BEATRIZ-RIPPER

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1 
 
Universidade Federal do Rio de Janeiro 
 
 
 
 
EFEITO DA TORREFAÇÃO SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS 
MELANOIDINAS DO CAFÉ POR CLAE-DAD-EM E RMN E SUA RELAÇÃO COM A 
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA BEBIDA 
 
 
 
 
 
 
 
Beatriz de Andrade Ripper 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2015 
 
 
 
 
2 
 
EFEITO DA TORREFAÇÃO SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS 
MELANOIDINAS DO CAFÉ POR CLAE-DAD-EM E RMN E SUA RELAÇÃO COM A 
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA BEBIDA 
 
 
 
 
 
 
 
Beatriz de Andrade Ripper 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de 
Pós-graduação em Ciência dos Alimentos (PPGCAL) 
do Instituto de Química da Universidade Federal do 
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à 
obtenção do título de Mestre em Ciências. 
 
Orientador: Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
Agosto de 2015 
 
 
3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ripper, Beatriz de Andrade 
 Efeito da torrefação sobre a composição química das 
melanoidinas do café por CLAE-DAD-EM e RMN e sua relação com a 
atividade antioxidante da bebida / Beatriz de Andrade Ripper – Rio de 
Janeiro: UFRJ / Instituto de Química, 2015. 
 xviii, 88f.: il. ; 31 cm. 
 Orientador: Daniel Perrone Moreira 
 Dissertação (mestrado) – UFRJ, Instituto de Química, Programa 
de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos, 2015. 
 Referências bibliográficas: f. 85 – 94 
1. Café. 2.Composição química e processamento. 3. Compostos 
Bioativos do café. 4. Melanoidinas. 5. Atividade Antioxidante. I. 
Moreira, Daniel Perrone. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 
Instituto de Química, Programa de Pós-graduação em Ciência dos 
Alimentos. II. Efeito da torrefação sobre a composição química das 
melanoidinas do café por CLAE-DAD-EM e RMN e sua relação com a 
atividade antioxidante da bebida. 
 
4 
 
EFEITO DA TORREFAÇÃO SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS 
MELANOIDINAS DO CAFÉ POR CLAE-DAD-EM E RMN E SUA RELAÇÃO COM A 
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA BEBIDA 
 
 
 
 
 
 
Beatriz de Andrade Ripper 
 
 
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DE PÓS-GRADUAÇÃO EM 
CIÊNCIA DOS ALIMENTOS DO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNIVERSIDADE 
FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS 
À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS. 
 
Examinada por: 
 
 ____________________________________________ 
 Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira, DSc 
 Instituto de Química 
 Universidade Federal do Rio de Janeiro 
 
 
____________________________________________ 
 Prof
a
. Dr
a
. Mariana Costa Monteiro, DSc 
 Instituto de Nutrição Josué de Castro 
 Universidade Federal do Rio de Janeiro 
 
 
____________________________________________ 
 Prof
a
. Dr
a
. Tatiana El-Bacha Porto, DSc 
 Instituto de Nutrição Josué de Castro 
 Universidade Federal do Rio de Janeiro 
5 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À minha família. 
6 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 Antes de tudo, gostaria de agradecer aos meus pais, tão amados, que sempre 
estiveram ao meu lado. Eles nunca mediram esforços para investir em mim. À minha mãe, 
Ana Claudia, que por ser professora de português, me ensinou a ler e a escrever. Sempre foi 
minha amiga, irmã, conselheira e parceira. Ela me chama de corajosa, mas eu gostaria de 
ter metade da sua coragem. Não me imagino sem os seus conselhos que sempre 
mantiveram os meus pés no chão. Ao meu pai, João Guilherme, que me ensinou a ter foco, 
disciplina, perseverança e a nunca desistir dos meus sonhos. Ele sempre foi um grande 
exemplo de profissional para mim. Cresci ouvindo ele dizer: “nós somos do tamanho dos 
nossos sonhos”. Isso significa muito na minha vida. 
 Ao meu irmão do meio, João Paulo, que sempre foi meu ombro amigo em todos os 
momentos. Meu parceiro de comida japonesa e Outback, muito obrigada por todo seu 
carinho. Ao meu irmão mais novo, Kauã, que nasceu me fazendo chorar de tanta emoção. 
Um pestinha que não me deixava estudar e que rabiscou todos os meus artigos científicos. 
Eu não imaginava aos 23 anos ganhar um “irmão-filho” e ter que enfrentar o desafio de ser 
o exemplo de irmã mais velha. Obrigada por todas as fofuras e alegrias que você trouxe 
para a minha vida. Tudo ficou bem mais colorido com a sua chegada. 
 À minha tia, Maria Sylvia, que nunca mediu esforços para me ajudar. Sempre viveu 
os meus sonhos, angústias e alegrias comigo. Sei que posso contar com você em todos os 
meus momentos. Muito obrigada por toda diferença na minha vida. Meu amor por você é 
eterno. Sem você eu não teria chegado até aqui! 
 À minha avó, Norma, minha “segunda-mãe”. Sempre cuidou muito bem de mim e 
me protegeu. Ela tem remédio para tudo, seja para uma dor de cabeça ou dor na alma. Ela 
triplica as minhas alegrias como ninguém. Sem ela nada teria sentido. Nem as dores e nem 
as alegrias. Nem as conquistas e nem os desafios. É um grande prazer tê-la na minha vida. 
Obrigada por tudo. 
 Ao meu avô, Paulo, que por ser Químico sempre me incentivou a seguir na área. 
“Você será a primeira mestre da família”, ele sempre me dizia. Sei que posso contar com 
você a qualquer hora. Nunca vou me esquecer das suas cervejinhas, queijinhos, suquinhos 
detox, caronas e ajudas com o meu carro. Você é o melhor avô do mundo. 
7 
 
