Estudo Dirigido de Microbiologia Veterinária

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ESTUDO DIRIGIDO DE MICROBIOLOGIA VETERINÁRIA
1- Em um laboratório de microbiologia quais as principais normas de biossegurança que devem ser seguidas?
Avaliar os possíveis riscos. Evitar a contaminação e a disseminação de possíveis patógenos. Evitar qualquer risco para seres humanos e animais. Possuir um plano de emergência.
2- Cite 3 exemplos de riscos químicos, físicos e biológicos presentes em um laboratório.
Químicos: Resíduos, substâncias explosivas, materiais inflamáveis (éter), substâncias corrosivas (ácido clorídrico) e radiológicas, carcinógenos.
Físicos: Incêndio, equipamento que gera calor ou chama, equipamentos de baixas temperaturas, radiações UV.
Biológicos: Patógenos (bactérias, fungos e vírus).
3- Quais as principais diferenças entre as bactérias Gram + Gram -?
Gram +: a parede celular é bastante espessa, sendo formada por várias camadas de peptideoglicana, e localiza-se externamente à membrana celular. Possui ácidos teicóicos na parede, que conferem especificidade e identificação das espécies. Possui também o ácido lipoteicóico que atravessa a camada peptideoglicana. Se cora de roxo/azul. 
Gram -: apresentam duas membranas (uma externa e uma interna – citoplasmática). A camada de peptideoglicana está localizada entre essas duas membranas (sendo mais fina e frágil do que nas gram +), na região denominada espaço periplasmático, onde há concentração de enzimas de degradação e proteínas utilizadas para transporte. Lipoproteínas ligam a parede à membrana plasmática. Membrana externa: fuga da fagocitose e do sistema de complemento; barreira contra alguns antibióticos, enzimas detergentes. Apresenta lipoproteínas, lipopolissacarídeos na membrana externa (LPS - atuam como antígenos e são úteis para diferenciar espécies bacterianas), fosfolipídeos, porinas. Canais proteicos - transporte de substâncias; confere a permeabilidade da parede celular; permite a passagem de água e solutos hidrofílicos de baixo peso molecular. Toxina (tóxica quando presente no sangue ou trato gastrointestinal). Se cora de rosa/vermelho.
Gram Positivo: tem uma camada mais espessa de peptídeoglicano, dando maior resistência à danos mecânicos. 
 Gram Negativo: tem mais lipídios na parede celular. O tratamento com álcool/éter extrai os lipídios, resultando numa permeabilidade aumentada
4- Quanto à resistência ao meio ambiente e produtos, existem diferenças entre as G+ e G-. Escrevam quais são essas diferenças. 
As bactérias Gram+ por possuirem uma camada de peptideoglicana mais espessa tem maior resistência a danos mecânicos e são mais resistentes a polimixinas. Já as bactérias Gram- tem mais lipídios na parede celular sendo sensível ao tratamento com álcool/éter que extrai os lipídios, resultando numa permeabilidade aumentada, além de serem mais resistentes a penicilina G e a detergentes.
5- Explique como é feita a coloração de GRAM.
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona, que não ocorre nas bactérias gram-negativas.
É usada primeiramente uma solução cristal violeta (coloração violeta) e depois o fixador lugol (iodo), formando o complexo Violeta-Iodo que cora todas as bactérias. Utilizando o Etanol-Acetona (álcool) faz com que ocorra um dano mecânico na Gram+, fazendo ela se contrair (desidratação) e reter o corante. Já na G- o álcool dissolve os lipídios da membrana externa junto com o corante, tornando-o incolor. E então é usado um contracorante safranina (coloração rosa – Fucsina) para corar as bactérias G-, tornando-as visíveis ao microscópio.
6- Quais são os postulados de KOCH?
1- Organismos presentes em animais doentes e ausentes em sadios;
2- Organismos devem ser cultivados em culturas;
3- As culturas quando inoculadas em animais susceptíveis devem ser capazes de provocar sintomas característicos da doença;
4- O organismo deve ser isolado a partir de animais experimentais e novamente cultivado, apresentando as mesmas características do organismo originalmente isolado.
7- Quais são os meios de cultivo para microrganismos? Quais as características de cada um?
Quimicamente definidos: onde o meio é constituído de composição conhecida.
Complexos: tem componentes proteicos como fonte de energia (C, N, S).
Seletivos: onde há o crescimento de um microorganismo específico e de interesse, associado com condições de pouca sanidade.
