Analise microbiologica da água

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Análise microbiológica da água
Spread-plate
A primeira técnica consiste em sucessivas diluições da amostra, e que em cada diluição é espalhada em duas placas de Petri contendo meio de cultura 
0,1 ml da amostra → isolamento quanto para contagem de microrganismos.
Pour-plate
(bactérias anaeróbicas, crescem por baixo e faz buracos nesse meio, b-hemoliticas, degrada grupo M no ágar sangue)
Meio de cultura o ágar fundido que permite o crescimento não só ao longo da superfície como no interior do ágar. É adicionado 1,0 ml da amostra no fundo de uma placa estéril e em seguida adicionado o ágar, ainda líquido, mantido a cerca de 40-45°C. 
A homogeneização do inoculo é feita com movimentos suaves em forma de “8” sobre a bancada.
É preciso garantir que o meio não solidifique antes da homogeneização nem fique muito quente para não matar as células microbianas
Isolamentos: meios de cultura
Ágar MacConkey: Meio seletivo, contendo bile, para isolamento de enterobactérias e outras bactérias gram-negativas
Agar Manitol: Meio seletivo, contendo alto teor de NaCl, para isolamento de Staphylococcus
Agar nutriente: Meio básico de isolamento, também utilizado para contagem de células bacterianas
Agar sangue: Meio enriquecido que favorece o crescimento da maioria das bactérias patogênicas (hemolíticas)
Estimativa de Número
Podemos fazer análise das formas mais variadas possíveis, mas sempre os objetivos é estimar o número que represente a presença de microrganismo no local. 
1. Meio sólidos
Semeadura em superfície (spread-plate)
Semeadura em profundidade (pour plate)
Contagem em placa 
2. Tubos múltiplos – Número mais provável (NMP) (principal forma de identificar coliformes na água, INTOLERAVEL)
3. Contagem microscópica direta
Meios sólidos
Tem como objetivo nos mostrar UFC – unidades formadoras de colônia. 
Uma bactéria (ou pequeno agregado) cresce e se multiplica formando uma colônia. 
É necessário fazer uma diluição seriada antes da semeadura para conseguir identificar colônias separadas. 
Placas com 30 a 300 colônias. 
Vantagens: todas as células são viáveis
Desvantagem: tempo, 24h a 48h necessárias. 
Exemplo de cálculo: 
Uso a diluição 1:10.000 
Encontramos 32 colônias
Nº de bact. = nº de colônias x índice de diluição da amostra
Nº de bact.. = 32 x 10.000
Nº de bact.. = 320.000 células bactérias por mL
 
Contagem indireta – NMP
A técnica do NMP é uma forma de se ESTIMAR o número de microrganismos presentes na amostra. É baseada na probabilidade estatística de certo número de microrganismos estarem presentes na amostra quando uma série de resultados positivos ocorre.
Esta estimativa é obtida pelo preparo de diluições decimais sucessivas e a transferência de porções pequenas para uma serie de 3 ou cinco tubos contendo meio de cultura adequada. 
No caso da análise de coliformes o resultado positivo é identificado pela presença de gás no interior do tubo invertido (tubo de Durhan), contido no interior do tubo com meio de cultura. 
Primeiro colocar o tubo invertido, depois o meio de cultura. 
Bolha de gás é indicativo de positivo para coliformes.
“Quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para reduzir a densidade até um ponto no qual mais nenhuma bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada”
Materiais: 
 Tubos Falcon com tubo de Durhan invertido no interior 
 Caldo Lauril-Sulfato-Triptose (indicativo presuntivo) 
Etapa confirmatória:
 Caldo Bili Verde Brilhante (BVB) (separa o que não é coliformes, e positivo para coliformes totais) 
 Caldo EC (positivo coliformes fecais)
ETAPA PRESUNTIVA: Inocular amostra em 3 séries de 5 tubos com caldo Lauril-Sulfato-Triptose 
 1ª Série: Caldo Lauril-Sulfato-Triptose diluição x2 (dobrado) + 10mL da amostra 
(Diluição 1:1) 
2ª Série: Caldo Lauril-Sulfato-Triptose diluição simples + 1mL da amostra (Diluição 1:10) 
3ª Série: Caldo Lauril-Sulfato-Triptose diluição simples + 0,1mL da amostra (Diluição 1:100) 
Homogeneizar e encubar em estufa a 35°C por 24h/48h (agitador vórtex)
Tubos com conteúdo turvo, cor escura e presença de gás = Provavelmente positivos para COLIFORMES TOTAIS
ETAPA CONFIRMATÓRIA: Inocular c/ alça de platina conteúdo dos tubos positivos na etapa presuntiva em tubos contendo caldo BVB. (não cresce gram-positiva)
Homogeneizar e encubar em estufa a 35°C por 24h/48h 
Tubos com presença de gás no tubo Durhan invertido = Confirmada presença de COLIFORMES TOTAIS 
Anotar número de tubos positivos em cada uma das séries de diluições realizadas na etapa presuntiva.
ETAPA CONFIRMATÓRIA PARA COLIFORMES FECAIS/TERMOTOLERANTES: Inocular c/ alça de platina conteúdo dos tubos positivos na etapa presuntiva em tubos contendo caldo EC. Homogeneizar e encubar em estufa a 45°C por 24h/48h 
Tubos com presença de gás no tubo Durhan invertido = Confirmada presença de COLIFORMES FECAIS/TERMOTOLERANTES Anotar número de tubos positivos em cada uma das séries de diluições realizadas na etapa presuntiva.