 À minha avó, Maria Lúcia, que não está mais nesse mundo, mas sempre esteve viva 
dentro de mim. Eu sempre rezo para ela e sei que me ajuda de alguma forma. É dela que 
tiro forças para lutar e perseverar naquilo que eu quero. Eu sei que ela está sempre ao meu 
lado, pois a nossa ligação sempre foi muito forte. Aonde quer que você esteja, muito 
obrigada por tudo vó. 
 Ao meu padrasto muito amado, Cristiano, que desde o início me adotou como filha. 
Obrigada por sempre me ouvir, me aconselhar e me socorrer quando preciso. Meu carinho 
por você é imenso. 
À toda minha família, que sempre apostaram em mim e comemoraram cada 
conquista. Sempre foram a minha base, força e motivo de alegria. Sem vocês nada disso 
teria sentido. 
Ao meu orientador, Daniel Perrone que não me conhecia direito e me aceitou de 
braços abertos como sua aluna de iniciação científica e, posteriormente, de mestrado. Me 
sugeriu um projeto de tamanha responsabilidade. Então me vi de frente a um grande 
desafio, que superei graças à sua ajuda. Sempre muito atencioso e dedicado, nunca mediu 
esforços para me ajudar. É um orientador que qualquer um gostaria de ter. Vai para a 
bancada te ensinar e passa horas corrigindo cada ponto final do seu artigo. Muito mais que 
um orientador, sempre tive você como um amigo. Sempre me escutou e apoiou as minhas 
decisões. Muito compreensível comigo, sempre me colocou para cima. Aprendi muito com 
você, tanto profissionalmente quanto pessoalmente. Muito obrigada por tudo! Sem você eu 
jamais teria conseguido. 
Ao professor Carlos Kaiser, pela sua grande colaboração com o meu trabalho. Você 
me ajudou muito com a técnica de RMN. Me ensinou tanto a teoria quanto a prática. 
Obrigada por todas aquelelas horas que você passou me explicando como manipular o 
equipamento. Foi uma metodologia nova para mim e que graças à sua ajuda eu consegui 
aplicá-la no meu estudo. Muito obrigada também pelas excelentes aulas que assisti durante 
a sua disciplina. Aprendi muito com elas. 
À professora Sabrina Ferreira, que graças à sua disciplina eu consegui me 
aprofundar mais nas técnicas de massas, IV, UV e principalmenteem RMN que é o foco do 
meu estudo. 
8 
 
À professora Luciana Cardoso, sempre muito prestativa comigo durante o TCC e 
que me encaminhou para o mestrado. Ao professor Anderson Teodoro que me despertou a 
paixão pela química dos alimentos durante as suas excelentes aulas de bromatologia na 
graduação. 
Aos professores Alexandre, Nathalia, Juliana e Vanessa e aos alunos do LBNA, 
principalmente, Genilton, Kim, Luiza, Daniela, Thaísa, Nívea, Ellen, Emília e André, muito 
obrigada pela amizade e parceria durante todos esses anos. 
Às minhas grandes amigas, especiamente Gabrielle, Priscilla, Isabela, Paula, Bruna 
e Mabel que têm o poder de tornar a minha vida mais leve, com mais risadas e menos 
problemas. Amo muito vocês. 
Ao meu namorado Yuri, que sempre me apoiou em tudo, principalmente para que 
eu seguisse a vida acadêmica. Você é muito importante para mim! Obrigada por existir. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
RESUMO 
EFEITO DA TORREFAÇÃO SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS 
MELANOIDINAS DO CAFÉ POR CLAE-DAD-EM E RMN E SUA RELAÇÃO COM A 
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA BEBIDA 
Beatriz de Andrade Ripper 
Orientador: Daniel Perrone 
 
