Resumo PCR

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- reação de amplificação enzimática de uma sequência específica de DNA com o 
 intuito de produzir muitas cópias dessa sequência 
 - possibilita a amplificação de curtos fragmentos de DNA sem clonagem 
 - os alvos para PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a 
 ser amplificada 
 Regiões flanqueadoras: antes e depois da região de interesse 
 - a PCR permite que os fragmentos de DNA sejam amplificados um bilhão de vezes 
 dentro de algumas horas - são feitos cerca de 20-25 ciclos 
 - o procedimento de PCR é simples e usa a enzima polimerase que sintetiza as fitas 
 de DNA a partir de desoxirribonucleotídeos 
 - precisa do DNA molde, primer para delimitar a região de interesse, dNTPs, 
 polimerase, tampão para manter a estabilidade e cloreto de magnésio 
 - os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos de fita única, usados para 
 flanquear as extremidades da região a ser amplificada, marcando o início e o fim da 
 sequência-alvo 
 TaqDNA polimerase 
 - DNA polimerase termoestável - permanece ativa a cada etapa de aquecimento 
 - enzima oriunda da bactéria Thermus aquaticus 
 CICLO DE PCR convencional 
 1. desnaturação 
 - 94°C 
 - aumento da temperatura que faz com que a dupla fita se abra 
 - precisa saber a quantidade de ligações guanina-citosina para saber a temperatura 
 certa 
 2. anelamento dos primers 
 - hibridização 
 - 45-65°C 
 - os primers hibridizam com suas sequências complementares no DNA molde 
 desnaturado 
 3. extensão 
 - 72°C 
 - DNA polimerase, na presença de magnésio e dNTPs, sintetiza uma nova fita de 
 DNA 
 Na PCR convencional, não há a certeza se amplificou até comprovar com um segundo 
 método » eletroforese 
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 PCR EM TEMPO REAL (qPCR ou RT-PCR) 
 - permite monitorar a reação de PCR enquanto os ciclos se sucedem e detectar o 
 produto de amplificação a medida que ele se forma 
 - não precisa da eletroforese para comprovar - método mais rápido 
 - apresenta curva de amplificação 
 - detecta e quantifica com um corante fluorescente - fluoróforo 
 - o sinal aumenta proporcionalmente à quantidade de fragmento amplificado 
 na região de PCR 
 - ⇧ o número de fragmentos amplificados ⇧ a fluorescência emitida 
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