déficit hídrico – 302.5 mg/kg. As plantas da variedade RB867515 (Gráfico 1) mostraram níveis variados de absorção, com teores de P bastante significativos. As plantas sem FMA tiveram absorção abaixo do desejado durante as 3 fases hídricas, no entanto ainda estão na média. As plantas inoculadas com Dentiscutata heterogama obtiveram um desempenho considerável tanto na irrigação quanto na reidratação, no entanto apresentaram valores abaixo do desejado no período de déficit hídrico. Em contrapartida, as plantas inoculadas com Claroideoglomus etunicatum mostraram baixo nível de absorção durante as 3 fases hídricas, podendo ser um indicativo de baixa afinidade entre a variedade e a espécie de fungo. No entanto, mais estudos precisam ser realizados. 
Gráfico 1. Dados estatísticos dos teores de fósforos em raízes de cana-de-açúcar (var. RB867515).
Tabela 4. Dados estatísticos de teores de fósforo de raízes de cana-de-açúcar (var. RB867515). SFMA: sem fungo micorrízico arbuscular; FMADH: fungo micorrízico arbuscular Dentiscutata heterogama; FMACE: Claroideoglomus etunicatum; *: nível de significância. 
	 7515SFMA:Irrigado vs. 7515SFMA:Déficit Hídrico
	*
	0,0364
	 7515SFMA:Irrigado vs. 7515FMADH:Déficit Hídrico
	*
	0,0288
	 7515SFMA:Irrigado vs. 7515FMACE:Reidratação
	**
	0,0026
	 7515SFMA:Déficit Hídrico vs. 7515SFMA:Reidratação
	*
	0,0203
	 7515SFMA:Déficit Hídrico vs. 7515FMADH:Déficit Hídrico
	***
	0,0003
	 7515SFMA:Déficit Hídrico vs. 7515FMACE:Déficit Hídrico
	**
	0,002
	 7515SFMA:Reidratação vs. 7515FMACE:Reidratação
	**
	0,0016
	 7515FMADH:Irrigado vs. 7515FMADH:Déficit Hídrico
	**
	0,006
	 7515FMADH:Irrigado vs. 7515FMACE:Reidratação
	*
	0,0116
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 7515FMADH:Reidratação
	**
	0,0012
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 7515FMACE:Irrigado
	*
	0,0181
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 7515FMACE:Reidratação
	****
	<0,0001
	 7515FMADH:Reidratação vs. 7515FMACE:Déficit Hídrico
	*
	0,0129
	 7515FMACE:Irrigado vs. 7515FMACE:Reidratação
	**
	0,004
	 7515FMACE:Déficit Hídrico vs. 7515FMACE:Reidratação
	***
	0,0002
	As plantas da variedade RB111443 tiveram pouco sucesso quanto ao nível de absorção significativa de fósforo em grande parte das amostras, restando apenas 3 para análise e comparação. As plantas sem FMA conseguem ótimos níveis de absorção, mas não há confiabilidade visto que os resultados podem variar na safra a depender do solo. Os resultados de absorção mais significativos pertencem a planta inoculada com Dentiscutata heterogama, que apesar de não parecer no gráfico foi alcançado o teor de 0,0372, com uma queda da absorção apenas na fase de irrigação.
Gráfico 2. Dados estatísticos dos teores de fósforos em raízes de cana-de-açúcar (var. RB111443).
	 1443SFMA:Déficit Hídrico vs. 1443FMADH:Déficit Hídrico
	*
	0,0486
	 1443FMADH:Déficit Hídrico vs. 1443FMADH:Reidratação
	*
	0,0372
 Tabela 5. Dados estatísticos de teores de fósforo de raízes de cana-de-açúcar (var. RB111443). SFMA: sem fungo micorrízico arbuscular; FMADH: fungo micorrízico arbuscular Dentiscutata heterogama; FMACE: Claroideoglomus etunicatum; *: nível de significância.