Quantificar estimativamente a densidade de bactérias presentes na amostra: 
Observe a combinação de tubos positivos nas etapas confirmatórias de acordo com a diluição realizada na etapa presuntiva. 
Com o número da combinação, compare com o valor presente na tabela “Índice de NMP”. 
 EXEMPLO:
0-0-0 = <1,8 NMP/100ml NEGATIVO 
5-3-1 = 110 NMP/100mL
Escala nefelométrica de Mc Farland
(comparação de turvação por olho, ou espectrofotômetro – mais indicado)
Padrão de turvação mais frequentemente utilizado nos laboratórios de microbiologia, para determinar a intensidade da multiplicação em meios de cultivo líquidos.
Assim o tubo no 5 corresponde a 1.5 bilhões (1.500.000.000 = 1,5 x 10e9) de bactérias por mL de meio e o tubo no 10 corresponde a 3 bilhões de bactérias por mL de meio.
Contagem microscópica direta
Muito usado, e dá um valor numérico estimativo muito bom. 
Usa uma câmara de contagem
Vantagens: rápido e prático
Desvantagens: conta células mortas, bactérias móveis, alta concentração de microrganismos
Como funciona: 
1. Suspensão bacteriana é adicionada e preenche o volume raso sobre os quadrados por capilaridade
2. É feito um corte transversal, onde pode ser calculado profundidade x área
3. Contagem onde todas as células em vários quadrados grandes são contadas e os números são utilizados para calcular uma média. Ex: 14 células em um quadrado grande
4. O volume liquido sobre o quadrado grande é de 1/1.250.000 de mililitros. Se contem 14 células, temos 14 x 1.250.000 = 17.500.000 células em um mililitro
Atividade
Calcule o crescimento microbiano das questões à seguir:
Nf = N0 x 2 n 
Nf = Número Final 
N0 = Número Inicial de Células Contaminantes 
n = Número de gerações 
Tempo de incubação (horas) / Tempo de geração (horas)
1. Em um prato pronto servido como refeição em uma empresa, houve contaminação acidental do arroz com 1500 células de Bacillus cereus. Considerando que o tempo de geração desta bactéria nas condições em que ficou armazenado o prato é de 60 minutos. Quantas células estarão presentes na refeição no momento do consumo, 8 horas após ter ocorrido a contaminação?
Nf = N0 x 2n
No = 1500
N = 8h tempo de incubação/ 1h tempo de gerações 
Nf = 1500 x 2 8
Nf = 1500 x 256
Nf = 384,000 células 
2. Durante o preparo de um creme hidratante para o corpo, utilizando somente matérias primas sintéticas, ocorreu contaminação acidental com 5000 células de Staphylococcus epidermidis. Seguindo o que regulamenta a legislação, após o preparo/manipulação de produtos farmacêuticos e cosméticos, algumas amostras representativas de lote devem ser destinadas ao controle de qualidade para avaliação e garantia de sua qualidade. Assim, algumas amostras foram enviadas para análise em laboratório de referência, que realizou todas as análises pertinentes, exigidas pela legislação para o produto em questão. O tempo de geração desta bactéria em condições ideais é de cerca de 20 minutos, mas no produto em questão foi de cerca de 6 dias. Considerando que no primeiro dia após a produçãodo produto houve perda de 20% na carga microbiana em função da adaptação do microrganismo às condições ambientais, responda ao que se pede:
Quantas células microbianas deverão estar presentes no creme após um mês (30 dias), intervalo de tempo entre a produção e as análises realizadas pelo controle de qualidade?
N0 = 5000 – 20% = 4000
Temp. geração 6 dias / temp. de inc. 30 dias
N = 30/6 = 5 gerações
Nf = 4000 x 2 5
Nf = 4000 x 32
Nf = 128,000 células
3. Considere que, após lavar suas mãos, restaram na barra nova de sabonete algumas células bacterianas. Após um período de 24 horas em que as bactérias permaneceram no sabonete foi realizada uma contagem de bactérias. Foi então diluído, através de diluições seriadas, 1g de sabonete. 1 ml de cada uma destas diluições foi semeado em meio sólido. Após 24 horas de incubação, realizou-se a contagem utilizando-se para tal, a placa referente a diluição 1: 1.000.000 e foram contadas 540 colônias
540 colônias x 1.000.000 = 540.000.000 bactérias presentes na amostra de sabonete
4. Na análise da qualidade microbiológica do leite são realizadas algumas determinações como contagem padrão, determinação de coliformes totais e fecais e pesquisa de Salmonella sp. Na contagem padrão foram contadas 180 colônias na placa referente à diluição1: 10.000.
180 colônias x 10.000 = 1.800.000 bactérias presentes na placa 
5. Você realizou um trabalho de pesquisa para avaliar a contaminação de sabonetes líquidos em UTIs de hospitais. Para verificar o nível de contaminação, realizou-se a técnica de contagem padrão. Nesta técnica, 10 mL da amostra foram homogeneizadas em 90 mL de meio de cultura adequado, a partir desta primeira diluição foram feitas diluições seriadas até a diluição 1: 106 . Alíquotas de 0,1 mL de cada diluição foram semeadas na superfície de um meio sólido para contagem das colônias. Após 24 horas de incubação, realizou-se a contagem utilizando-se para tal placa referente à última diluição em que foram contadas 80 colônias.
80 colonias x 10 6 = 80.000.000