relatório 2 bioquímica

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Bioquímica – Química Bacharelado 
Experimento 02: DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS - 03/08/2022 
Cássio Siqueira, Frederico José Kolisnek, João Francisco Ramos Ribeiro Neto, Sarah da Silva Cebulski 
 
1. INTRODUÇÃO 
As proteínas são estruturas que participam de todos os processos de formação e função de toda e 
qualquer célula. Essas macromoléculas são responsáveis pela expressão genética, pelas funções metabólicas, 
pelo crescimento e destruição de tecidos e uma infinidade de outras funções relacionadas. Todas as proteínas 
são formadas pelas mesmas 20 subunidades monoméricas, chamadas de aminoácidos, apenas ligando-se de 
diferentes formas em uma sequência linear. 
A espectrofotometria é um método analítico usado para quantificar o quanto uma substância química 
absorve ou emite luz em função do comprimento de onda determinado. Isso se dá, pois, a amostra incialmente 
se encontra em seu estado fundamental de energia e o estímulo da radiação faz com que ocorra uma transição 
para um estado de maior energia, onde obtemos as informações requeridas através da absorção decorrente da 
excitação ou da emissão ao retornar ao seu estado fundamental. O método de absorção atômica é amplamente 
utilizado na determinação da concentração de certo composto presente na solução, quanto maior for a 
concentração, maior será a absorção de luz. 
O método do Biureto é utilizado para determinar a concentração de proteínas em diversas finalidades 
como saliva, urina, plasma sanguíneo, entre outros. Apesar de não apresentar uma boa sensibilidade, seu uso 
é difundido, principalmente em práticas didáticas devido ao seu baixo custo, simplicidade e rapidez. 
O reagente de Biureto, no qual se baseia o método a ser utilizado, se apresenta como uma mistura de 
cobre e hidróxido de sódio e um complexante estabilizador do cobre. O cobre irá reagir com as proteínas, em 
meio básico, formando um complexo com a ligação peptídica, de geometria quadrada planar. Este produto tem 
pico de absorção na região de 540nm, sendo este o comprimento de onda utilizado para fins analíticos. 
 
2. OBJETIVOS 
 
• Elaborar curva de calibração e estabelecer a sensibilidade de um método espectrofotométrico; 
• Resolver problemas específicos: cálculos envolvendo diluição de determinação da 
concentração de diferentes soluções. 
 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
3.1. Curva de Calibração 
Quando métodos instrumentais são utilizados, faz-se necessário calibrar o instrumento, usando 
amostras padrão, contendo diferentes concentrações conhecidas do analito. Por isso, como primeira etapa do 
experimento, foram preparadas 6 amostras para a obtenção da curva de calibração, da qual serão retiradas 
informações a serem utilizadas posteriormente. 
A preparação das amostras se deu da forma que, o Tubo 1 não recebeu a adição do analito, que neste 
caso é a proteína, pois esta será a amostra referência, chamada de branco, utilizado para calibrar o 
espectrofotômetro. Nos demais tubos foram adicionados determinados volumes de analito, diluente (água 
destilada) e 5mL de Reagente do Biureto, como demonstra a Tabela 1. 
Tabela 1 – Relação de reagentes para obtenção das amostras 
 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 
Solução padrão de proteína (5mg/mL) - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 
Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 - 
Reagente do Biureto (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 
Após deixar as amostras em repouso pelo tempo indicado, foram realizados os ensaios no 
espectrofotômetro utilizando o equipamento com comprimento de onda em 540nm, pois como a solução a ser 
analisada é azul, ela irá absorver o amarelo, situado entre 565 e 590nm, com maior intensidade. 
Na Tabela 2 se apresenta os valores de absorbância obtidos e a concentração de proteína contida em 
cada tubo, parâmetros que foram utilizados para construir a curva de calibração representada na Figura 1. 
Tabela 2 – Parâmetros para a construção da curva de calibração 
 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 
Concentração de proteína (mg/mL) 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 
Absorbância 0,000 0,037 0,071 0,121 0,180 0,185 
Figura 1 – Curva de calibração 
 
 Tendo a curva de calibração e conhecendo a Lei de Beer, que nos diz que podemos utilizar os valores 
medidos de absorbância para obter a concentração, se a absortividade e o caminho ótico forem conhecidos, 
então podemos determinar a concentração das amostras problema no item seguinte. 
 
