Morfologia e Citologia Bacteriana

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aula 1: morfologia bacteriana 
· As bactérias apresentam principal forma de cocos, bacilos, forma espiralada e outras morfologias mais incomuns e de transição.
· Cocos: São células esféricas ou ovaladas. Quando sofrem divisão binária podem permanecer unidas e formar filamentos como os a seguir. 
• Diplococo: Streptococcus pneumoniae 
• Estafilococo: Staphylococcus 
• Streptococcus: Streptococcus
Além desses, os cocos podem assumir formato lanceolado (folha) e reniforme, como é o caso da bactéria de gênero Neisseria, de coloração GRAM negativa.
· Bacilos: São formas cilíndricas isoladas ou em cadeias curtas, chamadas de estreptobacilo. As bactérias que possuem morfologia paliçada ou letra chinesa são Corynebacterium diphtheriae e C. striatum. As formas de transição são o cocobacilo, bastonete mais curto e o vibrio, de formato curvo, do gênero Vibrium. 
· Bactérias espiraladas: Esse tipo morfológico é dividido em espiroquetas e espirilos. 
• Espiroquetas: são bactérias em forma de espiral e com corpo flexível. Não se coram com GRAM uma vez que são muito finas. O melhor método é a impregnação com prata por Fontana – Tribondeau. Treponema Borrelia Leptospira 
• Espirilos: têm forma de espiral incompleta e corpo rígido. Spirillum 
• Existem, ainda, bactérias parcialmente espiraladas → Helicobacter e Campylobacter
aula 2: citologia bacteriana
· As células bacterianas possuem estruturas essenciais para sua sobrevivência, bem como estruturas acessórias. 
• Essenciais: parede celular, membrana celular, mesossomos, ribossomos e cromossomo. 
• Acessórias: cápsula, camada limosa, flagelo, pili / fímbria, esporos, grânulos de reserva, plasmídeos. 
· PAREDE CELULAR: Estrutura semirrígida que reveste a célula, sendo indispensável à sobrevivência e reprodução. 
• Função → Confere forma à bactéria; Impede a lise a partir de proteção osmótica; Possui permeabilidade não seletiva, permitindo a livre passagem de solutos. 
• Composição química básica → O componente básico é o peptideoglicano, polímero formado de cadeias paralelas alternadas de aminoaçúcares N-acetilglicosamina (NAG) e ácido actilmurâmico (NAM), exclusivo de bactérias, ligados por ligações glicosídicas β 1-4. 
• Componentes especiais: -Bactérias Gram + : O peptideoglicano corresponde a 60% da parede celular. Também estão presentes proteínas que podem atuar como adesinas ou antígenos, como a proteína M de Streptococcus pyogenes, e polissacarídeos, que agem como antígenos, por exemplo o carboidrato C de Streptococcus. Outros componentes de extrema importância são os ácidos teicoico e lipoteicoico, que se estendem até o ambiente externo. 
· Bactérias gram -: O peptideoglicano representa apenas 10% da composição da parede, que contém lipoproteína de membrana plasmática. As lipoproteínas ligam a parede celular à membrana externa.
OBS: 
Parede celular de micobactérias → O peptídeo galactano está ligado à uma camada de arabinogalactano, que está ligada a uma camada de ácido micólico, deixando a bactéria altamente hidrofóbica. 
Parede celular de Archaea → Não apresentam peptideoglicano, mas podem ter comportamento G + ou G-. 
Parede celular de fungo → Apresenta quitina, glucanas e mananas. 
· Membrana EXTERNA: A camada mais externa é formada por lipossacarídeo (LPS), constituída por lipídeo A, core e antígeno O. 
· O LPS é uma endotoxina das bactérias G-. O lipídeo A induz resposta inflamatória de fase aguda e febre e se liga ao core, que é uma estrutura de sustentação. O core se liga ao antígeno O, uma cadeia de açúcar lateral com propriedade antigênica e com resistência à atividade bactericida do soro do hospedeiro. Na membrana externa há fosfolipídeos e proteínas transmembranas conhecidas como porinas. Essas possuem poros que permitem a passagem de solutos hidrofílicos e conferem à membrana uma barreira hidrofóbica, com permeabilidade seletiva.
· ESPAÇO PERIPLASMÁTICO: Espaço entre a membrana externa e a citoplasmática, logo, é de exclusividade das bactérias G-. É composto de um gel glicoproteico, rico em enzimas hidrolíticas e transportadoras. Atua na clivagem de macromoléculas e na resistência a antibióticos pela ação hidrolítica da enzima β – lactamase e atua no transporte intermembranas.
 
· SÍTIOS DE ADESÃO OU JUNÇÕES DE BAYER: Exclusivo de bactérias G-. São canais formados por prolongamentos da membrana celular que a une na membrana externa, o que garante contato direto do citoplasma com o exterior da célula.
· ENZIMAS QUE QUEBRAM A PAREDE CELULAR 
· Autolisinas →São enzimas bacterianas que participam da divisão celular, uma vez que clivam pontos do peptideoglicano, permitindo a adição de novas unidades de aminoaçúcares (NAM e NAG). 
· Lisozimas → Presente em diversas secreções corporais, quebras as ligações β 1-4 entre o carbono 1 do ácido murânico e 4 do N-acetilglicosamina. 
· MEMBRANA PLASMÁTICA OU CELULAR 
Formada por duas camadas de fosfolipídios, com proteínas inseridas. Difere-se dos eucariotos por não conter esteróides (exceto o Mycoplasmas), sendo uma estrutura fluida que permite a mobilidade de proteínas. Estrutura fluida que permite a mobilidade de proteínas. 
• Função 
· Permeabilidade seletiva
· Transporte de solutos e excreção de substâncias. 
· Produção de energia pelo transporte de elétrons e fosforilação oxidativa, a partir do mecanismo de quimiosmose. 
· Biossíntese de lipídeos e macromoléculas. 
· Secreção de enzimas hidrolíticas e toxinas. 
• Transporte 
· Difusão simples (Não mediado): ocorre do menor gradiente de concentração para o maior. Transporta água, nutrientes gasosos e poluentes hidrofóbicos. 
· Difusão facilitada (Mediado): é a favor do gradiente, mas precisa de proteínas para auxiliar o carregamento. Transporta glicose. 
· Transporte ativo (Mediado): Requer energia, uma vez que vai do maior gradiente de concentração para o menor. 
· Uniporte: transporte de apenas uma substância. 
· Simporte: cotransporte de duas substâncias na mesma direção, sendo uma delas necessária e a outra a de interesse. 
· Antiporte: cotransporte de duas substâncias em sentidos opostos, sendo uma delas necessária e a outra a de interesse. 
· Translocação em grupo: ocorre modificação química da substância a ser transportada, como o caso da fosfotransferase da Escherichia coli. 
• Archaea → Membrana com mono ou bicamada, com hidrocarbonetos no lugar de ácidos graxos, o que confere muita fluidez.
aula 3: fisiologia bacteriana 
Existem 2 grandes grupos de bactérias de acordo ao estado nutricional, composto principalmente por carbono: 
· Autotróficas: utiliza CO2 como fonte de carbono 
· Heterotróficas: utilizam compostos orgânicos 
Autotróficas
· Fotoautotróficos: utilizam a luz como fonte de energia
· Quimiolitotróficos: utilizam compostos orgânicos como fonte de energia 
Heterotróficas 
· Fotorganotroficas: utilizam luz 
· quimiorganotróficas: utilizam compostos orgânicos 
OBS: as bactérias autotróficas podem causar infecção? Não, mas podem causar doenças. Ex: Cianobactérias → elas não causam infecção, pois podem não proliferar, porém podem causar doença através de suas cianotoxinas
Cianobactérias 
Em 1996 em Caruaru, Pernambuco; foram observadas 60 mortes após 10 meses do início de sintomas característicos, todos os pacientes eram de hemodiálise. 
