Organização Gênica e ferramentas moleculares

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MEDICINA VETERINÁRIA - EMILLY S. FERREIRA DA SILVA
GENÉTICA - AVD
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Organização GênicaOrganização GênicaOrganização Gênica
No DNA existem quatro tipos de bases nitrogenadas:
» Adenina (A)
» Guanina (G)
» Citosina (C)))
» Timina (T)
As bases nitrogenadas são compostos químicos que possuem ni-
trogênio em sua composição. Elas, juntamente com um açúcar e áci-
do fosfórico, formam o ácido ribonucleico (RNA) e o ácido desoxir-
ribonucleico (DNA), encontrados nas células dos seres vivos.
EXPRESSÃO GÊNICA E SEU CONTROLE EMEXPRESSÃO GÊNICA E SEU CONTROLE EMEXPRESSÃO GÊNICA E SEU CONTROLE EM
PROCARIONTES E EUCARIONTESPROCARIONTES E EUCARIONTESPROCARIONTES E EUCARIONTES
Se nós, humanos (Homo sapiens), partilhamos cerca de 98,7% dos
genes dos macacos bonobos (Pan paniscus), como somos tão
diferentes?
-Essa diferença ocorre pela expressão de nossos genes. Apesar de
sermos geneticamente parecidos, fenotipicamente somos muito dife-
rentes. O DNA contém a "receita" de cada indivíduo, e compartilhamos
parte de nosso DNA com muitos animais (e até com vegetais).
ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVEISELEMENTOS GENÉTICOS MÓVEISELEMENTOS GENÉTICOS MÓVEIS
São 3 os tipos de elementos genéticos móveis:
plasmídeos, fagos e elementos transponíveis/transposons.
são fragmentos de DNA que podem se mover para novas localizações
do cromossomo e geralmente produzem cópias de si mesmos no pro-
cesso. Esse mecanismo, conhecido como transferência horizontal de
genes, é mais frequente nos organismos unicelulares, por exemplo,
bactérias.
GENOMAGENOMAGENOMA
é a sequência completa de DNA (ácido desoxirribonucleico) de um or-
ganismo, ou seja, o conjunto de todos os genes de um ser vivo.
Estudar o genoma é como estudar a anatomia molecular de uma es-
pécie. O genoma bacteriano é pequeno e se encontra no citoplasma,
pois não existe a carioteca (membrana que separa o núcleo do cito-
plasma da célula). As informações genéticas das bactérias estão conti-
das em um único cromossomo. Outras informações também são encon-
tradas em plasmídeos, transpósons e integrons.
Duplicação de uma bactéria e seuDuplicação de uma bactéria e seuDuplicação de uma bactéria e seu
 plasmídeo. plasmídeo. plasmídeo.
Os plasmídeos são pequenos fragmentos de DNA circular com capacida-
de de se duplicar independentemente. Em geral, apresentam poucos
genes. Os plasmídeos contêm informação genética que não costuma
ser essencial para a sobrevivência da bactéria. Estão relacionados,
normalmente, com alguma função adaptativa para situações especiais.
Processo de conjugação entre bactérias.Processo de conjugação entre bactérias.Processo de conjugação entre bactérias.
Os plasmídeos podem ser conjugativos, que podem trocar seu material
genético com outra bactéria, e não conjugativos, os quais não permi-
tem o início da conjugação. Na figura, podemos observar o processo
de conjugação. A bactéria à esquerda contém um plasmídeo conjugati-
vo, o qual tem genes para realizar a conjugação. Já a bactéria à direi-
ta não tem o plasmídeo conjugativo. A conjugação pode ocorrer entre
as bactérias, desde que apenas uma tenha o plasmídeo conjugativo
A conjugação é o processo de transferência do DNA de uma bactéria
para outra, envolvendo o contato entre elas.