A análise conjunta permitiu entender que sem FMA, ambas as variedades conseguem absorver um certo teor de P, tanto em período de irrigação quanto em período de reidratação e principalmente a variedade RB111443. No entanto, podem sofrer de carência em períodos de déficits hídricos, mostrando não ser a melhor alternativa para a indústria que objetiva prevenir problemas causados no plantio pela escassez hídrica. As plantas da variedade RB867515 inoculadas com Dentiscutata heterogama obtiveram maior sucesso na absorção, mantendo bons níveis de significânciadurante as 3 fases hídricas. Em contrapartida, as plantas da mesma variedade inoculadas com Claroideoglomus etunicatum, sofreram alterações desfavoráveis no período de irrigação, mas mantiveram-se na média durante as 2 fases seguintes. Por outro lado, a análise da variedade RB111443 revelou que a planta talvez não tenha obtido sucesso na simbiose com o fungo Claroideoglomus etunicatum, para absorção de P, tendo em vista que os níveis de absorção se mantiveram iguais aos da planta sem fungo inoculado. No entanto, a associação com Dentiscutata heterogama demonstrou resultados, obtendo um nível de absorção a ser considero. Demais estudos precisam ser realizados para entender os níveis de afinidade entre as variedades de cana-de-açúcar e espécies de FMAs.
Gráfico 3. Dados estatísticos dos teores de fósforos em raízes de cana-de-açúcar (var. RB867515 e RB111443). 
Tabela 6. Dados estatísticos de teores de fósforo de raízes de cana-de-açúcar (var. RB867515 e RB111443). SFMA: sem fungo micorrízico arbuscular; FMADH: fungo micorrízico arbuscular Dentiscutata heterogama; FMACE: Claroideoglomus etunicatum; *: nível de significância.
	 7515SFMA:Irrigado vs. 7515FMACE:Reidratação
	*
	0,0242
	 7515SFMA:Déficit Hídrico vs. 7515FMADH:Déficit Hídrico
	**
	0,001
	 7515SFMA:Déficit Hídrico vs. 7515FMACE:Déficit Hídrico
	*
	0,0169
	 7515SFMA:Déficit Hídrico vs. 1443FMADH:Déficit Hídrico
	*
	0,0436
	 7515SFMA:Reidratação vs. 7515FMACE:Reidratação
	*
	0,0132
	 7515SFMA:Reidratação vs. 1443SFMA:Déficit Hídrico
	*
	0,049
	 7515SFMA:Reidratação vs. 1443FMADH:Reidratação
	*
	0,0307
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 7515FMADH:Reidratação
	**
	0,0092
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 7515FMACE:Reidratação
	****
	<0,0001
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 1443SFMA:Irrigado
	***
	0,0004
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 1443SFMA:Déficit Hídrico
	***
	0,0002
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 1443SFMA:Reidratação
	**
	0,0072
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 1443FMADH:Reidratação
	***
	0,0001
	 7515FMADH:Déficit Hídrico vs. 1443FMACE:Irrigado
	**
	0,0022
	 7515FMACE:Irrigado vs. 7515FMACE:Reidratação
	*
	0,0388
	 7515FMACE:Déficit Hídrico vs. 7515FMACE:Reidratação
	***
	0,0009
	 7515FMACE:Déficit Hídrico vs. 1443SFMA:Irrigado
	**
	0,0064
	 7515FMACE:Déficit Hídrico vs. 1443SFMA:Déficit Hídrico
	**
	0,0035
	 7515FMACE:Déficit Hídrico vs. 1443FMADH:Reidratação
	**
	0,0022
	 7515FMACE:Déficit Hídrico vs. 1443FMACE:Irrigado
	*
	0,0345
	 7515FMACE:Reidratação vs. 1443FMADH:Déficit Hídrico
	**
	0,0024
	 7515FMACE:Reidratação vs. 1443FMACE:Déficit Hídrico
	*
	0,019
	 1443SFMA:Irrigado vs. 1443FMADH:Déficit Hídrico
	*
	0,0169
	 1443SFMA:Déficit Hídrico vs. 1443FMADH:Déficit Hídrico
	**
	0,0092
	 1443FMADH:Déficit Hídrico vs. 1443FMADH:Reidratação
	**
	0,0057
	 1443FMADH:Reidratação vs. 1443FMACE:Déficit Hídrico