3.2. Determinação da concentração de proteína em amostra-problema 
Para a segunda etapa experimental, foram preparados 5 tubos de ensaio como amostras problema, 
identificados de A até E, variando quantidades de analito (de concentração desconhecida) e de diluente, 
adicionando 5mL do Reagente do Biureto em cada um, como demonstra a Tabela 3. 
y = 0,0405x - 0,0027
R² = 0,9587
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 1 2 3 4 5 6
A
b
so
rb
ân
ci
a 
em
 5
40
n
m
Concentração de proteína (mg/ml)
Curva de Calibração
Tabela 3 - Relação de reagentes para obtenção das amostras problema 
 Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Tubo E 
Amostra (mL) 1,0 0,5 0,4 0,3 0,1 
Água destilada (mL) - 0,5 0,6 0,7 0,9 
Reagente do Biureto (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 
Para encontrar a concentração de proteínas na amostra, utilizamos a equação da reta (y=ax+b) obtida 
pela curva de calibração: y = 0,0405x – 0,0027, sendo y = absorbância e x = concentração, isola-se a variável 
de interesse e chegamos a equação: x = (y + 0,0027)/0,0405. 
Sabendo que o volume final das amostras, 1 mL (desconsiderando o Biureto), é constituído pela 
alíquota de proteína diluída em água, é utilizado o fator de diluição (volume final/volume da amostra) para o 
cálculo da concentração real de proteínas, com exceção do Tubo A, que não recebeu a adição de água. O 
cálculo se deu pela multiplicação da concentração obtida pelo fator de diluição. Os valores obtidos de 
absorbância e concentrações calculadas estão descritos na Tabela 4. 
Tabela 4 – Valores obtidos de absorbância e concentração 
 Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Tubo E 
Absorbância 0,139 0,165 0,202 0,021 0,074 
Concentração de proteínas (mg/mL) 3,50 4,14 5,05 0,59 1,89 
Fator de diluição - 2 2,5 3,3 10 
Concentração de proteínas na amostra original (mg/mL) 3,50 8,28 12,55 1,95 18,90 
Pode-se observar que os valores, de absorbância, e, consequentemente, de concentração, obtidos para 
as concentrações das amostras problema não estão adequados seguindo a lógica que a absorbância deveria 
estar diminuindo com o passar das amostras, pois em cada tubo foi adicionado menor quantidade de proteínas. 
Além do fato que a curva de calibração foi construída com valores de concentração entre 1 e 5 mg/mL, e três 
das amostras desconhecidas obtiveram concentrações calculadas bem maiores que o limite esperado. 
Uma explicação para este fato pode ser o tempo decorrido entre o preparo das soluções e a realização 
do ensaio no espectrofotômetro ser maior que os 10 minutos indicados para repouso. Também pode-se 
especular a discrepância dos resultados como sendo erro experimental ou na leitura do equipamento, como 
também a efetividade dos reagentes utilizados. 
 
3.3. Perguntas e exercícios 
1) Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica? 
A principal finalidade da espectrofotometria é conseguir quantificar a presença de determinada 
substância na análise. Esta técnica se baseia nas interações da radiação com a matéria para obter informações 
sobre uma amostra. Na espectroscopia de absorção, obtemos as informações medindo a quantidade de luz 
absorvida em função do comprimento de onda determinado. Isso se dá, pois, a amostra incialmente se encontra 
em seu estado fundamental de energia e o estímulo da radiação faz com que ocorra uma transição para um 
estado de maior energia, onde obtemos as informações requeridas através da absorção decorrente da excitação. 
 
2) Conceitue: faixa de sensibilidade do método espectrofotométrico. 
A sensibilidade de um espectrofotômetro se dá pelalargura de banda efetiva, que pode ser menor que 1nm em 
instrumentos mais avançados ou maiores que 20nm para sistemas mais baratos. A escolha da largura da banda 
deve variar de acordo com a necessidade, e, de um modo geral, o uso de bandas mais estreitas traz uma maior 
sensibilidade e seletividade na aplicação da técnica. 
3) Um determinado composto apresenta um máximo de absorção em 660 nm. Para uma 
concentração de 0,75 µmol/mL foi obtida uma absorbância de 0,4. Sabendo-se que o limite de 
sensibilidade do método utilizado é de 0,1µmol/mL a 3µmol/mL, calcule a concentração deste mesmo 
composto correspondente a uma absorbância de 0,85. 
Utilizando a Lei de Lambert-Beer A = ε. l. c e tendo a absortividade molar e o caminho ótico constante, 
podemos estabelecer uma relação direta entre a absorbância e a concentração. Assim, pode-se fazer o uso de 
uma regra de três para encontrar a concentração. 
Absorbância 0,40 ------ 0,75 µmol/mL X = (0,85 . 0,75 µmol/mL) / 0,40 
Absorbância 0,85 ------ X µmol/mL X = 1,59 µmol/mL 
Então, a concentração correspondente a uma absorbância de 0,85 é de 1,59 µmol/mL. 
 
4. CONCLUSÃO 
Apesar da discordância dos resultados obtidos para as concentrações das amostras problema, a prática 
do experimento foi válida para o conhecimento da identificação de proteínas através de reações de colorimetria. 
Para reduzir os erros e obter melhores parâmetros, uma boa alternativa é realizar os experimentos em 
sistema de replicatas, fazendo a média dos valores encontrados. 
 
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 7ª edição. 
Porto Alegre: Artmed, 2019. E-book. 9788582715345. Disponível em: 
https://app.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788582715345/. Acesso em: 14 de agosto de 2022. 
SKOOG, Douglas A.; WEST, Donald M.; HOLLER, F J.; CROUCH, Stanley R. Fundamentos 
de Química Analítica: Tradução da 9ª edição norte-americana. São Paulo: Cengage Learning 
Brasil, 2015. E-book. 9788522121373. Disponível em: https://app.minhabiblioteca.com.br/#/ 
books/9788522121373/. Acesso em: 14 de agosto de 2022. 
ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via 
espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, 1998.