. Existem, além desses dois, outros tipos de plasmídeos, como o grupo
de plasmídeos denominado fator R, que significa resistência bacteriana
a alguns antibióticos. Um plasmídeo pode transportar a informação
que determina a capacidade de um micro-organismo ser causador de
doença. Os outros tipos de plasmídeos são:
 F (sexual ou fertilidade), V (virulência) e M (metabólico).
obs:
Os transpósons, assim como os plasmídeos, são um conjunto de seg-
mentos lineares encontrados no DNA cromossômico. Além de realocar
ou introduzir cópias de si mesmos no genoma, eles têm a capacidade
de inativar, levar a uma mutação e, até mesmo, quebrar uma sequência
de um gene, independentemente de haver correlação entre a região
genômica onde se encontram inseridos e o local ao qual se destinam
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BACTÉRIAS E GENES DE RESISTÊNCIASBACTÉRIAS E GENES DE RESISTÊNCIASBACTÉRIAS E GENES DE RESISTÊNCIAS
As bactérias conferem resistências umas às outras pela capacidade de
transmissão de seu material genético entre elas. Quando uma bactéria
sofre a ação de um antibiótico ou um anticorpo, ela pode transmitir
essa sua "experiência" para uma nova bactéria. Essa nova bactéria
torna-se mais preparada para novos ataques
A comunicação entre as bactérias é o principal mecanismo de resistên-
cia a antibióticos. A causa primária de resistência bacteriana é seu al-
to poder de mutação espontânea e sua capacidade de recombinar seu
próprio material genético, possível de ser transmitido durante a repli-
cação bacteriana.
Além disso, os transpósons podem mover genes do DNA do cromosso-
mo para o DNA extracromossômico, que é o plasmídeo. Esse plasmídeo,
agora com novas informações do DNA, poderá ser transmitido para
outra bactéria. A figura a seguir mostra como ocorre a incorporação
de genes em um plasmídeo.
O plasmídeo contendo um ou mais transpósons de genes de resistência
é considerado plasmídeo R (de resistência). Os antibióticos são com-
postos que destroem as bactérias ou que interferem em seu metabo-
lismo, sem causar dano ao hospedeiro. Os antibióticos bactericidas
atuam na parede celular ou membrana plasmática das bactérias, impe-
dindo sua formação e, consequentemente, levando a destruição da
bactéria. Os antibióticos bacteriostáticos atuam impedindo a multiplica-
ção e proliferação bacterianas. Esses antibióticos podem agir no DNA
bacteriano e na replicação, transcrição e tradução bacterianas.
resistencia a antibioticoresistencia a antibioticoresistencia a antibiotico
O uso indiscriminado de antibióticos permitiu que as bactérias reco-
nhecessem essas substâncias e se prevenissem da ação desses medi-
camentos. Hoje vemos patógenos cada vez mais resistentes aos
antibióticos. Por esse motivo, usamos o teste de
sensibilidade antimicrobiana (TSA).
Nesse teste, é possível conhecer a bactéria causadora da infecção e
determinar qual o antibiótico mais indicado para eliminá-la ou deter
seu crescimento. A figura a seguir mostra bactérias verdes que não
se multiplicaram, indicando que são sensíveis ao antibiótico utilizado, e
bactérias amarelas que cresceram,
indicando que são resistentes ao antibiótico.
O uso indiscriminado de antibióticos permitiu que as
bactérias reconhecess
em
ess
por que precisa saber sobre a resis-
tência a antibióticos?
Na agropecuária, utilizamos algumas classes de antibióticos como me-
lhoradores de desempenho na ração de
animais, sejam eles bovinos, suínos ou aves. Não conhecemos os meca-
nismos de transmissão desse material genético resistente entre a
proteína animal e os humanos. Esse caminho de transmissão de micro-
organismos resistentes ainda é desconhecido.