	*
	0,0436
 
7. CONCLUSÕES
	Em face dos resultados obtidos, é visível o quanto o uso de FMAs além de ajudar na captação de nutrientes, favorece a expressão dos genes proteína da família PHT1.1 que pôr sua vez aumentam os níveis de absorção de fósforo. Além do mais, o conhecimento sobre as características da família PHT1.1 permite um ajuste das metodologias empregadas aos níveis de predição das proteínas, e também entender os mecanismos de ação. A variedade RB867515 demonstrou afinidades por ambas as espécies de FMAs estudadas, sendo uma planta com provável potencial para uso pela indústria. Por outro lado, a variedade RB111443 ainda precisa de ajustes na metodologia, sendo arriscado o seu uso em solo não estudado e também em simbiose com FMAs de baixa afinidade. Ademais, em grande parte dos casos houve influência positiva do uso de FMAs na resistência da planta e continuação da absorção de P principalmente em períodos de estresse hídrico. Portanto, a análise de cana-de-açúcar inoculada com FMA evidencia o seu uso favorável para sucesso do plantio. 
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
	
AKHTAR I, NAZIR N. Effect of waterlogging and drought stress in plants. Int J Water Res Env Sci. v. 2, p. 34–40, 2013.
BRASIL. Conab. Companhia Nacional de Abastecimento (Org.). Acompanhamento da Safra Brasileira Cana-de-Açúcar, 62 p, 2020.
BUSTIN S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol v. 25, p.169-93, 2000.
CALSA JR T.; FIGUEIRA A. Serial analysis of gene expression in sugarcane (Saccharum spp.) leaves revealed alternative c4 metabolism and putative antisense transcripts. Plant Mol Bio, v. 63, p. 745-62, 2007.
CHAN Z, et al. Editorial: ROS Regulation during Plant Abiotic Stress Responses. Front Plant Sci. 2016.
CHEAVEGATTI-GIANOTTO, A. et al. Sugarcane (Saccharum X officinarum): A Reference Study for the Regulation of Genetically Modified Cultivars in Brazil. Tropical Plant Biol. v. 4, p 62–89, 2011.
GIOVANNETTI M. and MOSSE B. An evaluation of techniques for measuring vesicular arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytol v. 84, p. 489-500, 1980.
GLASSOP D.; SMITH S. E.; SMITH F. W. Cereal phosphate transporters associated with the mycorrhizal pathway of phosphate uptake into roots. Planta. v. 222, p. 688–98, 2005.
HOAGLAND D. R.; ARNON D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experimental Station. Circ. n.347,1938.
INMAN-BAMBER N. G., LAKSHMANAN P., PARK S. Sugarcane for water-limited environments: theoretical assessment of suitable traits. Field Crops Res. v.134, p. 95–104, 2012.
INMAN-BAMBER N. G. et al. Sugarcane for water-limited environments: Enhanced capability of the APSIM sugarcane model for assessing traits for transpiration efficiency and root water supply. Field Crops Res. v.196, p. 113–23, 2016.
JIN J. et al. Interaction Between Phosphorus Nutrition and Drought on Grain Yield, and Assimilation of Phosphorus and Nitrogen in Two Soybean Cultivars Differing in Protein Concentration in Grains. J Plant Nutri, v. 29, n.8, p. 1433-49, 2006.
LANGDALE J. C4 cycles: past, present, and future research on C4 photosynthesis. Plant Cell. n23, p. 3879-92, 2011.
MEHNAZ S Microbes – friends and foes of sugarcane. J. Basic Microbiol. v. 53, p. 1–18, 2012.
MIRSHAD P. P.; PUTHUR J. T. Arbuscular mycorrhizal association enhances drought tolerance potential of promising bioenergy grass (Saccharum arundinaceum retz.) Environ Monit Assess. v.188, p. 425-45, 2016.