Observou-se então que a água da hemodiálise estava contaminada com cianobactérias 
· Portaria MS (2011): Padrão da potabilidade da água. Demanda obrigatória de análise de cianobactérias (cianotoxinas tb) em água de consumo humano.
Características da cianobactérias 
· Fotossintéticas
· Gram -
· Habitat → principalmente água 
· Morfologia → apresenta morfologia variada podendo ser cilindrada, filamentosa, esférica
 
Importância médica 
· Sua importância médica está relacionada com a secreção de cianotoxinas 
· As cianotoxinas são produzidas no citoplasma e são liberadas a partir da ruptura da membrana
 
Exemplos de cianotoxinas 
· Microcistinas, Nodularinas e Cilindros Pramoxina → são toxinas que geram hepatotoxicidade ao desorganizar o esqueleto celular dos hepatócitos· Saxitoxinas → neurotoxinas que se ligam aos canais de Na+ dos neuronios, bloqueando a propagação do impulso nervoso 
· Lingbiatoxina → atua como dermotoxina, e sua floração está relacionada com excesso de nitrito e fósforo 
As cianotoxinas não são desativadas pela fervura → é uma das suas principais características físicas 
Uso comercial de cianobactérias 
· Além de serem usadas para o processo de decomposição, também podem ser usada para fazer spirulina e para fertilizantes 
NUTRIÇÃO DAS BACTÉRIAS 
Existem os nutrientes essenciais e os não-essenciais
· Dentro dos essenciais temos os macronutrientes: que estão relacionados com a quantidade que a bactéria precisa deste nutriente (não do tamanho), tal como fósforo, enxofre, nitrogênio etc. 
· e temos os micronutrientes (ou elementos traço) que são exigidos em quantidades tão pequenas que muitas vezes nem precisam ser colocados em meios de cultura 
Cultivo → é a base do estudo de bactérias, permite o isolamento e identificação em cultura para diferentes 
espécies
· Algumas bactérias têm exigências nutricionais simples, como E.coli, que pode proliferar só com glicose e sais minerais, e outras precisam de fatores mais complexos, como fatores de crescimento (que podem não ser sintetizados pela bactéria, e ela toma do hospedeiro) como o H. Influenzae, que precisa de fator X e o fator V (NAD)
· OBS: Mutante autotrófica → bactéria que exige 1 fator de crescimento ao contrário da amostra original (bactéria prototrófica) 
· Existem bactérias não cultiváveis (nem em cultura, nem em célula) → treponema palium, mycobacterium leprae (hanseníase)
· Existem bactérias não cultiváveis em meios convencionais → podem precisar de uma célula para se multiplicar, ou de metabólitos celulares. 
· Existem bactérias que exigem suprimento de CO2 (saprofíticas) → Ex: Neisseria → pode ser cultivada nas placas de petri dentro de uma jarra com uma vela que é acendida e que se apaga depois de fechar a jarra 
· Como os nutrientes em solução entram nas bactérias?
· Nas gram + entram facilmente, porém nas gram - (com barreira parcialmente seletiva) é mais difícil
· Como entram as macromoléculas? Elas podem ser degradadas por enzimas hidrolíticas 
· nas gram + a enzima é secretada fora da bactéria 
· nas gram - a enzima fica no espaço periplasmático (o nutriente se liga a transportadores)
· certas exoenzimas podem atuar na virulência (hialuronidase, protease, colagenase) ou na inativação de antimicrobianos (beta lactamases)
· Após o nutriente atravessar a parede celular pode-se deparar com a membrana (com permeabilidade seletiva) → para atravessar ela pode se usar difusão simples, difusão facilitada, transporte ativo, etc 
metabolismo heterotrófico 
No citoplasma há metabolização do nutriente de forma que permita a proliferação bacteriana 
Os nutrientes na célula passam por vias metabólicas para gerar intermediários metabólicos e serem utilizados para processos anabólicos (como formação de elementos de estruturas simples: aminoácidos, lipídios e polissacarídeos)
Metabólitos secundários das bactérias → sem papel direto no crescimento ou na reprodução e sua ausência não impede o crescimento 
OBS: A endotoxina é um metabólito secundário? No caso da LPS, não, pois é essencial para a bactéria 
Função das coenzimas→ as coenzimas NAD, NADP, ou FAD+ carregam o H+ → as desidrogenases bacterianas extraem esses H+(2 H+ e 2 elétrons) → e reduzem as coenzimas (Ex> NAD + 2 elétrons + 2 H+ → NADH + H+)
Esse NADH é oxidado e transfere seu H+ para moléculas que precisam do H+ para serem ativadas 
Produção de energia → a produção de energia nas bactérias depende do tipo de aceptor de elétrons: 
· Oxidação aeróbia
· respiração aeróbia 
· ocorre a completa degradação de substrato 
· o aceptor final de elétrons estar presente na cadeia transportadora de elétrons, o oxigênio 
· o ácido pirúvico → acetil CoA → entra no ciclo de krebs → gera coenzimas que vão para cadeia transportadora de elétrons → gera energia
· grau de degradação: completo 
· exigência atmosférica: nenhuma 
· tipo de fosforilação: oxidativa 
· saldo energético: 38 ATPs
· Oxidação anaeróbia
· Respiração anaeróbica: o substrato é reduzido até um metabólito secundário (ex: lactato) e este transfere diretamente seus elétrons para a cadeia transportadora de elétrons (ou seja, não usa ciclo de Krebs) até o aceptor final, um composto diferente de oxigênio, como o Nitrato. 
· grau de degradação: incompleto 
· fosforilação: oxidativa
· saldo energético: menor que respiração aeróbia e menor que glicólise 
· Fermentação: há uma degradação parcial do substrato e o aceptor final de elétrons é um composto orgânico gerado no mesmo metabolismo bacteriano (ex: piruvato)
Tipos de produção de energia em bactérias heterotróficas
· Fosforilação ao nível do substrato → transferência do fósforo (P) do substrato para formar ADP para depois formar ATP
· Fosforilação oxidativa (quimiosmose) → a força próton-motriz gerada pelos prótons H+ na membrana celular é utilizada para produzir ATP → as coenzimas liberam seus H+ e seus elétrons são transferidos de proteína em proteína, depois os H+ são jogados fora da membrana , e logo depois eles entram por uma ATPase que usa os H+ para fosforilar ADP em ATP.
Catabolismo
Neste caso, o catabolismo pode se dar pela: 
· degradação de proteínas (bactérias usam proteases)
· degradação de ácidos graxos 
· degradação de polissacarídeos 
Catabolismo de carboidratos e as vias glicolíticas 
· EMP (Embden-Meyerhof) → onde 1 molécula de glicose gera 2 piruvatos e um saldo de 2 ATPs
· Entner-Doudoroff (via exclusivamente bacteriana) → 1 glicose gera 2 piruvatos e um saldo de 1 ATP
· Via das pentoses → 1 glicose gera uma ribose 5 fosfato que gera diferentes intermediários e um saldo de -1ATP. Esta via é mais eficiente para poder reduzir NADPH. 
