Material de apoio - EAD - Hemato (2)

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Confecção de Esfregaço Sanguíneo
PROCEDIMENTO:
1. Apoiar a lâmina de microscopia, já com a identificação do paciente, sobre uma superfície limpa. Certificar-se de que a lâmina tem boa qualidade e não está suja ou possui vestígios de gordura, o que pode prejudicar o teste.
2. Colocar uma pequena gota de sangue próxima a uma das extremidades da lâmina.
3.  Com o auxílio de outra lâmina, colocar a gota de sangue em contato com sua borda. Para isso a lâmina extensora deve fazer um movimento para trás tocando a gota com o dorso em um ângulo 45°.
4. O sangue da gota irá se espalhar pela borda da lâmina extensora por capilaridade.
5. A lâmina deve então deslizar suave e uniformemente sobre a outra, em direção oposta a extremidade em que está a gota de sangue. O sangue será “puxado” pela lâmina.
6. Depois de completamente estendido, o sangue forma uma película sobre a lâmina de vidro.
7. Deve-se deixar que o esfregaço seque sem nenhuma interferência.
8. Seguir para o passo de coloração.
Coloração de esfregaço sanguíneo
PROCEDIMENTO
1. Colocar a lâmina sobre o suporte apropriado;
2. Cobrir o esfregaço com o corante May Grunwald diluído 1:1;
3. Deixar atuar por 5 minutos;
4. Cobrir o esfregaço com o corante May Grunwald puro;
5. Deixar atuar por 1 minutos;
6. Enxaguar com água abundante;
7. Cobrir o esfregaço com solução diluída de Giemsa;
8. Deixar atuar durante 15 minutos;
9. Enxaguar em água corrente;
10. Deixar secar espontaneamente, em posição vertical.
OBSERVAÇÃO DA LÂMINA
1. Cabeça da lâmina: região imediatamente após o local em que estava a gota sanguínea. Nessa região, com frequência, há aumento do número de leucócitos (principalmente de linfócitos).
2. Corpo da lâmina: região intermediária entre cabeça e cauda. É nessa região que os leucócitos, hemácias e plaquetas estão distribuídas de forma mais homogênea. É a área de escolha para a análise qualitativa e quantitativa da distensão sanguínea.
3. Cauda da lâmina: região final da distensão sanguínea. Nessa região, há encontro de alguns esferócitos e elevação de monócitos e granulócitos, que podem apresentar maior distorção morfológica.
Contagem de Reticulócitos
Reticulócitos são eritrócitos recém-produzidos pela medula ricos em RNA, o que atribui a estas células uma policromatocitose com os métodos de coloração habitualmente utilizados. O nome advém do aspecto dos grânulos de RNA precipitados, que tomam um aspecto reticular quando da coloração com azul brilhante de cresil. O número absoluto de reticulócitos é uma medida da eritropoese e, normalmente, o sangue tem 1 reticulócito para cada 100 eritrócitos. Quando há anemia ou hipoxemia ocorre aceleração da proliferação de eritroblastos com maior liberação de reticulócitos para a periferia. 
PROCEDIMENTO
1. Em tubo de hemólise, colocar o corante e o sangue colhido em EDTA ou heparina como segue:
	HEMATÓCRITO
	CORANTE
	SANGUE
	Até 20%
	5 gotas
	12 gotas
	20 a 30%
	5 gotas
	9 gotas
	Mais que 30%
	5 gotas
	6 gotas
2. Homogeneizar e levar ao banho-maria 37º durante 20 minuto;
3. Homogeneizar novamente e realizar o esfregaço em lâminas;
4. Examinar ao microscópio, sob imersão, 5 campos homogêneos com 200 hemácias por campo;
5. Somar todos os reticulócitos encontrados nos campos, dividir por 10 para que o resultado seja expresso em porcentagem.
%dereticulócitos =
reticulócitos em1000hemácias
10
VALORES DE REFERÊNCIA: Adultos  0,5 a 1,5%
 Neonatos  1,5 a 4,0%
CORREÇÃO DO VALOR DO RETICULÓCITO EM FUNÇÃO DO HEMATÓCRITO
Índice de produção de reticulócitos (IPR) (VR = 1,0)
* Ht normal = 45%
Tempo de maturação dos reticulócitos no sangue periférico
	Ht (%)
	Tempo de maturação do RT em dias
	40-45
	1,0
	35-39
	1,5
	25-34
	2,0
	15-24
	2,5
	Abaixo de 15
	3,0
INTERPRETAÇÃO
O IPR avalia a atividade da medula óssea em responder a quadros necessários de reposição de células vermelhas ou se a mesma não encontra-se proliferativa. 
Ex.: IPR = 3,7 – significa que a produção eritrocitária é de 3,7 vezes maior que a produção normal, produção eritrocitária efetiva. Usado para classificação fisiológica das anemias.
