PCR e PCR em tempo real

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PCR e PCR em tempo real
O PCR é uma técnica que permite a replicação do DNA in vitro.
Os procedimentos são:
Desnaturação: o DNA é aquecido a 94°C a 96°C para ocorrer a separação da dupla fita.
Anelamento: a temperatura é diminuída em 60°C e os primers se unem a fita simples.
Extensão dos fragmentos: acontece a produção da fita complementar pela DNA polimerase, a temperatura de 72°C. 
O fragmento de DNA sintetizado em um dado ciclo da PCR serve como substrato para a formação de novos fragmentos no ciclo seguinte.
Termociclador
A DNA polimerase usada no processo de PCR é produzida através da bactéria Thermus aquaticus, por ser uma microrganismos que habita regiões de extremo calor, a proteína não desnatura na temperatura utilizada durante o processo.
Os resultados do PCR são visualizados na eletroforese em gel de agarose. 
Plateau de reação: quando a reação alcança o resultado máximo esperado, sendo que o tempo estimado de ensaio ou experimento não aumentará o resultado (n° de moléculas replicadas).
Breve resumo de PCR
Replicação in vitro.
Anelamento dos primers.
Extensão dos fragmentod por polimerase.
Origem da DNA polimerase usada no PCR.
1 ciclo = 2 moléculas.
Dna polimerase não aguentaria temperatura superior a 37°C.
Plateau de reação.
1 ciclo = 3 fases.
PCR em tempo real
Variação da técnica de PCR, que é permitido a amplificação e a detecção ocorram de maneira simultânea. 
É adicionado um agente fluorescente que vai permitir o monitoramento da reação.
A geração de dados ocorre em tempo real, enquanto para ser feito a análise só é possível depois de terminar todo o processo.
Requer uma plataforma que contenha um termociclador com sistema ótico e um computador com software para a aquisição de dados para a análise final da reação. 
TaqMan: é uma sonda que detecta sequências de fragmentos de DNA amplificados no PCR. Apresenta duas extremidades, uma contém floróforos e a outra contém um quencher.
O fluóforo é um agente fluorescente para a detecção da amplificação do alvo.
 Os níveis de fluorecência gerada aumenta de maneira proporcional ao aumento do número de cópias do alvo na reação. 
https://www.youtube.com/watch?v=TaNtNjq-VQw
https://www.fleury.com.br/medico/manuais-diagnosticos/hematologia-manual/pcr
https://www.youtube.com/watch?v=h2peadwu1zk&t=2423s
Material fornecido pela Professora Rogéria