Diferencial: facilita a identificação de colônias.
Enriquecidos: para bactérias em pequeno número.
Seletivos + diferencial: permite a diferenciação e o crescimento de bactérias de interesse.
8- Cite as fases de crescimento populacional, explicando o que acontece em cada uma.
Lag: ocorre quando há mudança de meio e o microorganismo está se adaptando. Não há divisão celular, número de células se alteram muito pouco. Tempo varia de acordo com o histórico e condições da cultura. 
Log: há aumento significativo do número de células (divisão), atinge seu crescimento máximo e tem alta atividade metabólica. Têm influencia de condições ambientais (temperatura, composição do meio) e características genéticas do microrganismo.
Estacionária: Quando a morte celular é igual ao número de células novas. Por algum fator como falta de nutrientes, por exemplo, o microorganismo estaciona seu crescimento e não se multiplica mais. Limites ao crescimento indefinidos, como por exemplo, consumo de um nutriente essencial, presença de um algum produto de excreção inibitório (algumas células começam a morrer pra não ter competição por nutriente). 
Morte ou de declínio: lise celular: número de células mortas é maior que células vivas.
9- Cite 4 fatores de virulência
Proteínas de membrana: Adesão, Invasão, Colonização e Componentes de superfície;
Cápsula: adesão e resistência;
Proteínas secretadas: Inibidores do sistema imune, toxinas e transportadores de toxinas. 
Componentes de membrana e parede celular: pili e fímbrias;
Outros: Biofilmes, Aquisição de Fe e Sistema de dois componentes.
Penetração e disseminação (através de enzimas como colagenase e hialuronidase), sobrevivência no hospedeiro (fagócitos, resistência aos fatores de defesa do hospedeiro, cápsula, parede celular, proteína M e proteína A, catalase e superóxido dismutase), injúria tecidual (liberando endotoxinas e exotoxinas), sideróforos (relacionados a captação de ferro), quórum sense (comunicação entre as bactérias, que pode estar relacionado com presença de biofilme, virulência, esporulação, motilidade), sistemas de secreção (proteínas produzidas são excretadas), exotoxinas destroem ou inibem função de células do hospedeiro. Difundem-se no sangue. Endotoxinas: podem ativar proteínas de coagulação e causar coagulação intravascular disseminada (isquemia, necrose), perda de pressão arterial, menor aporte sanguíneo aos tecidos e morte tecidual.
10- Com relação a sua temperatura ótima para suas reações metabólicas e o seu crescimento, como os microrganismos podem ser classificados?
1- Psicrófilos – baixas temperaturas: -10ºC – 15ºC Pollaromonas vacuolata 
2- Mesófilos – temperaturas medianas: 8ºC - 48ºC Escherichia coli 
3- Termófilos – altas temperaturas: 40ºC – 68ºC Bacillus stearothermophilus 
4- Hipertermófilos – temperaturas muito elevadas: 64ºC - 98ºC Thermococcus celer 90ºC - 115ºC – Pyrolobus fumarii
11- Com relação ao PH e o efeito osmótico como os microrganismos podem ser classificados?
Acidófilos – pH baixo: fungos são mais tolerantes ao pH baixo componente mais crítico é estabilidade de membrana citoplasmática.
Alcalifílicos – pH alto: ambientes muito básicos - lagos ricos em carbonato de cálcio e em solos interesse industrial – produzem enzimas hidrolíticas (proteases e lipases) pH interno – sempre alcalino.
Halotolerantes: Halófilo e Halófilo extremo.
12- Cite e explique 3 fatores químicos necessários para o crescimento dos microrganismos.
Oxigênio: 
Aeróbias obrigatórias fazem respiração aeróbia apenas (ex: microrganismos da pele); aeróbias facultativas fazem respiração aeróbia, anaeróbia,fermentação (ex: bact. do intestino grosso de humanos).
Microaerófilas: necessitam de pouca quantidade de oxigênio, fazem respiração aeróbia (ex.: bact. água de solos).
Anaeróbios obrigatórios: fazem fermentação ou respiração anaeróbia, para elas o oxigênio é letal ou nocivo (ex.: bact. de esgoto, sedimentos de lagos); anaeróbios aerotolerantes fazem fermentação (ex.: bact. do trato respiratório superior).
13- O que é um Operon?
É uma unidade de controle de expressão gênica. Mantém a produção constante de proteínas e compostos constituintes do microrganismo e os não constitutivos (como fatores de virulência, vias de metabolização) podem ser induzidos ou reprimidos. O mecanismo de ação dele é a inibição do RNA mensageiro.
