Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
Relatório de aulas práticas Microbiologia e Micologia Clínica CURSO: Farmácia NOME DO ALUNO: Renata Antoniolli Reis R.A: 2055737 POLO: Lapa 1. Introdução A palavra Microbiologia é originada do grego: mikros (“pequeno”), bios (“vida”), e logos (“ciência”). Essa Ciência abrange o estudo dos organismos microscópicos e suas atividades biológicas, que compreendem as diversas formas e estruturas, atividade reprodutiva, aspectos bioquímicos e fisiológicos, e a interações entre si e com hospedeiros. A Microbiologia investiga os organismos microscópicos unicelulares, em que todos os processos vitais são realizados numa única célula. A Micologia, por sua vez, contempla o estudo dos fungos, organismos eucariontes quimio-heterotróficos, classificados em reino separado ao reino vegetal a partir de 1969. São seres em sua maioria aeróbios, podendo ser uni ou multicelulares, tendo variadas formas de reprodução (sexuada, assexuada ou parassexuada) e diversos habitats possíveis. Os fungos são seres de notável importância, desempenhando o papel crucial da mineralização do carbono orgânico da natureza. Neste relatório serão abordadas diversas técnicas de análises laboratoriais como: Quantificação Bacteriana – Contagem em Placa; Antibiograma; Provas Bioquímicas; Urocultura Quantitativa e Qualitativa; Visualização de Fungos Filamentosos; Diagnóstico dos cocos Gram positivos; Coloração de Gram e Revisão de Morfologia Bacteriana e de Leveduras; Semeadura bacteriana; Preparo de Meio de Cultura: Meio Sólido e Discussão de Casos Clínicos. 2. Aula 1 Roteiro 1 - Quantificação Bacteriana – Contagem em Placa 2.1 Aspecto gerais A contagem de colônias de microrganismos em placas de Petri com meios de cultura, é um dos métodos mais utilizados em análises laboratoriais. Tal método é adequado para determinar o tamanho de uma população de bactérias. https://www.prolab.com.br/produtos/materiais-de-plastico/placa-de-petri-descartavel https://www.prolab.com.br/produtos/meios-de-cultura/ https://www.prolab.com.br/produtos/meios-de-cultura/ 2.2 Objetivo Nesta aula prática será utilizado o método de contagem em placa, que se baseia em três princípios: cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma única bactéria; o inóculo original é sempre homogêneo e não existem agregações de células. Como normalmente as populações bacterianas são muito grandes, devemos fazer diluições decimais seriadas. 2.3 Procedimento 1. Foram identificados 9 tubos de ensaio estéreis, contendo 9ml de solução salina ( 10−1, 10−2, 10−3, 10−4, 10−5, 10−6, 10−7, 10−8, 10−9); 2. Após a homogeneização do tubo de cultura contendo Escherichia coli, foi transferida 1 ml da amostra, para o tubo de salina identificado 10−1 , com auxílio de uma pipeta estéril; 3. Após a homogeneização do tubo 10−1, contendo salina e cultura Escherichia coli, foi transferido 1ml para o tubo identificado 10−2; 4. O procedimento 3, foi repetido até o último tubo (diluições sucessivas); 5. Foram transferidos 1ml de cada solução em placas de Agar Mac Conkey; 6. As placas foram levadas para estufa a 37 °C. Foto 1 - Diluições sucessivas Fonte: Autoria própria Foto 2 – Placas de Petri com Agar Mac Conkey (semeadas Escherichia coli) Fonte: Autoria própria 2.4 Conclusão Após a análise, pôde-se concluir que houve diminuição da população bacteriana. 3. Aula 1 Roteiro 2 – Antibiograma 3.1 Aspectos gerais O antibiograma é um teste que determina padrões de resistência ou susceptibilidade de uma bactéria específica a vários antimicrobianos (antibióticos ou quimioterápicos). A partir da utilização de material biológico contaminado pelo microrganismo, realiza-se a análise, que direcionará a escolha terapêutica. 3.2 Objetivo O antibiograma se constitui da principal prova microbiológica. Essa prova direciona o tratamento antimicrobiano das infecções. 3.3 Procedimento 1. Em uma placa de Petri, contendo Agar Muller Hunton, foram semeadas bactérias com a técnica de espalhamento, com o auxílio de um swab; 2. Com uma pinça, foram adicionados a placa, discos de antibiogramas sobre o meio (4 antibióticos específicos); 3. As placas foram levadas para a incubadeira, por 24-48h. Foto 3: Placa de Petri contendo Agar Muller Hunton Fonte: autoria própria Foto 4: Potes contendo discos de antibióticos Fonte: autoria própria Foto 5: Placas de Petri semeadas com bactéria, contendo discos de antibióticos, após incubação por 24h Fonte: Autoria própria 3.4 Conclusão Após incubação das placas de Petri contendo os discos de antibióticos, foi observada a inibição do crescimento bacteriano. 