Para a prevenção do uso indiscriminado de antibióticos, há, no Brasil,
o Programa Nacional de Prevenção e
Controle da Resistência aos Antimicrobianos na Agropecuária (Agro-
Previne),
as substâncias e se prevenissem da ação desses medicamentos. Hoje
vemos patógenos cada vez mais resistentes aos antibióticos. Por esse
motivo, usamos o teste de sensibilidade antimicrobiana (TSA
A s é o principal mecanismo de resistência a antibióticos. A causa pri-A s é o principal mecanismo de resistência a antibióticos. A causa pri-A s é o principal mecanismo de resistência a antibióticos. A causa pri-
mária de resistência bacteriana é seu alto poder de mutação espontâ-mária de resistência bacteriana é seu alto poder de mutação espontâ-mária de resistência bacteriana é seu alto poder de mutação espontâ-
nea e sua capacidade de recombinar seu próprio material genético,nea e sua capacidade de recombinar seu próprio material genético,nea e sua capacidade de recombinar seu próprio material genético,
possível de ser transmitido durante a replicação bacteriana. Os trans-possível de ser transmitido durante a replicaçãobacteriana. Os trans-possível de ser transmitido durante a replicação bacteriana. Os trans-
pósons codificam as transposases responsáveis por clivar o DNA dopósons codificam as transposases responsáveis por clivar o DNA dopósons codificam as transposases responsáveis por clivar o DNA do
hospedeiro, consubstanciando a invasão bacteriana.hospedeiro, consubstanciando a invasão bacteriana.hospedeiro, consubstanciando a invasão bacteriana.
A comunicação entre as bactérias é o principal me-
canismo de resistência a antibióticos. A causa pri-
mária de resistência bacteriana é seu alto poder de
mutação espontânea e sua capacidade de recombi-
nar seu próprio material genético, possível de ser
transmitido durante a replicação bacteriana. Os
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transpósons codificam as transpos
Ferramentas Moleculares
O conhecimento da Biologia Molecular estuda o DNA das
diferentes espécies animais. Hoje podemos manipular o
DNA de várias maneiras, por eliminação de um gene, adição
de um gene de uma espécie diferente, ou reconhecimento
de um gene ruim, também chamado de deletério
clonagem molecularclonagem molecularclonagem molecular
Os transpósons, assim como o
uA clonagem refere-se a uma cópia geneticamente exata, seja ela
de um organismo inteiro, ou seja ela de apenas uma parte do DNA.
A clonagem molecular, também chamada de técnica do DNA recombinan-
te, permite selecionar uma parte do DNA e replicá-lo em muitas cópias.
Essa técnica somente se tornou possível com o desenvolvimento das
enzimas de restrição (endonucleases de restrição) e de ligação (DNA-
ligase). Enquanto as endonucleases de restrição são capazes de clivar
a molécula de DNA em pontos específicos, as DNA-ligases unem frag-
mentos de DNA
Dessa forma, depois de selecionar o gene de interesse, utilizamos as
enzimas de restrição, que cortam o fragmento de DNA onde se locali-
za o gene selecionado. Esse fragmento é então inserido em um vetor,
geralmente um plasmídeo. O fragmento do gene-alvo une-se ao DNA do
vetor, por meio da DNA-ligase, e forma o plasmídeo recombinante con-
tendo o gene que selecionamos.
A molécula de DNA recombinante produzida é introduzida em um orga-
nismo hospedeiro, podendo consistir em replicadas, processo chamado
de transformação.
sequencia:
Isolar o gene de interesse; unir o gene ao vetor; transformar;
selecionar os clones recombinantes; e multiplicar o gene
Exemplos de células hospedeiras
são as bactérias Escherichia coli e Bacillus subtilis e a levedura
Saccharomyces cerevisiae. Algumas células transformadas devem ser
separadas das células normais, as quais não contêm o gene exógeno
obs
As bactérias produzem grandes quantidades de proteína expressa pe-
lo gene. Se fosse o gene da insulina humana, por exemplo, as bactérias
produziriam muitas moléculas de insulina. Depois, essas moléculas seri-
am purificadas, e teríamos como produto a insulina.
PROJETO GENOMA ANIMALPROJETO GENOMA ANIMALPROJETO GENOMA ANIMAL
O Projeto Genoma Humano o objetivo era descobrir a exata sequência
de bases do genoma das células humanas Para o mapeamento, são fei-
tos diagramas descritivos de cada cromossomo, dividindo-os em frag-
mentos menores, ordenados em suas respectivas posições nos cro-
mossomos. O passo seguinte é determinar a sequência das bases de
cada um dos fragmentos ordenados, a fim de descobrir todos os ge-
nes na sequência do DNA. Um mapa genômico descreve, ainda, a ordem
dos marcadores e o espaçamento entre eles, em cada cromossomo
MARCADORESMARCADORESMARCADORES
O marcador molecular é uma sequência do DNA que é diferente entre
os organismos estudados. Essa diferença é chamada de poliformismo,
que é o estudo das diferenças entre os genes. Por exemplo, as
cores das pelagens dos cachorros são controladas basicamente por
quatro tipos diferentes de genes principais. Se são somente quatro
genes, como temos uma variação cromática enorme da pelagem em
cães? Cada um desses genes pode apresentar uma quantidade ou uma
sequência diferente das letrinhas que os compõem, os alelos. Os ale-
los são versões do mesmo gene e, exatamente por esse
fato, ao cruzar dois cachorros de duas cores, os filhotinhos gerados
podem apresentar cores não encontradas nos país.