Classificação fisiológica das anemias a partir do cálculo do IPR
	Eritropoiese ineficaz
IPR < 2,0
	Eritropoiese eficaz
IPR > 3,0
	Anemias hipoproliferativas
	Anemias hiperproliferativas
	Doenças de maturação
	Anemias hemolíticas
Contagem diferencial de Leucócitos
Células granulocíticas:
Células agranulocíticas:
PROCEDIMENTO
1. Preparo do esfregaço sanguíneo e coloração;
2. Focalizar com objetiva de 100x (usar óleo de imersão);
3. Proceder a leitura do esfregaço contando e diferenciando os leucócitos, até totalização de 100 células;
4. Registrar a contagem em forma percentual e converter em valores absolutos a partir do resultado obtido na contagem total.
VALORES DE REFERÊNCIA:
Neutrófilos 
50-70%
Bastões
3 a 5%
Segmentados
51 a 67%
Eosinófilos
2 a 4%
Basófilos
0 a 1%
Monócitos
4 a 8%
Linfócitos
21 a 35%
TEMPO DE PROTROMBINA (TAP)
PROCEDIMENTO
1- Pré-aquecer o reagente Nº 1 (Formador de Coágulo) a 37ºC de 4 a 5 minutos (Aquecer somente o necessário para a realização do teste). 
2- Homogeneizar o reagente antes do uso. 
3- Em um tubo limpo pipetar 100 µL do plasma a ser medido (Controles ou Amostras) e incubar a 37ºC, de 2 a 3 minutos (em banho-maria ou blocos térmicos). 
4- Adicionar 200 µL do reagente Nº 1 (Formador de Coágulo), previamente aquecido, ao tubo contendo o plasma e disparar o cronômetro. 
5- Deixar o tubo no aquecimento agitando-o vagarosamente. 
6- Retirar o tubo antes do tempo de coagulação previsto (aproximadamente 9 segundos), observar a formação do coágulo. Parar imediatamente o cronômetro ao se observar a formação do coágulo e registrar o tempo. 
TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA OU K-PTT)
PROCEDIMENTO:
1- Pré-aquecer o reagente o Reagente Nº 2 a 37°C. Este procedimento deve ser realizado apenas com o volume que será utilizado para execução dos testes. O reagente deve permanecer em aquecimento durante todo o procedimento. 
2- Separar os tubos de reação que serão utilizados para execução dos testes. 
3- Pipetar 100 μL da Amostra/Controle no respectivo tubo de reação e préaquecer a 37ºC por 2 minutos em banho-maria. 
4- Pipetar 100 μL do Reagente Nº 1 no tubo da Amostra/Controle e incubar à 37ºC, de 2 a 3 minutos. 
5- Pipetar 100 μL do Reagente Nº 2 (pré-aquecido a 37ºC) no tubo da Amostra/Controle, disparando simultaneamente o cronômetro. 
6- Deixar o tubo no banho-maria a 37°C, agitando suavemente. Manter no banho por cerca de 20 segundos. 
7- Retirar o tubo do banho, inclinar suavemente uma vez por segundo e parar o cronômetro no momento da formação do coágulo. Anotar o tempo de coagulação. 
Tipagem sanguínea
PREPARO DA SUSPENSÃO DE PAPA DE HEMÁCIAS A 5%
(Para realização de tipagem sanguínea e pesquisa de D fraco)
1. Homogeneizar por cerca de 10 minutos o tubo de sangue com EDTA do paciente a ser testado;
2. Retirar uma alíquota de 1mL do sangue com EDTA e centrifugar por 5 minutos a 3500 rpm;
3. Retirar o máximo do plasma, com pipeta de Pasteur, obtendo assim a papa de hemácias (com esse plasma será feito tipagem reversa);
4. Identificar o tubo de hemólise para diluição das hemácias a serem testadas;
5. Prepara uma diluição de hemácias a 5% da seguinte forma: 1 gota de papa de hemácias + 19 gotas de salina.
TIPAGEM SANGUÍNEA – PROVA DIRETA
PROCEDIMENTO:
1. O teste deve ser realizado com a suspensão de papa de hemácias a 5% da amostra;
2. Identificar 5 tubos de hemólise: A, B, AB, Rh (ou D) e Controle Rh;
3. Colocar uma gota de soro: anti A no tubo A, anti B no tubo B, anti AB no tubo AB, anti D no tubo D e Controle Rh no tubo Controle Rh;
4. Adicionar em cada tubo uma gota da suspensão de papa de hemácias a 5% da amostra a ser testada;
5. Homogeneizar e centrifugar os tubos a 1000 rpm por 1 minuto;
6. Com movimentos suaves, deslocar o botão de hemácias no fundo do tubo e avaliar o grau de aglutinação visual.
Importante: colocar primeiro os anti soros e depois a suspensão de papa de hemácias a 5%.
	TUBO
	A
	B
	AB
	Rh (D)
	Controle RhSoro anti A
	1 gota
	-
	-
	-
	-
	Soro anti B
	-
	1 gota
	-
	-
	-
	Soro anti AB
	-
	-
	1 gota
	-
	-
	Soro anti D (anti Rh)
	-
	-
	-
	1 gota
	-
	Controle Rh
	-
	-
	-
	-
	1 gota
	Papa de hemácias 5%
	1 gota
	1 gota
	1 gota
	1 gota
	1 gota
Obs: Quando o tubo Rh (D) não apresentar aglutinação (Negativo), realizar a pesquisa do antígeno D fraco.
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