14- Explique os processos de Conjugação, transformação e transdução.
Conjugação: Transferência de genes (geralmente do plasmídeo) entre células de tipos opostos (podem ser da mesma espécie e até de gêneros diferentes). A bactéria F+ (que possui o gene de fertilidade) emite o Pili e se conecta à bactéria F- que vai receber uma cópia do gene de fertilidade e do plasmídeo, além de se tornar uma bactéria F+ (ter o gene de fertilidade).
Transformação: A bactéria capta genes que estão no ambiente (geralmente provenientes de outros microrganismos que morreram. É raro e geralmente defectiva.
Transdução: O DNA de uma célula doadora é transferido para uma célula receptora dentro de um vírus que infecta a bactéria receptora. O vírus usa as estruturas da bactéria para se multiplicar, e pode causar a morte da bactéria infectada, além de levar genes de uma bactéria que foi previamente infectada para outras bactérias causando recombinação nas bactérias. É raro e geralmente pode ser defectivo.
15- O que é um Plasmídeo?
Os plasmídeos são pequenos fragmentos de DNA circular separados do genoma, sendo capazes de replicação autônoma. Cópias de plasmídeos podem ser transferidas de célula para célula durante a fissão binária ou a conjugação. O DNA plasmidial pode codificar características, como resistência a antibióticos, estimular a capacidade de cruzamento e produção de certas toxinas. 
16- Explique o que são Sideróforos e Quorum-sense.
Sideróforos: são componentes quelantes do ferro (capacidade de solubilizar e transportar ferro), que por sua vez tem papel chave na respiração bacteriana. Componente essencial dos citocromos e das proteínas contendo ferro e enxofre.
Quorum-sense: mecanismo de comunicação entre bactérias, através da produção e difusão de pequenas moléculas químicas ou sinalizadoras, através de membranas bacterianas. Este sistema de linguagem permite a coordenação do comportamento bacteriano em relação ao meio ambiente, regulando a expressão de genes especializados, em resposta à densidade populacional, além da intervenção em diversos processos fisiológicos como a diferenciação celular e fluxo de nutrientes, a bioluminescência, indução de fatores de virulência em patógenos de plantas e animais, biossíntese de antibióticos e a formação de biofilmes.
17- O que é e qual a função da Pili para as bactérias?
Pili (fímbrias) são estruturas sexuais presas na parede celular de várias bactérias que faz aderência entre elas para transferência de DNA (aumentando a variabilidade genética) entre bactérias de mesmos ou de diferentes gênero e espécie. Nessa troca de material pode haver troca de genes de resistência a medicamentos, virulência, rotas metabólicas alternativas.
18- Quais as características que um antibiótico deve possuir para ser considerado ideal?
1. Capacidade de inibir ou destruir muitas espécies de microrganismos patogênicos. 
2. Evitar formas de resistência de microrganismos causadores de doenças. 
3. Não produzir efeitos colaterais no hospedeiro.
4. Não prejudicar a microflora normal. 
5. Não ser inativado pelo pH estomacal e deve ser absorvido pelo trato gastrointestinal. 
6. Solubilidade nos fluídos corporais. 
7. Capacidade de alcançar concentrações suficientes nos tecidos ou no sangue para matar ou inibir os micro-organismos.
19- Qual o mecanismo de ação dos antibióticos nas bactérias? 
- Inibição da síntese da parede celular peptideoglicana (Gram+): Atuam em células em crescimento.
- Danos a membrana plasmática: Polimixinas ligam-se à membrana, entre os fosfolipídeos, alterando sua permeabilidade. São extremamente eficientes contra Gram negativos, pois afetam tanto a membrana citoplasmática como a membrana externa.
- Inibição da síntese de ácidos nucleicos: interferem com os processos de replicação e transcrição do DNA. 
· Novobiocina - se liga a DNA girase, prejudicando o desnovelamento do DNA, impedindo sua replicação. 
· Quinolonas - inibem a DNA girase, afetando a replicação, transcrição. 
· Rifampicina - ligação à RNA polimerase, bloqueando a transcrição.
- Inibição da síntese proteica: interferem com o processo de tradução. Correspondem a um dos principais grupos de agentes antimicrobianos. 
· Toxicidade seletiva – diferença estrutural dos ribossomos de procariotos e eucariotos. 