4. Aula 2 Roteiro 1 - Provas Bioquímicas 4.1 Aspectos gerais As Provas Bioquímicas são técnicas que auxiliam o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras, através da verificação das transformações químicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado microrganismo. 4.2 Objetivos As provas bioquímicas são essenciais para o diagnóstico e a identificação das bactérias patológicas. A interpretação dos resultados dessas provas bioquímicas permite ao profissional identificar os microrganismos. 4.3 Procedimento 4.3.1. Prova de TSI 1. Foram semeadas bactérias (bacilos Gram negativos previamente semeados em tubo de ensaio, em meio líquido) por picada e estrias na superfície do meio TSI; 2. Foram levadas para incubadora por 24h; 3. Depois desse período, foram realizadas as análises. Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha), fermentação apenas da glicose. Cilindro ácido (amarelo) e rampa ácida (amarela), fermentação de lactose e glicose. Produção de gás: observa-se se houve fratura no meio. Foto 6: Tubos de ensaio contendo meio de cultura TSI Fonte: autoria própria Foto 7: Tubos de ensaio semeados. Fonte: autoria própria Foto 8: Tubos de ensaio após 24h de incubação. Fonte: autoria própria 4.3.2 Verificação do uso da lactose. 1. Foram semeados bacilos Gram negativos em placas com Agar Mac Conkey; 2. Levadas para incubadora a 37° por 48 horas; 3. Após esse período foram realizadas as análises. Lactose positiva – rosa (fermenta lactose) Lactose negativa – branca (não fermenta lactose) Foto 9: Placas de Petri contendo Agar Macconkey, semeadas. Fonte: autoria própria Foto 10: Placas de Petri semeadas, após 24h de incubação Fonte: autoria própria 4.4 Conclusão As análises realizadas evidenciaram a fermentação de glicose e lactose na prova de TSI, e a fermentação de lactose na prova de verificação do uso de lactose. 5. Aula 2 Roteiro 2 - Urocultura Quantitativa e Qualitativa 5.1 Aspectos gerais A urocultura é um exame que tem por objetivo a detecção do tipo de bactéria, a quantidade presente (mensurada por unidades formadas de coluna por ml de urina) e resposta a antibióticos (através da realização de um antibiograma). 5.2 Objetivo Aplicação da técnica de urocultura quantitativa e qualitativa. 5.3 Procedimento 5.3.1 Bacterioscopia de Amostra Centrifugada 1. Cerca de 5ml da amostra de urina, foram centrifugados a 2.500 rpm durante 10 minutos, sendo o sobrenadante desprezado; 2. Com o sedimento, foi preparado o esfregaço em lâminas de vidro, utilizando uma pipeta e ponteira de 0,1 ml. Após a secagem das lâminas em bico Bunsen, estas foram levadas para corar pela técnica de gram. Foto 11,12 e 13: Centrifugação da amostra (urina), amostra sendo depositada em lâmina de vidro e seca com auxílio de bico de Bunsen. Fonte: autoria própria Foto 14: coloração de Gram Fonte: autoria própria 5.3.2 Bacterioscopia de Amostra Não Centrifugada 1.O frasco contendo a amostra de urina foi homogeneizado; 2. Com o auxílio de pipeta e ponteira estéril, foi retirado 0,1 ml da amostra e dispensado em lâmina de vidro; 3. Após a secagem da lâmina em bico de Bunsen, esta foi levada para coloração, utilizando a técnica de Gram. Foto 15: Amostra sendo depositada e lâmina de vidro, e seca com auxílio de bico de Bunsen Fonte: autoria própria Foto 16: coloração de Gram. Fonte: autoria própria Foto 17: Visualização microscópica Fonte: autoria própria 5.3.3 Cultura Quantitativa e Qualitativa 1. A amostra de urina 1/100 foi diluída em 10ml de solução fisiológica estéril, utilizando um tubo de ensaio; 2. Foi retirado 0,1 ml da solução fisiológica e adicionado 0,1 ml da amostra de urina homogeneizada; 3. Com o auxílio de uma pipeta estéril, foi retirado 0,1 ml dessa diluição, e dispensando sobre a superfície de uma placa de Petri contendo Agar Macconkey; 4. Com a alça de Drigalski flambada e esfriada, o inóculo foi espalhado de forma homogênea por toda a superfície; 5. A placa foi identificada e levada para incubadeira a 37°C por 24h. Foto 18,19 e 20: Amostra sendo dispensada na placa de Petri, amostra em placa de Petri com Agar Macconkey, amostra sendo homogeneizada em movimento circulares. Fonte: autoria própria 5.4 Conclusão Não foi evidenciada a presença de bactérias na primeira e na terceira análises realizadas. No entanto, a segunda análise revelou a presença de células epiteliais e diferentes células bacterianas provenientes da microbiota. 