OBS: Bactérias predominantemente gram - e estritamente aeróbias (como Pseudomonas) preferem a via Doudoroff. 
Uma vez feita a quebra da glicose, e gerado o ac. pirúvico, dependendo da bactéria, essa molécula pode ir para: fermentação, respiração aeróbia ou respiração anaeróbia. 
Fermentação: Na fermentação o ácido pirúvico pode ser reduzido até moléculas como ácidos, cetonas, etanol, álcool
· Características: seu aceptor final é…., 
· fermentação acética: o ácido pirúvico é transformado em etanol e depois em ácido acético 
· fermentação alcoólica: as bactérias só fazem este tipo de fermentação em pequenas quantidades 
· fermentação propiônica: ger ácido propiônico, utilizada amplamente em produção de queijo suiço 
· fermentação butanodiol ica: gera produtos neutros 
· fermentação butírica-butílica: é indesejável para a alimentação, pois acidifica a manteiga e queijos 
OBS: CÁRIES 
As cáries são causadas por bactérias que realizam fermentação lática → a bactéria inicialmente é fixado ao esmalte do dente pelo dextrano (formando um biofilme) → ao receber açúcares (como sacarose) realiza fermentação produzindo ácido lático, que corrói o esmalte e criando cavidades. 
OBS: a putrefação é um tipo de fermentação 
Principais fatores químicos e físicos que afetam o crescimento bacteriano 
· Atmosfera e Eh (potencial de oxiredução)
· Anaeróbios estritos: sua exigência para crescer é fazer respiração aeróbia (ex: pseudomonas)
· Anaeróbios facultativos: maioria das bactérias de importância médica. Pode fazer respiração aerobia e anaerobia 
· Microaerófilas: bactérias aeróbias que exigem baixas concentrações de oxigênio 
· Aerotolerantes: fazem metabolismo fermentativo porém toleram uma pequena quantidade de oxigênio 
· anaeróbios obrigatórios: inibidos/mortos na presença de oxigênio )na verdade, os metabólitos do o2)
· moderados: sobrevivem a várias concentrações de O2
· estritos: não crescem com >0,5% de O2
· extremos: não crescem com >0,3% O2 
OBS: Reações enzimáticas das degradação das formas tóxicas de O2 
· Catalase → transforma peróxido em ½ O2 + H2O
· Superóxido mutase –: transforma O2 em peróxido + O2 (este peróxido pode-se transformar em 2H2O e NAD+ 
OBS: Cultivode anaeróbios 
· meio de cultura com agente redutor de O2 (glicolato de Na+)
· jarra de anaerobiose → coloca-se as placas e uma embalagem com bicarbonato, e boroidreto de sódio dentro da jarra → se adiciona a água à embalagem, este reage e libera CO2 → o CO2 reage com o catalisador de paládio (na borda da jarra) e libera o O2 em forma de H2O fora da jarra 
· câmara de anaerobiose: troca a atmosfera subtraindo totalmente o O2, e é ótimo para anaeróbios extremos 
· pH
· a maioria das bactérias precisa de um pH neutro, poucas espécies proliferam em valores extremos, mesmo o pH intracelular é mantido neutro (inclusive nas acidófilas)
· Classificação das bactérias de acordo ao pH
· acidófilas: crescem de 1 a 5 pH, acidófilas obrigatórias não crescem em pH neutro
· neutrófilas:de 5,4 a 8,5. um exemplo é a H. pylori (no estômago, uma urease transforma a ureia em amônia, criando ambiente alcaloide para H. pylori)
· alcalófilas: de 9 a 11
· Temperatura
· Para cada microrganismo existe uma temperatura mínima, uma temperatura ótima e máxima. 
· Classificação das bactérias de acordo à temperatura
· Temperatura ótima
· psicrófilas: <20 C°
· psicrotróficas: crescem em refrigeração mas também acima de 30 C°
· mesófilas: 25 C°- 40 C°
OBS: algumas mesófilas sobrevivem a 100 C°, por que? porque estas criam esporos 
· Temperatura maxima
· termófilas: 50C°-60C°
· hipertermófilas: >80C°
· Pressão osmótica 
· a osmolaridade interna está relacionada com o meio externo
· quando a molaridade externa aumenta, a bactéria perde o H2O até a morte ou até ser inibida (bactéria submersa em solução hipertônica) 
· classificação das bactérias de acordo à concentração dos solutos no meio
· halofílicas: precisam estar em solução hipertônica (Halofílicos extremos: >30%NaCl)
· halotolerantes: ex: Staphylococcus 
Reprodução 
· Principal forma de reprodução: fusão binária 
· tempo de geração: tempo que uma bactéria leva para concluir sua reprodução. Depende de fatores genéticos e nutricionais, e pode variar muito entre espécies.
· E. coli pode demorar 10 a 12 min para se dividir 
· M. tuberculosis demora 24h para fazer 1 divisão
· curva de crescimento
Aula 4: Microbiota humana
· Constituída por organismos residentes, permanente ou transitórios encontrados em certos sítios anatômicos (principalmente em pele e mucosas) → mucosas oral, nasal, laringe, intestinal, vaginal e uretra distal. 
· Microbioma: diz respeito aos genes que constituem a microbiota 
· Sítios normalmente estéreis: alvéolos, bronquíolos, mucosa uterina, bexiga, sangue, fígado, baço, SNC
· A microbiota vai se instalando a partir do nascimento, e vai mudando durante a vida do indivíduo até sua morte 
· Se um bebe nasce por parto normal, ele adquire microbiota do canal vaginal, se nasce por cesariana, a microbiota será do ambiente hospitalar 
· A microbiota humana abrange microorganismos saprófitas (usualmente não causam doenças) e oportunistas, que estabelecem diferentes relaçoes entre eles e com o hospedeiro (relações ecológicas como comensalismo, mutualismo, comensalismo) 
· Bactericidas: são metabólitos que podem afetar ou matar microrganismos da mesma espécie ou espécie diferente 
· Microbiota residente 
· caracterizada por sapróbios de baixa virulência 
· pronto restabelecimento quando perturbada
· influenciada por fatores como idade e sexio 
· não removida totalmente por processos de limpeza e antissepsia 
· composição: é influenciada por condições e hábitos do hospedeiro
· importância: dificulta a implantação de patógenos (antibiose), ocupação de receptores, a alteração do pH, auxilia na absorção de nutrientes, síntese de vitaminas , estimula maturação do sistema imune 
· exemplos de efeitos desfavoráveis dessa microbiota residente:
· bromidrose→ odores desagradáveis 
· cáries 
· infecções oportunistas → colite pseudomembranosa, causada por Clostridium difficile, decorrente do uso de antibiótico de amplo espectro
· superinfecção→ segunda infecção decorrente do uso de antibiótico para uma primeira infecção 
· disbiose→ alterações na composição do microbioma intestinal com favorecimento de microrganismos que interrompam a homeostase do hospedeiro, determinando processos inflamatórios 
· infecções oportunistas devido a alterações locais (ex: aumento de umidade= candidíase)
· infecção devido à migração do microorganismo a outro sítio anatômico 
· infecção decorrente de bacteremia fisiológica: endocardite subaguda causada por streptococcus vidas, em pacientes com lesão vascular) 
· Microbiota transitória 
· microrganismos não patogênicos e potencialmente patogênicos 
· presente somente temporariamente no sítio anatômica influenciada pelo ambiente 
· fácil removida pelos procedimentos de limpeza e de fácil eliminação por antissepsia 