· Afeta principalmente G+, possuem amplo espectro.
- Inibição da síntese de metabólitos essenciais: Geralmente ocorre por um mecanismo de inibição competitiva, ATB compete com o sítio enzimático de uma enzima com um substrato. 
· Sulfas e derivados - inibição da síntese do ácido fólico, pela competição com o PABA (ácido paraminobenzóico). PABA + ENZIMA = ÁCIDO FÓLICO (coenzima para síntese de aa, bases nitrogenadas).
20- Explique resumidamente sobre cada grupo fungico.
Leveduras (unicelulares): Não possuem flagelos ou meios de locomoção. Crescem no meio com ágar colônias lisas e brilhantes.
Fungos Filamentosos (multicelulares): Parede celular formada por quitinas, celulose e glicanas. Formam hifas (micélio + esporos corpo/talo). Sobre meio com ágar: colônias rugosas e filamentosas.
21- O que são biofilmes?
São associações de microorganismos e de seus produtos extracelulares que se encontram aderidos a superfícies bióticas ou abióticas.
22- Como funciona uma auto-clave ?
O processo de autoclavagem consiste em manter o material contaminado em contato com um vapor de água em temperatura elevada, por um período de tempo suficiente para matar todos os microorganismos. 
23- Cite a classificação das bactérias quanto ao flagelo e para que servem estas estruturas ?
A bactéria pode ser classificada como monotríquia, lofotríquias, anfitríquias ou peritríquias. Estas estruturas servem para a locomoção da bactéria. 
24- Qual a diferença entre um bactericida e um bacteriostático?
O bactericida mata a bactéria, enquanto o bacteriostático inibe e paralisa o metabolismo da bactéria, impedindo o crescimento das bactérias.
25- Quais são os métodos de quantificação populacional? 
Métodos para quantificar diretamente:
Contagem total: Medir crescimento por contagem microscópica direta. 2 tipos – amostras secas em lâminas ou a partir de amostras líquidas.
Limitações – não dá para distinguir células mortas de vivas, células pequenas, técnica pouco precisa, amostra precisa estar corada, não é adequado para contagem de culturas com baixa densidade, células móveis.
Contagem de células viáveis: contagem em placas ou de colônias. 2 tipos – método de semeadura por espalhamento (pour plate) e pelo método de semeadura em profundidade. 
Diluição seriada: para diminuir número de células para haver a formação de colônias isoladas
Contagem é realizada em placas com 30-300
Duplicata: Erros da contagem em placas – tamanho do inoculo, qualidade do meio de cultivo e condições de incubação (tempo, temperatura)
Grande anomalia 
Vantagens – sensibilidade, utiliza meios altamente seletivos
26- Qual a função de uma PCR e quais são as suas fases?
Permite achar a taxonomia molecular. O príncipio é a replicação que ocorre em vivo de genes específicos. Pega-se um fragmento do gene e amplifica-se suas cópias. Há então a separação da fita dupla pelo calor. Depois usa-se o primer que tem no máximo 20 pares de bases, este vai marcar a região onde deseja-se amplificar. O terceiro passo é a construção da fita nova. Depois usa-se um gel pra identificarpor eletroforese.
ETAPAS DA PCR:
· Escolha do fragmento de DNA a ser amplificado;
· Obtenção do DNA molde. 
· Obtenção de iniciadores, “primers” específicos (cadeias simples de DNA de 15 a 30 nucleotídeos). Um deles tem a seqüência complementar à extremidade 3’ de uma das fitas do DNA a ser amplificado, e o outro é complementar à extremidade 3’ da outra fita;
· Amplificação dos fragmentos de DNA em um termociclador;
· Análise do produto de amplificação no gel.
27- Cite a função da capela de fluxo laminar.
A capela de fluxo laminar é um equipamento de laboratório projetado para criar áreas de trabalho estéreis para a manipulação de materiais biológicos, que não possam sofrer contaminação do meio ambiente, garantindo a segurança da manipulação. A capela de fluxo laminar vertical, exemplo de modelo de capela, apresenta fluxo de ar laminar vertical. Isso oferece proteção ao produto manipulado e garante a proteção do operador e do ambiente contra agentes biológicos de risco.
28- Qual o gênero das bactérias não apresenta parede celular? Em que implica a ausência desta estrutura?
Gênero Mycoplasmas. Ela será mais susceptível a ação do de antibióticos e ao sistema complemento do organismo hospedeiro.
29- Quais são os mecanismos bioquímicos de resistência das bactérias?