6. Aula 2 Roteiro 3 - Visualização de Fungos Filamentosos 6.1 Aspectos gerais Os fungos filamentosos, também denominados mofos ou bolores, são seres pluricelulares, de reprodução assexuada através da esporulação e germinação de esporos. São conhecidos pela maioria das pessoas como deteriorantes de alimentos. A principal diferença entre fungos filamentosos e leveduras se dá na quantidade de células em sua formação. Os Fungos Filamentosos possuem estrutura multicelular, ao passo que os Fungos leveduriformes são unicelulares. 6.2 Objetivo Aprender a identificar a estrutura de fungos filamentosos. 6.3 Procedimento 1. Com o auxílio da alça de platina, foi retirada uma parte de colônia de fungo filamentoso, cultivada previamente em placa de Petri; 2. A amostra foi espalhada numa lâmina de vidro contendo uma gota de corante violeta; 3. Após ser coberta com a lamínula, a lâmina foi levada ao microscópio e observada com aumento de 10 e 40 vezes. Foto 21: Placas de Petri com fungos semeados. Fonte: autoria própria Foto 22, 23 e 24: Coleta da amostra com alça bacteriana, esfregaço em lamina de vidro, corante violeta Fonte: autoria própria Foto 25: Visualização microscópica Fonte: autoria própria 6.4 Conclusão A observação microscópica evidenciou a presença de estruturas tubulares e ramificadas (hifas). 7. Aula 3 Roteiro 1 - Diagnóstico dos cocos Gram positivos 7.1 Aspectos gerais Os cocos Gram-positivos, são um grupo de bactérias de extrema importância no estudo da microbiologia. Tem potencial patogênico ao Homem e podem ser classificados em dois grupos: aeróbios e anaeróbios facultativos, e anaeróbios obrigatórios. Dentre as bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas, podemos delimitar as catalase positivas e negativas. A catalase é uma enzima com a função de degradação do peróxido de hidrogênio, molécula formada em organismos vivos durante o metabolismo oxidativo. 7.2 Objetivo Os cocos Gram-positivos são um importante grupo de bactérias causadoras de patologias nos seres humanos. A identificação das principais bactérias desse grupo é de vital importância em laboratórios clínicos. 7.3 Procedimento 7.3.1 Prova da Catalase 1. Em uma lâmina de vidro, foi adicionada uma gota de água oxigenada; 2. Uma colônia de bactérias, previamente cultivada, foi retirada com o auxílio de uma alça bacteriológica e adicionada à lâmina de vidro com água oxigenada; 3. Após a homogeneização, foi verificado se ocorreu ou não a reação da Catalase. Foto 26: Lâmina de vidro contendo a amostra e água oxigenada, reação de Catalase positiva. Fonte: autoria própria 7.3.2 Verificação de hemólise em Agar sangue 1. Em placas de Petri, previamente semeadas com Estreptococos, foi verificado o tipo de hemólise (halo esverdeado, incolor e sem hemólise); Foto 27: Placa de Petri semeadas após 24h de incubação, halos da hemolise. Fonte: autoria propria 7.4 Conclusão A prova da catalase foi positiva pois observou-se a formação de bolhas, decorrentes da liberação de oxigênio pela reação da enzima com o peróxido de hidrogênio. Também positiva foi a verificação de hemólise em ágar sangue, pois após a homogeneização na placa de vidro, formaram-se halos de hemólise. 8. Aula 3 Roteiro 2 - Coloração de Gram e Revisão de Morfologia Bacteriana e de Leveduras 8.1 Aspectos gerais A coloração de Gram é uma técnica rápida e simples que tem como objetivo diferenciar as bactérias de acordo com as características de sua parede celular após exposição a diferentes corantes e soluções. As bactérias Gram-negativas adquirem coloração vermelha quando se utiliza esse processo, enquanto as Gram-positivas evidenciam matizes azuladas. 