· Animais com microbiota tendem a responder muito mais rápido a estímulos antigênicos do que animais axênicos (que foram criados em total assepsia, sem contato com microrganismos, em ambiente estéril)
· OBS: antisséptico E desinfetante
o primeiro visa controlar a presença de agentes infecciosos em seres vivos, o segundo é para superfícies 
· OBS: Probióticos OU prebióticos 
o primeiro são microrganismos vivos que quando administrado exercem efeitos benéficos ex: lactobacillus 
o segundo são carboidratos não digeríveis que estimulam a implantação de probióticos 
· Infecção: 
· endógena → criada a partir de microrganismos da microbiota 
· exógena → a partir de fontes externas ao paciente 
· autógena → por microrganismos do paciente mas que pode ter origem hospitalar ou comunitária 
· Exemplos de mecanismos de controle ou proteção do hospedeiro 
· Estruturas anatômicas 
· integridade do epitélio = barreira 
· válvulas e esfincteres do trato digestório 
· tamanho da uretra (no homem) 
· mecanismos químicos 
· lisozima → quebra ligação beta 1,4 do PEG 
· Ácidos graxos da pele → decorrentes das glândulas sebáceas que tem ação antimicrobiana 
· pH 
· Ácidos e sais biliares 
· defensinas 
· Ações fisiológicas 
· fluxos unidirecionais 
· peristalse 
· movimento ciliar e produção de muco 
· IgA secretaria (em mucosas) e macrofagos alveolares 
· Principais sítios colonizados e alguns membros importantes da microbiota 
· Pele 
· possui microbiota bem definida
· mecanismos de eliminação: lisozima, pH baixo, ácidos graxos 
· principais espécies: Staphylo, Curtobacterium, Coryumbacteria, Malassezia (fungo)
· Cutibacterium → bastonetes gram+, aerotolerantes, crescimento lento, gera acne vulgar, são contaminantes de hemocultura 
· Trato respiratório 
· cavidades nasais → cianobactérias, staphylo epidermidis s aureus 
· cavidades orais→ strepto viridin, treponema, fusobacterium, haemophilus
· Trato digestório 
· estômago → geralmente não apresenta ou é pouco numerosa 
· intestino delgado → predomínio de gram +
· intestino grosso → 96% de bactérias anaeróbias, bacteroides, bifidobacterium, enterococcus 
· Trato geniturinário 
· Microbiota vaginal → varia com a idade, pH, secreção hormonal 
· Microbiota de Doderlein → predomínio de Lactobacillus 
· Microbiota da uretra (distal) → microbiota mista, enterobactérias podem estar presentes 
aula 5: Métodos físicos de controle de microorganismos
· Esterilização→ Ação de tornar estéril, implica na ausência de microrganismos viáveis por destruição ou remoção. Os microrganismos clássicos e infecciosos são bactérias, fungos e endósporos. Além desses, também são infecciosos os vírus, viróides, virusóides e príons
· Filtração esterilizante → Remoção completa das formas clássicas de microrganismos. Possuem membranas filtrantes com poros de 0,45 µm ou 0,22 µm. 
· Filtração esterilizante para líquidos
· Membrana + Suporte Cartuchos de filtração
· Filtração esterilizante para gases 
· Filtro HEPA (High efficiency particulate air) 
· Aplicações diferenciadas de filtros esterilizantes → Análises microbiológicas → Permite a análise de grandes volumes e o controle de qualidade de líquidos como água de consumo, água mineral, refrigerantes e sucos. 
· Temperaturas elevadas 
· Calor seco→ Tem como princípioa oxidação destrutiva da matéria orgânica. Utilizado em vidrarias, substâncias em pó, óleos e metais, desde que sejam compatíveis com a temperatura usada.
Exemplos: 
· Forno de esterilização
· Flambagem 
· Túnel de esterilização por infravermelho 
· Incineração 
· Calor úmido → Atua na desnaturação de macromoléculas catalisada pela água. É ineficaz para alguns tipos de endósporos bacterianos que podem sobreviver por horas. Só alcança até 100º C. 
· Calor úmido sob pressão 
· Tipos de autoclave 
❖ Gravitacional – O vapor gerado força a saída do ar residual pela válvula de escape.
 ❖ Vácuo Prévio 
➢ Pré vácuo – O ar residual é removido com bomba de vácuo acoplada, no início do processo. 
 ➢ Vácuo fracionado – No início do processo são feitos ciclos alternados de vácuo e injeção de vapor.
· Monitoramento do processo na autoclave 
❖ Manômetro de dupla escala 
❖ Válvula do tipo contra-peso para regular a pressão 
❖ Válvula para saída de ar residual
· Monitoramento físico do processo de autoclavação 
❖ Rastreabilidade
➢ Registro impresso local 
➢ Registro eletrônico 
· Indicadores químicos 
➢ Classe I – Indica se ocorreu ou não o processo, como por exemplo, a fita zebrada. 
➢ Classe II – Indicadores para uso em testes específicos, usados somente em autoclaves de vácuo prévio. 
➢ Classe III – Não recomendado pela Anvisa 
➢ Classe IV – Não recomendado pela Anvisa 
➢ Classe V – Indicadores integradores.É um indicador de pacote, colocado dentro de cada pacote a ser esterilizado, como para material cirúrgico. 
➢ Classe VI – Indicadores emuladores. Atua simulando o indicador biológico, só reage caso os três parâmetros sejam atingidos em no mínimo 95%. 
· Indicadores biológicos 
➢ 1ª Geração – Filtro de papel impregnado com endosporos. Após a autoclavagem a fita é colocada no meio de cultura para verificar o crescimento. Tem como limitação o tempo prolongado para o resultado. 
➢ 2ª Geração – Suspensão de endósporos + meio de cultura. Tira impregnada de esporos é acondicionada em ampola separada do meio de cultura. Após a esterilização, a ampola é quebrada e entra em contato com o meio. Deve ocorrer incubação por 48 horas e a leitura é feita por mudança de pH. 
➢ 3ª Geração – Endosporos + meio de cultura + reagente fluorogênico que emite luz quando irradiado. A leitura é em três horas. 
· Radiação esterilizantes 
· Radiação ultravioleta→ Tem comprimento de onda entre 40 e 400 nm. A maior ação antimicrobiana se dá em 260 nm. O principal mecanismo de ação é a formação de dímeros de timina. 
· Radiações ionizantes→ A principal é a radiação gama. Possui alto poder de penetração, uma vez que tem alta frequência, alta energia e comprimento de onda baixo. Atua a partir da ionização da água, com a formação de radicais livres que interagem com a matéria. 
Aula 6: métodos químicos de controle de microorganismos
· A higienização das mãos é reconhecida mundialmente como uma medida primária, sendo considerada um dos pilares na prevenção e controle de infecções relacionadas à assistência à saúde, como doenças transmitidas por água e alimentos.
· Terminologia dos produtos químicos 
• Antisséptico – Usado em peles e mucosas
 • Desinfetante – Usado em superfícies inanimadas 
• Sanitizante – Usado em superfícies inanimadas onde são manipulados alimentos e eventualmente em alimentos.
Conceito de antissepsia e seus desdobramentos 
· Antissepsia é o procedimento que visa controlar a presença de agentes infecciosos com emprego de substâncias química (antisséptico), podendo ser realizado na pele ou em mucosa, integra ou lesada, com objetivo de prevenir ou tratar infecções.