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REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASEREAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASEREAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE
o bioquímico Kary Mullis desenvolveu uma técnica
a reação em cadeia de polimerase (PCR).
A PCR é uma técnica que permite copiar pedaços de DNA, o que tam-
bém chamamos de amplificação do DNA. Com isso, em laboratório, po-
demos realizar de maneira mais rápida as cópias de trecho do
DNA do que com o uso de células transformadas (por exemplo, as bac-
térias com o DNA recombinante).
Para essa técnica, utilizamos um equipamento chamado termociclador,
que realiza ciclos de temperaturas
para induzir a formação das cópias de DNA. No termociclador, a fita
dupla de DNA se abre quando a
temperatura está entre 94 °C e 96 °C − essa fase é chamada de des-
naturação. Depois da abertura, os primers reconhecem a sequência a
ser estudada por pareamento (identificam as bases do DNA-molde) e
se ligam ao DNA-molde quando o termociclador está com temperatura
em torno de 50°C (dependendo do
primer) − essa fase é chamada de anelamento. Por fim, o termocicla-
dor realiza a fase chamada extensão, em
que a enzima Taq-DNA polimerase se liga aos primers, reconhece as
bases e coloca as dNTPs complementares.
PRIMERSPRIMERSPRIMERS
Primers são segmentos de ácidos nucleicos, com um a sessenta ribonu-
cleotídeos, necessários à iniciação da replicação do DNA.
DNTPS COMPLEMENTARESDNTPS COMPLEMENTARESDNTPS COMPLEMENTARES
Os desoxirribonucleosídeos trifosfatados compõem-se de uma base
azotada (adenina, citosina, guanina e timina), um açúcar (desoxirribose)
e três grupos fosfato. Formam dATP, dCTP, dGTP, ou dTTP,
conforme a base usada. É o início das novas cadeias formadas durante
o PCR. Aplicamos a técnica de PCR para: estudo do padrão de expres-
são gênica; seleção de clones recombinantes;
detecção de mutações em genes específicos; estudos diagnósticos de
doenças infecciosas e detecção de bactérias, vírus e protozoários pa-
rasitas; elucidação de relações evolutivas entre espécies, com a utili-
zação de material arqueológico; e investigação de crimes (Medicina Fo-
rense).
HIBRIDIZAÇÃOHIBRIDIZAÇÃOHIBRIDIZAÇÃO
Um exemplo da utilização da hibridização é a genotipagem de bovinos, a
qual rastreia 500 mil posições
variáveis na configuração genética de cada vaca. Por meio desse pro-
cesso, os cientistas poderão registrar
com precisão a estrutura das células, ajudando-as a determinar carac-
terísticas hereditárias, como fertilidade,
produção de leite e qualidade da carne em vacas individuais.
CRISPR-CAS9CRISPR-CAS9CRISPR-CAS9
abreviação de repetições palindrômicas curtas agrupadas com intera-
ções regulares e
proteína 9 associada a CRISPR – é uma técnica recente para a edição
do genoma. Ela é mais barata, mais
precisa e mais eficiente do que outros métodos de edição de genoma
existentes. é utilizada para cortar o DNA onde podemos inserir ou ex-
cluir pedaços do material genético e fazer a edição do DNA com uma
sequência personalizada, usando a própria máquina de reparo de DNA
da célula
	Organização Gênica
	EXPRESSÃO GÊNICA E SEU CONTROLE EM PROCARIONTES E EUCARIONTES
	ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVEIS
	PROJETO GENOMA ANIMAL