- Inativação enzimática da droga: enzimas produzidas por micro-organismos. Primeira a ser descrita foi a penicilase. Produzidas por G+ e G-. Codificada geneticamente por genes cromossomais e em plasmídeos e transposons.
- Alteração de permeabilidade às drogas:
Natural: G- são resistentes a penicilina G, não consegue atravessar a parede bacteriana. G + são resistentes a polimixinas – parede é impermeável a esta droga.
- Adquirida: Mycobacterium tuberculosis e Pseudomonas aeruginosa resistentes a quinolonas. Alteração na permeabilidade de membrana.
- Bombas de efluxo: Retirada do ATB do meio intracelular bacteriano para o meio extracelular. Existem bombas com capacidade múltipla – expulsam várias classes de ATB. Comum em bacilos Gram – entéricos portadores de plasmídeos R.
30- O que é um resistoma?
É um conjunto de genes de resistência a ATB em bactérias comensais.
31- Qual a função da Taq Polimerase?
A Taq DNA Polimerase é uma enzima termoestável com atividade polimerase (isto é tem capacidade de polimerização de ácidos nucléicos através de seus monômeros). Essa enzima foi isolada de uma bactéria termofílica Thermus aquaticus, a qual consegue reproduzir em laboratório a síntese de DNA igual a que ocorre em seres vivos (sentido 5’-3’).
1) Falar sobre as normas de biossegurança em um laboratório que trabalha com microorganismos de risco.
Acesso limitado, alerta de risco, manual de biossegurança, autoclave, equipamento de proteção individual, separação física de corredores, exaustão do ar, mudança de roupa ao entrar e sair, material descontaminado, prédio isolado, sistema de vácuo e descontaminação. 
2) Desenho de estruturas (slide 22, 39) da célula bacteriana, nomear todas, colocar as funções e na letra c) falar como diferir e por que o comportamento das G+ e das G com a coloração. 
G+ tem muitas camadas de peptídeoglicanos com ácido teicóico. G- tem uma camada de peptídeoglicanos, frágil, espaço periplasmático (enzimas de degradação e proteínas de transporte). A G+ é mais acidofílica do que a G-. 
1) Parede celular: rigidez, previne rupturas, protege contra alterações do meio externo, ancora os flagelos e é fator de virulência. LPS - Antígeno O (diferenciação de espécies) e lipídeo A (endotoxina); porinas (canais proteicos) 
2) Ribossomo: síntese proteica 
3) Membrana celular: permeabilidade seletiva, degrada nutrientes, função de transporte, dupla camada fosfolipídica. Pode ser lesada por antibióticos e amônia. 
4) Dna – material genético: (?) material genético, aumenta variabilidade dos microorganismos através de troca de DNA. 
5) Cápsula celular: resistência a dessecação, aderência bacteriana, impede fagocitose e ação de substancias tóxicas (fuga do sistema imune do hospedeiro). 
6) Citoplasma: localizam DNA e ribossomos
7) Flagelo: locomoção.
8) Endosporos: sobrevivência bacteriana a ambientes hostis, estocar genoma e a maquinaria metabólica. Mais em Gram+
9) Fímbrias: aderência bacteriana
10) Pili: união de 2 células, transferência de genes
4) Falar o que era o Operon Lac, falar como se comportava na presença e na ausência de lactose.
Presente em organismos procariotos. Era requerido para o transporte e metabolismo de glicose e lactose para a Escherichia coli. Permite às bactérias uma digestão eficiente da lactose através da produção de enzimas. Na falta de lactose o Operon Lac ativa o repressor lac que paralisa a produção de enzimas, fazendo com que a bactéria metabolize glicose. Esse uso da glicose antes da lactose é chamado de diauxia. 
5) Falar como as bactérias adquirem mecanismos de resistência. 
A resistência pode ser natural (já proveniente do metabolismo ou genes da bactéria), adquirida (que surge em uma bactéria antes sensível), por mutações (hereditárias, por divisões, mutagênicas), por transferência de genes (transformação transdução, conjugação, transposição). Entao pode ocorrer inativação enzimática do antibiótico, impermeabilidade da membrana a ele e bombas de efluxo (jogam o ATB pra fora). Além disso existem os resistomas, que são conjuntos de genes resistentes em bactérias comensais, e os biofilmes, que através da agregação de bactérias formam um associado que além de dar novas características as bactérias conseguem aumentar em até 1000x sua resistência.