· Antissépticos são produtos farmacêuticos que possuem na sua composição um ativo com ação antimicrobiana sobre formas vegetativas de microrganismos e agentes infecciosos, como os vírus.
· Não atua em esporos. 
· Esses produtos não possuem ação seletiva, atuando indiscriminadamente sobre microrganismos da microbiota residente, da microbiota transitória ou agentes infecciosos. 
· Possuem apresentações diferentes para uso na pele ou mucosas íntegras, podendo ser soluções aquosas ou alcóolicas, enquanto em peles ou mucosas lesadas, são soluções aquosas. 
OBS: Diferença entre antissepsia e assepsia → A antissepsia é a higienização antisséptica feita com água, sabão e antisséptico em procedimento padrão. Já a assepsia é o conjunto de procedimentos e processos que visam o controle da presença de microrganismos em um local, feito a partir da antissepsia, autoclavagem, desinfecção e radiações ionizantes. 
Tipos de métodos de limpeza de mãos
 
• Higienização Simples Realizado com água e sabão. Remove sujidades e microbiota transitória, porém não altera a microbiota residente. 
• Higienização Antisséptica Realizado com água, tensoativo e antisséptico em procedimento padrão. Remove sujidades, remove ou elimina a microbiota transitória e reduz a microbiota residente. 
• Fricção Antisséptica com Preparações Alcoólicas em Gel Utiliza somente a preparação alcoólica em gel (álcool em gel). Não remove sujidades, elimina a microbiota transitória e reduz a microbiota residente, porém somente em situações em que as mãos estão limpas. O procedimento é comprometido uma vez que a microbiota eliminada continua nas mãos e se acumula com o uso contínuo do gel, já que ele não remove sujidades. 
• Antissepsia Cirúrgica da Pele das Mãos Realizada com água, tensoativo, fricção e antisséptico em procedimento padrão. O processo de utilização de água, tensoativo e fricção é conhecido como degermação. A fricção garante maior eficácia ao processo uma vez que intensifica a remoção dos microrganismos. Há remoção intensificada das sujidades, remoção ou eliminação da microbiota transitória e redução expressiva da microbiota residente. 
Aspectos importantes relacionados a antissepsia 
• Efeito microbicida – Lisa ou inibe a multiplicação dos microrganismos de forma irreversível. 
• Efeito microbioestático – Inibe a multiplicação dos microrganismos de forma reversível, quando reduz a concentração as bactérias voltam a se multiplicar. 
• Efeito residual – Resíduos do antisséptico ficam no tecido inibindo a multiplicação dos microrganismos. Geralmente está associado ao efeito microbiostático. 
• Antissepsia profilática – Uso do antisséptico para prevenir a infecção. 
• Antissepsia terapêutica – Uso do antisséptico para tratar a infecção. 
• Ação antimicrobiana dos antissépticos – Atuação de forma indiscriminada sobre saprófitas e patogênicos. 
Critérios para seleção de ativos antissépticos pela indústria farmacêutica 
Não deve ser irritante 
Não deve ser cáustico 
Não deve ser citotóxico 
Não deve causar hipersensibilidade 
Deve ter amplo espectro de ação sobre agentes infecciosos 
Ativos de produtos antissépticos
 • Álcool etílico 
Líquido – Hidratado de 60 a 90% 
Gel – Composto por álcool etílico 70%, ácido poliacrílico para formar o gel, trietanolamina para neutralizar o pH e glicerina para impedir o ressecamento da pele. O álcool possui um efeito desidratante que provoca o fechamento da rede de polissacarídeos do peptideoglicano de forma a diminuir a permeabilidade do peptideoglicano, limitando a entrada do álcool na célula. 
• Clorexidina → Causa desorganização dos fosfolipídios da membrana celular, deixando a célula inviável. 
• Iodóforos Além de atuar como oxidante, se liga à tirosina e forma o composto di-iodotirosina de forma a prejudicar a ação das proteínas dos microrganismos. 
• Triclosan→ Mecanismo de ação dos ativos de antissépticos. Inibe a ação da enzima enoilACP redutase, impedindo a síntese de ácidos graxos.
• Solução de peróxido de hidrogênio (3%) → Atua como oxidante. Pode ser usado para a antissepsia terapêutica e profilática de feridas, principalmente quando há suspeita de presença de bactérias anaeróbias. 
Teste de atividade de antisséptico 
• Teste de atividade bacteriostática – De difícil padronização para avaliação comparativa de ativos diferentes de antissépticos, porque possuem diferentes hidrossolubilidades, com diferentes capacidades para se difundir no meio.O resultado é qualitativo. 
• Teste de disco difusão 
Outras terminologias
Diferença entre procedimento vs processo → Procedimento é um método feito por humanos. Deve conter informações sobre quem fez, revisou, aprovou e valido e Processo é um método feito por equipamentos.
Aula 7: Genetica Bacteriana 
· Aplicações
· Estudo para variabilidade e evolução das espécies;
· Ferramenta para estudos moleculares do funcionamento celular;
· Vacinas;
· Detecção de substâncias com potencial carcinogênico;
· Mecanismos regulatórios de fatores de virulência;
· Estudos epidemiológicos;
· Diagnósticos laboratoriais.
· Estruturas genéticas
· Cromossomo→ DNA de fita dupla, enovelado e compacto no citoplasma, geralmente é único e circular. Não possui membrana, histonas e íntros.
· Recombinação homóloga → Requer homologia de no mínimo centenas de pares de bases, necessita da presença da proteína Rec A, que promove o emparelhamento dessas regiões.
· Recombinação específica→ Necessita de pouca ou nenhuma homologia e não tem participação da proteína Rec A. Ocorre integração de DNA de fagos, elementos de transposição e integrons, a parti de uma área de reconhecimento.
· Plasmídeo → Estrutura facultativa constituída de DNA circular de fita dupla, livre no citoplasma ou integrado no cromossomo. Carrega informações acessórias para a célula bacteriana, ou seja, que são dispensáveis para sua sobrevivência.
· Plasmídeo F→ Presente em bactérias G-. Esse plasmídeo é um fator de fertilidade que permite a conjugação entre bactérias Gram negativas. A célula pode ser classificada como F+ ou HFR. A primeira possui o plasmídeo autônomo no citoplasma, enquanto a segunda tem o plasmídeo integrado no citoplasma, se chama high frequency of recombination porquê sofre diversas recombinações. 
· Outros plasmídeos → Existem diversos tipos de plasmídeos, como o R, que garante à bactéria resistência aos antimicrobianos. Quando a bactéria contém ambos R e região do fator F é chamada de RTF, fator de transferência de resistência.
· DNA fágico: Existem dois tipos de bacteriófagos: os de ciclos líticos e os de ciclo lisogênico.
· Ciclo lítico → Fagos de RNA ou DNA que promovem lise da bactéria. Inicialmente ocorre colisão e adsorção do fago, com posterior injeção do material genético na bactéria, que tem o seu DNA quebrado. Ocorre síntese do genoma viral e de suas proteínas para formação de seu corpo. Depois das proteínas sintetizadas, os bacteriófagos são montados e saem da bactéria por meio de sua lise. 
· Ciclo lisogênico → Ocorre somente com fagos de DNA dupla fita.O bacteriófago colide com a bactéria, adsorve e injeta seu material genético. O DNA exógeno fica em formato circular e se integra ao DNA bacteriano. O fago integrado passa a se chamar profago. É sintetizada proteína que reprime a replicação do vírus de modo que el e permanece integrado ao DNA bacteriano durante o ciclo de vida e reprodução da bactéria, sendo transmitido para várias gerações. Em determinado momento, a proteína repressora é inativa de maneira espontânea ou induzida. Nesse momento, o vírus entra em ciclo lítico, com produção de suas proteínas e montagem do corpo para liberação por meio de lise.