8.2 Objetivo A avaliação da morfologia microbiana é muito importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A coloração de Gram também deve ser revisada dada sua grande importância no diagnóstico clínico das amostras microbiológicas. 8.3 Procedimento 1. Em uma lâmina de vidro, foi adicionada uma gota de solução salina estéril; 2. Com o auxílio de uma alça bacteriana, foi coletada uma colônia de bactérias, previamente cultivada; 3. A colônia foi adicionada à lâmina de vidro (esfregaço) e homogeneizada; 4. O esfregaço foi fixado no calor, com o auxílio do bico de Bunsen; 5. O esfregaço foi então coberto com cristal violeta por um minuto; 6. O excesso de corante foi removido com água destilada corrente; 7. O esfregaço foi coberto com Lugol por um minuto; 8. O excesso de corante foi novamente removido com água destilada corrente; 9. O excesso de corante foi removido com álcool acetona até descorar; 10. O excesso de acetona foi removido com água destilada corrente; 11. O esfregaço foi coberto com corante Safranina por 30 segundos, sendo lavado o excesso e posteriormente seco com papel toalha; 12. A amostra foi levada, então, para a observação microscópica. Fotos 28: Fixação do esfregaço em bico de Bunsen Fonte: autoria própria Fotos 29: Coloração de Gram Fonte: autoria própria 8.4 Conclusão Foram visualizadas células epiteliais na urina e Estafilococos Gram-positivos em forma de cacho de uva. 9. Aula 4 Roteiro 1 - Semeadura bacteriana 9.1 Aspectos gerais As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura. 9.2 Objetivo O procedimento de semeadura bacteriana é importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A aula também deve abordar a questão da seletividade dos meios de cultura. 9.3 Procedimento 9.3.1 Semeaduras em meio solido 9.3.1.1 Semeadura em tubos de ensaio • Semeadura em tubo inclinado, com auxílio da de agulha de platina. Foto 30: Semeadura em tubo inclinado Fonte: autoria própria • Semeadura em tubo em pé (picada central), com auxílio de agulha de platina. Foto 31: Semeadura em tubo em pé Fonte: autoria própria 9.3.1.2 Semeaduras em placa de Petri • Técnica por esgotamento, com auxílio da alça bacteriana. Fotos 32 e 33:Técnica por esgotamento. Fonte: autoria própria • Tecnica por espalhamento em placa, com auxilio da alça de Drigalski. Fotos 34 e 35: Técnica por espalhamento, alça de Drigalski Fonte: autoria própria • Técnica de Pour Plate, foi adicionado 1 ml da suspensão bacteriana previamente semeada a 20ml de um meio de cultura fundido e resfriado, homogeneizando com movimentos circulares. Fotos 36, 37 e 38: Placa de Petri sendo semeada com o auxílio da pipeta, meio de cultura resfriando e homogeneização em movimentos circulares Fonte: autoria própria 9.4 Conclusão Em todas as técnicas apresentadas, houve crescimento bacteriano após incubação. 10. Aula 4 Roteiro 2 - Preparo de Meio de Cultura: Meio Sólido 10.1 Aspectos gerais Os meios de cultura sólidos são constituídos pela adição do Ágar, um polissacarídeo essencial para a solidificação do meio de cultura. As bactérias crescem no meio sólido, quando inoculadas em tubos de ensaio ou placas de Petri. 10.2 Objetivo Aprender sobre os cuidados no preparo e na esterilização de meios de cultura. 10.3 Procedimento 1. Se utilizando da proporção de 65g para cada 1000ml, foi calculada a massa de 8,45g de meio de cultura para 130ml de água destilada; 2. Foram pesados 8,45g de meio de cultura desidratado, em balança de precisão, após realização de cálculo; 3. Em uma proveta foram adicionados 130 ml de água destilada (indicado no rotulo); 4. Com auxílio de um béquer, foram dissolvidos 8,45g de meio de cultura desidratado com 130 ml de água da proveta; 5. O béquer com a solução foi deixado em repouso por 10 minutos; 6. Com o auxílio de um bico de Bunsen e chapa aquecedora, o meio de cultura foi aquecido até a dissolução total. A agitação frequente utilizando um bastão de vidro auxiliou o processo; 7. O meio de cultura foi transferido para um balão volumétrico, e devidamente tampado com papel kraft, fita autoclavante, algodão hidrofóbico e barbante, formando um tampão; 8. O meio de cultura foi levado para esterilização em autoclave; 9. Foi feito o emplacamento do meio de cultura, vertendo uma pequena quantidade do meio líquido em placas de Petri esterilizadas. Fotos 39, 40 e 41: Béquer contendo