MURPHY, J. &amp; RILEY, J.P.A. A modified simple solution method for the determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta, 27: 31-36, 1962.
OLIVEIRA M. S.; CAMPOS M. A. S.; SILVA F. S. B. Arbuscular mycorrhizal fungi and vermicompost to maximize the production of foliar biomolecules in Passiflora alata Curtis seedlings. J Sci Food Agric 95: 522–28, 2014.
OSAKABE Y, et al. Response of plants to water stress. Front Plant Sci. 2014.
PALM, C. et al Soils: a contemporary perspective. Annu. Rev. Environ. Resour. n.32, p.99–129, 2007.
PANTANO, G. et al. Sustentabilidade no uso do fósforo: uma questão de segurança hídrica e alimentar. Quimica Nova, p. 1-3, 2016.
PHILLIPS, J. M., e HAYMAN, D. S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 1970. 
REMY, E. et al. The Pht1;9 and Pht1;8 transporters mediate inorganic phosphate acquisition by the Arabidopsis thaliana root during phosphorus starvation. New Phytologist, v. 195, n. 2, p.356-71, 2012.
RODRIGUES, M. et al. Legacy phosphorus and no tillage agriculture in tropical oxisols of the Brazilian savanna. Sci. Total Environ. n.542, p. 1050–61,2016.
ROY, E. D. et al. The phosphorus cost of agricultural intensification in the tropics. Nat. Plants, n. 2, p. 2–7,2016.
SISAPHAITHONG T et al. Expression of plant genes for arbuscular mycorrhiza-inducible phosphate transporters and fungal vesicle formation in sorghum, barley, and wheat roots. Biosci. Biotechnol. Biochem.v. 76, n. 12, p. 2364–67,2013.
SOUSA, R. T. X. et al. Phosphate Fertilizers for Sugarcane Used at Pre-Planting (Phosphorus Fertilizer Application). Journal of Plant Nutrition. v.38, n.9, p. 1444-55, 2015.
TARIQ A et al. Phosphorous fertilization alleviates drought effects on Alnus cremastogyne by regulating its antioxidant and osmotic potential. Sci Rep v.8, p. 5644-55, 2018.
TARIQ A. et al. Phosphorous Application Improves Drought Tolerance of Phoebe zhennan. Front Plant Sci. v. 8, p.1561-73, 2017.
TIAN H. et al. Arbuscular mycorrhizal fungi differ in their ability to regulate the expression of phosphate transporters in maize (Zea mays L.). Mycorrhiza. v. 23, p. 507–14, 2013.
TOKESHI H. Doenças da cana-de-açúcar. In: Kimati H, Amorim L, Rezende JAM, Bergamin Filho A and Camargo LEA (eds) Manual de Fitopatologia Doenças das plantas cultivadas.
Agronômica Ceres, São Paulo, p. 207-225, 1997.
THOMAS, R.L.; SHEARRD, R.W.; MOYER, J.R. Comparasion of conventional and automated procedures for N, P and K analysis of plant material using a single digestion. Agronomy Journal, Madison, 59: 240-243, 1967.
VIERHEILIG H. et al. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol v.64, p.5004-07,1998.
WITHERS, P. J. A. et al. Transitions to sustainable management of phosphorus in Brazilian agriculture. Scientific Reports, v. 8, n. 1, p.2-3, 2018.
8. ATIVIDADES PARALELAS DESENVOLVIDAS PELO ESTUDANTE
Não houve.
9. DIFICULDADES ENCONTRADAS NO DESENVOLVIMENTO DO PROJETO
Em razão da pandemia, houveram atrasos nas etapas iniciais do projeto, devido a interrupção das atividades na Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), ocasionando a interrupção das atividades e não funcionamento do Laboratório de Genômica e Proteômica de Plantas (LGPP) e do Departamento de Energia Nuclear (DEN). Disponibilidade de recursos para a compra dos primers, impossibilitando a realização da PCR para maior validação dos resultados.
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Data e assinatura do(a) orientador(a) Data e assinatura do(a) estudante