· Conversão lisogênica / fágica → O bacteriófago carrega um gene, diferente daqueles que utiliza em sua replicação, que é expresso na bactéria e garante para a célula uma característica. É o caso da toxina diftérica.
OBS: CRISPR → São repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas que promovem imunidade aos bacteriófagos.
1. Ocorre injeção do material viral;
2. A proteína Cas 1 integra uma parte do genoma viral no lócus CRISPR do genoma bacteriano;
3. Transcrição do lócus CRISPR, produzindo um longo DNA chamado pré-crRNA.
4. Este RNA é processado em pequenos crRNAs maduros e funcionais, que posteriormente se ligam a proteínas Cas.
5. Os complexos Cas-crRNAs atuam como exploradores. Quando o genoma viral invade novamente, ele será reconhecido pelo complexo explorador e clivado pela Cas.
· Elementos de transposição→ São pequenas sequências de DNA que codificam transposase e podem se transpor de um sítio genético para outro. Realizam recombinação do tipo específica porque necessitam de poucas ou nenhuma área de homologia. Como consequência da transposição, ocorre mutações, alteração da sequência de nucleotídeos, ativação ou inativação de genes.
• Tipos de elementos transponíveis
· Sequências de inserção (IS) → Apresenta somente os genes necessários para a transposição e a enzima transposase codificada.
· Transposons (TN) →Contém diversos genes além dos responsáveis pela transposição, como os de resistência à antimicrobianos. A transposição pode ocorrer a partir do deslocamento da sequência, em que fica um “buraco” na fita em que o transposon estava anteriormente. 
· Transposons conjugativos → A transferência ocorre por conjugação entre as bactérias, principalmente as G+. O transposon se desprende do DNA da bactéria e assume a forma circular, com uma fita interna e outra externa. A fita externa é transferida da bactéria doadora para a receptora. Na bactéria doadora, a fita interna que ficou é utilizada como molde para recompor o transposon, que novamente é integrado ao genoma bacteriano. Já na bactéria receptora, a fita que é usada como molde é a externa e, após o processo, o transposon é inserido no genoma.
· Integrons → Classe de elementos móveis que capturam, mobilizam e integram cassetes (são elementos móveis que contém um gene e um sítio de recombinação)
· O integron completo contém: gene da enzima integrase, promotor para expressar o gene do cassete, sítio de recombinação que se liga ao sítio do cassete e cassete. Pode conter diversos cassetes.
· Ilhas genômicas → São blocos de genes que codificam características particulares, como as ilhas de patogenicidade (PAI) que garantem os genes virulentos das bactérias.
· As PAIs possuem múltiplos genes de virulência e estão presentes em amostras patogênicas de uma espécie
· Variações genéticas – Mutações
São alterações na sequência de DNA que podem ocorrer de maneira espontânea ou induzida. Afeta características antigênicas, metabólicas, patogênicas...
Essa variação pode ser utilizada para verificar se uma substância é mutagênica, por exemplo, por meio do Teste de Ames.
· Variações genéticas – Transferência horizontal de genes → Confere propriedades adaptativas.
· Conjugação→ Transferência de DNA de uma bactéria para a outra, mediado por plasmídeo conjugativo ou transposon conjugativo.
· Tem como importância médica a transferência de genes de resistência a antimicrobianos.
· Entre Gram negativa
· Para realizar um experimento de conjugação, é necessário uma bactéria doadora e uma receptora de genes. Para a leitura, é desejável que a receptora possua um marcador estável para ser reconhecida, como um gene de resistência antimicrobiana de preferência cromossômico.
· F+ x F- → Ocorre entre bactérias Gram negativas com F+ e bactérias Gram negativas.
· O plasmídeo F+, presente na bactéria doadora, possui gene para o pili sexual e o codifica. O pili se liga à bactéria receptora e sofre uma retração, aproximando doadora e receptora. É aberto um canal de comunicação. A fita externa do plasmídeo é clivada e, através do canal, é passada para a receptora, assumindo forma circular. Ocorre formação da fita interna e a bactéria passa a ser F+. Já na doadora, a fita interna que ficou origina a externa. Esta bactéria ainda é caracterizada como F+.
· Esse processo dura cerca de dois minutos.
· HFR x F- → Ocorre entre bactérias Gram negativas HFR e bactérias Gram negativas.
· A bactéria que contém o plasmídeo, doadora, codifica o pili sexual e se liga à receptora. Parte desse pili é reabsorvido, aproximando as duas e há abertura de ponte. Ocorre quebra da fita externa do cromossomo, que se desloca para a receptora, geralmente apenas o pedaço que contém o plasmídeo é transmitido.
· Na bactéria doadora, caso haja áreas de homologia, ocorre recombinação, com a nova sequência entrando no lugar da anterior. A bactéria passaa ser uma bactéria recombinante. A bactéria doadora tem seu cromossomo reconstituído e continua sendo HFR.
· Quando não há área homóloga, o DNA que chega é degradado.
· A transferência de todo o material cromossomial ocorre em aproximadamente 100 minutos.
· F’ x F- → O plasmídeo F pode se integrar ao cromossomo e se desprender. Quando isso ocorre, pode carregar consigo um gene vizinho, que é passado por meio da conjugação para outras bactérias.
· Entre Gram positivas
· Apenas plasmídeos são transferidos, sem a participação de pili.
· Inicialmente, a bactéria receptora produz e libera uma proteína chamada feromônio. Essa proteína penetra na doadora e estimula o plasmídeo a produzir proteínas agregativas que permitem a ligação entre doadora e receptora. Quando ocorre a união, abre uma ponte e é feita transferência de uma cópia do plasmídeo. Após receber o plasmídeo, a bactéria receptora não produz mais o feromônio e se torna doadora.
· Nanotubos → Mecanismo de transferência de moléculas, proteínas e ácidos nucléicos que ocorre somente em meio sólido. Pode acontecer entre diferentes espécies.
· Transformação → Bactérias em estado fisiológico de competência captam DNA solúvel do meio e são capazes de incorporar em seu genoma. Estado de competência é aquele em que a bactéria é capaz de sintetizar diversas proteínas, como proteínas ligadoras de DNA, autolisinas (lise da parede celular), nucleases (degrada DNA), proteínas de competência (ligam-se ao DNA exógeno e o protegem da degradação) e proteínas de recombinação (Rec A).
1. Inicialmente o DNA exógeno se liga a proteínas ligantes de DNA de bactérias em estado de competência.
2. Uma das fitas do DNA exógeno é clivada por nucleases do hospedeiro e ocorre penetração da fita simples.
3. A fita simples que entra se liga a proteína de competência
4. A Rec A promove emparelhamento da fita simples exógena na área de homologia da bactéria receptora.
5. Ocorre integração.
Os plasmídeos entram intactos na célula.
Pode ocorrer transformação artificial, como da Escherechia coli. Para isso é necessária uma solução hipotônica de CaCl2, DNA exógeno e temperatura de 40º C por pelo menos 90 segundos, para ocorrer alteração na permeabilidade dos envoltórios. Também pode ser feito por pulso elétrico.
· Transdução → Transferência de genes mediada por bacteriófago. Pode ser generalizada, quando qualquer gene pode ser transferido, ou especializada, quando somente certos genes são transferidos.