meio de cultura e água destilada, aquecimento do meio de cultura e agitação frequentemente. Fonte: autoria própria Fotos 42, 43 e 44: Balão volumetrico devidamente tampado, balão volumetrico acondicionado na autoclave, autoclave Fonte: autoria própria 11. Aula 4 Roteiro 3 - Discussão de Casos Clínicos Caso clínico 1 A criança foi levada pela mãe ao consultório do pediatra em visita de rotina, conforme orientação anterior para acompanhamento de recorrência da infecção urinária. A única queixa apresentada foi de anorexia. O exame físico não revelou febre, irritabilidade ou dor à compressão vesical, mas um moderado atraso pôndero- estatural. A criança não era circuncidada e apresentava um discreto refluxo vesico- uretral, como constatado em cistouretrografia miccional realizada anteriormente. Solicitou-se realização de hemograma, urinálise de 3 amostras e urocultura de 3 amostras. 1) Hemograma 2) Urinálise UNC = urina não centrifugada BGN = bacilos Gram negativos CGP = cocos Gram positivos CGA = campo de grande aumento ou 1000x BNV = bactérias não visualizadas 2) Urocultura Com base nos dados clínicos e laboratoriais, propomos as seguintes questões para discussão do caso: 1) Que interpretação e segmento você daria para cada urocultura? Os resultados verificados nas placas de urocultura não condizem com os apresentados na tabela. 2) Seria realmente necessário coletar 3 amostras de urina nesse caso? Caso fossem coletadas em tempos diferentes e durante o tratamento, poderiam elucidar quanto a resposta a antibioticoterapia, se colhidos de forma adequada. Caso contrário, não seria necessário. 3) Quais os cuidados necessários na coleta de amostras de urina de crianças usando o saco coletor para evitar contaminação? Realização de assepsia adequada na região genital e perigenital e manuseio adequado de materiais de coleta. 4) Quais bactérias poderiam ser suspeitas na análise da morfologia colonial das 3 amostras (imagens 1 a 3)? Bacilos Gram-negativos e Cocos Gram-positivos nas amostras 1 e 3. Na amostra 2 não foi evidenciado crescimento bacteriano. 5) No caso de ser necessário realizar antibiograma, quais antibióticos deveriam ser testados? Podemos citar a associação Sulfametoxazol-Trimetoprima (SMX-TMP), as cefalosporinas, como Cefixima, Cefalexina, e a associação Amoxicilina/Ácido Clavulânico. 6) O dado do paciente ser circuncidado é relevante para a avaliação desse caso? Sim, é relevante. 7) Como você interpreta os resultados da coloração de Gram das 3 amostras de urina não centrifugadas? Amostra 1 – Bacilos Gram-negativos / cocos Gram-positivo Amostra 2 – Bacilos Gram-negativos Amostra 3 – Ausência de bactérias 8) Por que é necessário um acompanhamento frequente, com repetição da urocultura a cada visita, em crianças assintomáticas, como é o caso desse paciente? Apesar do infante não apresentar sintomas urinários, possui refluxo vesico- uretral, condição de aumento de risco para ITU. Recomenda-se, então o acompanhamento e urocultura frequentes. 9) Existe alguma alteração significativa no eritrograma? Sim, diminuição de valores de hemoglobina e eritrócitos totais. 10) Como pode ser explicado o resultado da contagem diferencial? Aumento de segmentados e linfócitos. Referências Bibliográficas SIDRIM, JJC; MOREIRA, JLB. Fundamentos Clínicos e Laboratoriais da Micologia Médica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 287, 1999. BRASIL. Ministério da Saúde. Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. Módulo 8: Detecção e Identificação dos Fungos de Importãncia Médica/ Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: Anvisa, 2013. ZAITZ.; MARQUES, S.A; RUIZ, L.R.B.; SOUZA, V.M. – Compêndio de Micologia Médica. Rio de Janeiro, MEDSI, 1998. 434 p. BLACK, J. G. Microbiologia: fundamentos e perspectivas. 4a Ed., Guanabara Koogan, 2002. PELCZAR JR, M.J.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. Microbiologia: conceitos e aplicações. Traducao de Sueli Yamada, Tania Ueda Nakamura, Benedito Prado Dias Filho. Revisão técnica de Celso Vataru Nakamura. São Paulo: Makron Books, 1996. 524 p. 1 v. LACAZ, Carlos da Silva. Tratado de micologia médica Lacaz. São Paulo (SP): SARVIER, 2002. 1104p. ISBN 8573781238. Número de Chamada: 582.28:616 T776.
Compartilhar