PCR e Sequenciamento gênico

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PCR e Sequenciamento gênico
Princípio
A PCR possibilita a síntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA-polimerase, a mesma que participa da replicação do material genético nas células.
Esta enzima sintetiza uma sequência complementar de DNA, desde que um pequeno fragmento (o iniciador, ou primer, em inglês) já esteja ligado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o início da síntese.
Os iniciadores definem a sequência a ser replicada e o resultado obtido é a amplificação de uma determinada sequência DNA com bilhões de cópias.
Aplicações
A PCR é utilizada para amplificar, detectar, quantificar sequências específicas de ácidos nucleicos.
Isso abriu enormes perspectivas para a análise de genes, diagnóstico de doenças genéticas e detecção de agentes infecciosos como vírus, bactérias, fungos etc.
Na linha das doenças genéticas, o permanente desenvolvimento de novos protocolos tem permitido a pesquisa de pequenas alterações na sequência de DNA, como, por exemplo, na fibrose cística.
Outras aplicações especialmente úteis para a PCR é a clonagem de um determinado fragmento de DNA, que pode ser um gene e o conhecimento do DNA codificante (cDNA) obtido a partir da molécula de RNA, o que permite o estudo da expressão de genes.
Finalmente, a PCR tem um grande potencial na medicina forense. Sua sensibilidade torna possível utilizar uma amostra bastante pequena (traços mínimos de sangue e tecidos que poderiam conter os restos de somente uma única célula) e ainda se obter uma “impressão digital de DNA” da pessoa da qual a amostra foi coletada, podendo assim fazer comparações com aqueles obtidos de vítimas e/ou suspeitos de casos de infração penal.
Componentes necessários 
· Amostra de DNA a ser testada;
· Par de iniciadores (primers): senso (forward) e antisenso (reverse);
· Nucleotídeos (dNTPs);
· Enzima Taq DNA polimerase;
· Solução tampão, água e cloreto de magnésio.
	
Equipamento
O equipamento utilizado é chamado de Termociclador.
Ele possui um bloco térmico com espaços para os tubos das reações.
Esse equipamento aumenta e diminui a temperatura de acordo com a programação que foi feita pelo utilizador.
Ciclagem
Geralmente a PCR consiste em uma série de 20 a 40 ciclos de mudanças na temperatura.
Cada ciclo comumente possui 2 ou 3 etapas. São elas:
· Desnaturação
· Anelamento
· Extensão
Desnaturação
A temperatura elevada (geralmente acima de 90ºC) separa a cadeia dupla de DNA, devido ao rompimento das pontes de hidrogênio.
As ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose (ligações covalentes e mais fortes) permanecem intactas.
Anelamento
A temperatura normalmente encontra-se entre 50°C e 65°C, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. 
Os iniciadores (os primers) ligam-se às extremidades da sequência alvo, marcando onde deverá ocorrer a amplificação do DNA.
Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação.
Extensão
Após a ligação dos primers (anelamento) às sequências complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72ºC e a enzima Taq DNA polimerase inicia a replicação das novas fitas de DNA. 
O processo de síntese é iniciado no local onde estão ligados os primers. A Taq polimerase incorpora os nucleotídeos complementares à sequência alvo utilizando os dNTPs que foram adicionados no preparo da reação.
Revelação
Finalizada a PCR, o próximo passo é detectar a presença de produtos amplificados. 
Em geral, isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose (corado com brometo de etídio, ou corante similar) ou poliacrilamida (corado pelo nitrato de prata).