· Generalizada com ciclo lisogênico
· Durante a monta do bacteriófago, o capsídeo pode empacotar um pedaço do cromossomo bacteriano que foi degradado, em vez do genoma viral.
· Quando é liberado na lise, o bacteriófago consegue se ligar à nova bactéria e injetar esse material que não pertence a ele. Caso exista área de homologia, ocorre recombinação entre o material genético da bactéria hospedeira anterior e da nova.
· Generalizada com ciclo lítico
· Quando o profago se desprende do cromossomo bacteriano, pode levar genes devido ao corte incorreto. Os novos fagos infectam bactérias com o genoma que contém pedaços de DNA da bactéria hospedeira anterior.
· Especializada → Ocorre quando os fagos de ciclo lisogênico sempre se integram aos mesmos sítios e quando liberam o profago carregam toda vez o mesmo gene da bactéria hospedeira.
Técnicas de genética molecular para diagnóstico e tipagem
• Aplicações relativas a plasmídeos
-Estudos epidemiológicos – Perfil de restrição plasmidial para comparar plasmídeos de várias amostras.
-Construção de plasmídeos recombinantes para transformação – clivagem com enzima de restrição e conexão com enzima ligase.
Engenharia genética – Criação de vacinas.
• Sonda genética
Sequência conhecida de DNA fita simples marcada com fluorescência. Usada para identificar sequências complementares por hibridação.
Dot-Blot – Ocorre em membrana de nitrocelulose.
Southern-Blot – O DNA da amostra é separado por eletroforese e transferido para membrana com sonda, onde sofre hibridização.
Nothern-Blot – O DNA é separado por eletroforese e é utilizada sonda de DNA para pesquisa de RNA.
• PCR
• PFGE – Pulsed field gel eletrophoresis
Utiliza enzimas que realizam pequenos cortes e utiliza campos elétricos em direções alternadas para análise dos perfis de restrição. É possível diferenciar amostras da mesma espécie.
• Sequenciamento
Diferencia determinadas espécies por sequência nucleotídicas de genes. Permite detectar diferenças sutis entre amostras de uma espécie. Mostra similaridades genômicas abaixo do nível de espécie.
• MLST – Multilocus Sequence Typing
Amplificação e sequenciamento de 7 genes essenciais constitutivos conservados (housekeeping), formando um perfil alélico ou sequence type. Esse perfil é introduzido em base de dados para análise filogenética. Se tem o mesmo perfil é o mesmo clone ou mesmo sequence type.
Aula 9: meios de cultura 
· Meio de cultura é uma formulação de substâncias em forma líquida, fluida, semisólida ou sólida com constituintes naturais ou sintéticos, visando o suporte para a multiplicação ou preservação da viabilidade de micro-organismos.
· Algumas bactérias como Treponema pallidium e Mycobacterium leprae não são cultiváveis.
· Aplicações 
• Isolamento de bactérias em cultura pura 
• Identificação bioquímica 
• Quantificação de micro-organismos 
• Teste de suscetibilidade (TSA) 
• Água destilada ou deionizada; 
• Nutrientes básicos 
• Fatores de crescimento; 
• Ágar; 
• Acerto de pH – HCl ou NaOH. 
• Fatores não associados ao meio O2; Temperatura; 
OBS: Cultura de células – Chlarmydia e Rickettsia são parasitas intracelulares obrigatórias. 
· Tipos gerais de meios de cultura 
• Sintéticos ou de composição definida – Há conhecimento sobre a estrutura molecular e grau de pureza; 
• Complexos – Conhecimento não é absoluto; 
• Desidratados – São comprados prontos, extremamente hidroscópicos; 
• Confeccionados – Feitos in house. 
· Ágar→ É um polissacarídeo extraído de algas marinhas que não é degradado por bactérias. Garante consistência ao meio de cultura. Sua fusão (fica líquido) em 100º C e solidifica em menos de 45º C. 
· Classificação dos meios 
• Simples – Para bactérias pouco exigentes, pode ser usado como base para outros meios. 
– Ágar simples ou Ágar nutriente → Possui peptonas e extrato de carne ou levedura. 
• Enriquecido → Usado para bactérias fastidiosas, possui adição de sangue, soro, complexos vitamínicos, entre outros. 
– Ágar sangue → Formado por meio base mantido à 50º C acrescido de 10% de sangue difibrinado.
– Ágar chocolate → Formado por meio base mantido à 80º C acrescido de 10% de sangue difibrinado. A alta temperatura promove lise dos eritrócitos e liberação de fatores de crescimentos, como o fator V necessários para a bactéria Haemophillus influenzae. Esses fatores não estão presentes no ágar sangue. 
• Meio indicador ou diferencial – Fornece alguma característica da fisiologia da bactéria. 
– Ágar sangue – pode ser usado para verificar se a bactéria faz lise de hemácias. • Seletivo e seletivo indicador → Contém componentes que impedem o crescimento de bactérias que não são de interesse e permite o crescimento daquelas de interesse. A seletividade é garantida com corantes, sais biliares, antibióticos, modificadores de pH .
Os indicadores são vermelho de fenol, púrpura de bromocrezol, azul de bromotimol e vermelho neutro.
 A seletividade pode ser baixa, média ou alta. 
– Ágar EMB (eosina e azul de metileno) → Isola bactérias Gram negativas, principalmente bastonetes não fastidiosas, como as enterobactérias e Pseudomonas. – Ágar MacConkey→ Presença de sais biliares e cristal violeta, o indicador de pH é o vermelho neutro, possui peptonas. Inibe bactérias Gram positivas, permitindo o crescimento de Gram negativas como enterobactérias e Psedomonas. 
– Ágar manitol salgado → Utiliza como agente seletivo NaCl a 7,5% e como indicador de pH o vermelho de fenol. Permite o isolamento de Staphylococcus aureus porque essa bactéria tolera alta concentração de sais e fermenta o manitol. 
· Meios cromogênicos → Contémingredientes que promovem mudança da cor de bactérias durante seu crescimento. – Agar Thayer-Martin chocolate → Formado por ágar chocolate, fatores de crescimento e antibióticos, o que deixa o meio seletivo e enriquecido. 
– Löwenstein Jensen → A base desse meio é constituída de ovos e o agente seletivo é o verde malaquita, que inibe bactéria Gram positivas. Muito usado para micobactérias. 
– Ágar Sabouraud → Composto de peptona e glicose em alta concentração (4%). A seletividade ocorre pela escassez de nutrientes e pH 5,6. Utilizado especialmente para fungos, pode-se adicionar antibiótico para inibir bactérias em geral. 
• Meio de enriquecimento – Contém componentes que permitem o crescimento mais rápido de bactérias de interesse e retarda o crescimento de outras bactérias. Em sua maioria são líquidos. 
– Tetrationato de Kauffman → Pode-se adicionar substâncias que dão seletividade ao meio, como o verde brilhante (malaquita).
 • Meio de triagem – Informa sobre o metabolismo da bactéria. 
– KIA (Ágar Ferro Kligler) → Composto por glicose em baixa concentração, lactose, peptonas, citrato férrico e vermelho de fenol, que em meio ácido fica amarelo e em meio básico fica carmim. A semeadura ocorre por meio de picada em profundidade e estria na superfície, após isso deve-se avaliar o comportamento entre 18 e 24 horas e escolher o meio mais apropriado para continuar a identificação. Permite evidenciar os seguintes resultados, em ordem de tubos: 
❖ Gases – Além de ocorrer fermentação da glicose e da lactose, acidificando o meio (amarelo), há produção de gases. 
❖ Fermentação da glicose e da lactose – Fermenta ambos os açúcares, gerando muito ácido e assumindo cor amarela.
 ❖ Fermentação somente da glicose – A base fica ácida (amarela) enquanto o topo fica alcalino (carmim). A glicose é usada nas primeiras horas de crescimento, porém devido à sua baixa concentração acaba rapidamente. Para o crescimento continuar é feita descarboxilação oxidativa das peptonas. 
❖ H2S – Fermenta somente a glicose e produz sulfeto de hidrogênio. Acidifica o meio nas primeiras horas, quando ainda utiliza a glicose e posteriormente usa as peptonas, deixando a superfície alcalina (carmim). O H2S produzido reage com o ferro e produz um precipitado preto. Essa reação ocorre somente se o meio já estiver acidificado. 
❖ Não sacarolítica – Não utiliza a glicose nem lactose, já que não quebra açúcares. Ocorre reação alcalina (carmim) uma vez que as peptonas são consumidas. 
· Meios de identificação – Específicos para reações bioquímicas e provas fisiológicas.
· Meios para fermentadores de açúcares 
· Meio líquido com presença H2O peptonada, um tipo de açúcar e um indicador de pH. É colocado um tubo de Durhan de cabeça para baixo para concluir se a bactéria produziu gases a partir da metabolização do açúcar. 
· Meio de SIM Meio semi-sólido que permite verificar a motilidade da bactéria, a presença de H2S e de Indol, um produto derivado da degradação do triptofano. Quando há presença de fundo preto, houve produção de H2S, a motilidade é vista a partir da turbidez do meio e a presença de indol é verificada a partir do Reativo de Kovac’s que forma um alo rosa quando existe indol no meio. 
· Meio de O/F – Glicose (Hugh & Leifson) Verifica se a bactéria oxida ou fermenta a glicose. O meio contém glicose, indicador de pH e peptonas. Inicialmente é feita a semeadura da bactéria em dois tubos distintos. Em um deles é acrescentado óleo mineral estéril e depois a bactéria é incubada. Se a bactéria faz fermentação, ocorre produção de ácido nos dois tubos, com e sem óleo. O indicador vira para o amarelo. Se a bactéria for não sacarolítica, o meio fica azul devido o consumo das peptonas. Se a bactéria faz oxidação, não ocorrerá reação no meio fechado com óleo, uma vez que esse ingrediente deixa o meio em anaerobiose, logo, esse meio não se altera. A oxidação é um processo aeróbico que gera ácido fraco, causando uma acidificação na superfície do tubo.
 • Meios de transporte – Utilizado para a manutenção da viabilidade da bactéria até chegada em laboratório. Não apresenta nutrientes necessários para reprodução e crescimento. -Cary-Blair, Meio de Stuart’s, Meio de Amie’s, Glicerol-salina tamponada – Caiu em desuso. 
• Meio de estocagem – Preservação da viabilidade do micro-organismo quando a cultura não está sendo utilizada. Armazenagem e repique periódicos Liofilização, armazenamento no -70º C e -196º C Necessitam da presença de um crioprotetor. 
· Preparação do meio 
1. Pesagem; 2. Adição de água recém destilada ou desmineralizada com pH mais próximo da neutralidade; 3. Dissolução por calor; 4. Esterilização – autoclavar em 120º C por 15 minutos; 5. Distribuição 6. Teste de esterilidade.
AULA 10: ANTIMICROBIANOS (PDF)
AULA 11: TSA (PDF)
AULA 12: PATOGENICIDADE BACTERIANA 
Postulados de Koch
· Microorganismos são encontrados sempre nos doentes, mas nunca nos sadios;
· Devem ser isolados do animal doente e crescer em cultura pura;
· Após isolado, devem causar a doença original quando inoculados em animais suscetíveis;
· Deve ser reisolado do animal que foi infectado experimentalmente. 
Conceitos
· Patógeno – Microrganismo capaz de causar dano ao hospedeiro, não necessariamente doença. Pode ser primário (estrito) que causa doença regularmente em parcela dos indivíduos saudáveis e oportunista, que causa doença quando há comprometimento das defesas inatas ou adquiridas.
· Infecção – Penetração, estabelecimento e multiplicação do patógenos nos tecidos do hospedeiro. A infecção pode ser seguida de eliminação do microrganismo pela resposta imune. O patógeno pode se tornar parte da microbiota e não causar efeitos no hospedeiro, deixando-o como portador e transmissor. 
· Doença infecciosa – Expressão clínica da infecção que acontece quando a homeostasia do hospedeiro é rompida. 
· Colonização – Implantação transitória ou permanente do microrganismo sem interferir com as funções normais do corpo. Alguns autores consideram o primeiro estágio da infecção. 
· Doença pós-infecciosa – O dano gerado a partir de uma infecção persiste mesmo quando o microrganismo é eliminado pelas defesas do hospedeiro. É o caso da febre reumática. 
· Intoxicação – Ingestão de toxina pré-formada do microrganismo, como a intoxicação estafiloccócica. Classificada como doença de transmissão alimentar (DTA).
· Toxinfecção alimentar – Toxina é liberada dentro do hospedeiro, durante a infecção. Classificada como DTA.
· Virulência – Medida quantitativa dos danos causados pelos microrganismos no hospedeiro, patogenicidade.
Virulência É afetada por várias variáveis, como fatores de virulência, dose infectante, a menor dose de microrganismo capaz de causar a doença, vias de entrada, defesas do hospedeiro e modelo animal testado. 
É quantificada pela DI50, número de microrganismos capazes de causar doença em 50% da população e DL50, número de microrganismos capazes de matar 50% da população. 
Atualmente a comparação relativa da virulência ocorre por cultura de células, marcadores genéticos e testes fenotípicos.
· Teste de Kanagawa – Uso de ágar Wagatsuma (sangue) para verificar se ocorre hemólise completa. Usado para amostras patogênicas de Vibrium parahaemolyticus.
· Vermelho Congo – Verifica se há produção de biofilme. Quando há coloração vermelha, não houve produção de biofilme.
· Modelo in vivo com invertebrados
· Caenorhabditis elegans – Nematódeo transparente em que é possível avaliar os efeitos de uma infecção ou exotoxina via alimentação. A limitação é o crescimento até 25º C.
· Embriões de Zebrafish – A sua transparência permite acompanhar a infecção por microscopia. Por serem muito pequenos, é possível utilizar placa de microtitulação e gerar grande número de animais. 
· Larvas de Galleria mellonella – Possuem mecanismo de imunidade inata semelhante aos dos mamíferos e o seu tamanho facilita a coleta de tecido e hemolinfa após inoculações.
· Principais vias de entrada
· Trato respiratório;
· Trato digestório;
· Trato genito-urinário;
· Conjuntiva
· Pele – Mediante portade entrada
· Fatores de virulência 
São produtos estruturais ou solúveis que atuam na invasão, disseminação, agressão e resistência às defesas do hospedeiro. Sua expressão pode ser específica de amostras, não só de espécies.
Muitas vezes, os fatores de virulência são expressos pela atividade do sistema de sinalização quórum-sensing. Esse sistema depende da densidade bacteriana para funcionar, após o reconhecimento de um sinal produzido pela própria bactéria, a população inteira realiza uma função em resposta ao estímulo. 
AULA 13 E 14: STREPTO E ENTEROCOCCUS (PDF)