O café é uma das bebidas mais populares no mundo. As melanoidinas do café são os 
compostos responsáveis pela cor e por parte do aroma característicos do produto. Além 
disso, são compostos nitrogenados e de alto peso molecular formados durante Reação de 
Maillard. O objetivo do presente estudo foi foi investigar o efeito da torrefação sobre a 
composição química das melanoidinas do café por CLAE-DAD-EM e RMN e sua relação 
com a atividade antioxidante da bebida. As bebidas de café apresentaram 19,5 mg/mL de 
sólidos solúveis, onde 32,2% correspondiam às melanoidinas. Todas as amostras 
apresentaram maiores teores de FPME (fração de peso molecular elevado) em relação à 
FPMI (fração de peso molecular intermediário). As amostras de café arábica apresentaram, 
em média, 67,5% de FPME e 32,5% de FPMI, enquanto a amostra de café conillon 
apresentou 80% de FPME e 20% de FPMI. Observou-se, em média, um decréscimo de 31,5 
a 13,7 mmols Fe
2+
/100g e de 47,3 a 17,6 µmols Trolox/L para a atividade antioxidante 
bebidas de café arábica, pelos ensaios de FRAP e TEAC, respectivamente. Para a amostra 
de café conillon observou-se um decréscimo de 46,6 a 14,6 mmols Fe
2+
/100g e de 47,6 a 
12,5 µmols Trolox/L, respectivamente. As FPME e FPMI apresentaram variações da AA 
(atividade antioxidante) ao decorrer da torrefação, atingindo a 332,5 mmols Fe
2+
/100g e 
211,6 µmols Trolox/L para FPMI e 183,8 mmols Fe
2+
/100g e 211,4 µmols Trolox/L para 
FPME. Em todas as amostras, os teores de compostos fenólicos ligados covalentemente 
às melanoidinas foi maior do que aqueles ligados ionicamente. O ácido caféico foi o 
composto fenólico incorporado mais abundante, em média 69% do teor total, seguido pelo 
ácido ferúlico (22%) e ácido p-cumárico (9%). Em geral, os teores relativos de 
ácido caféico incorporado às melanoidinas diminuíram entre 28% e 98% ao longo do 
processo de torra, enquanto que os teores relativos dos ácido ferúlico e p-
cumárico aumentaram. Observou-se correlação entre os teores de compostos fenólicos 
ligados covalentemente e a atividade antioxidante medida por FRAP (r > 0,80, p < 0,001, 
n=19) e TEAC (r > 0,88, p < 0,001, n=19). Esses resultados demonstram que a atividade 
antioxidante de melanoidinas deve-se aos compostos fenólicos incorporados em sua 
estrutura. Nos espectros de RMN de 
1
H foram observados dois grupos de dubletos com 
uma constante de acoplamento elevada (J=16,4 Hz) em 6,5 e 7,7 ppm. Esses grupos de 
sinais correspondem aos prótons olefínicos em configuração trans da porção cinâmica dos 
ácidos clorogênicos. No entando, a região espectral entre 5,0 ppm e 7,9 ppm mudou 
dramaticamente durante o processo de torra. As FPME de torras escuras e muito escuras 
apresentaram sinais fracos correspondentes ao anomérico, olefínicos e prótons aromáticos. 
Observou-se correlação intensa entre a área dos sinais relativos aos ácidos clorogênicos no 
espectro de RMN de 
1
H e o teor de compostos fenólicos incorporados às melanoidinas (r > 
0,87, p < 0,0001, n = 19). 
Palavras-chave: melanoidinas, café, Reação de Maillard, atividade antioxidante. 
10 
 
ABSTRACT 
 
THE EFFECT OF ROASTING ON THE CHEMICAL COMPOSITION OF COFFEE 
MELANOIDINS BY CLAE-DAD-MS AND NMR AND THEIR RELATIONSHIP WITH 
THE BREW’S ANTIOXIDANT ACTIVITY 
Beatriz de Andrade Ripper 
Advisor: Daniel Perrone 
 
Coffee is one of the most popular beverage in the world. Coffee melanoidins are 
compounds responsible for the color and characteristic of the aroma of the product. 
Moreover, they are nitrogenous compounds and high molecular weight formed during the 
Maillard reaction. The aim of this study was to investigate the effect of roasting on the 
chemical composition of coffee melanoidins by clae-dad-ms and nmr and their relationship 
with the brew’s antioxidant activity. The coffee beverages showed 19.5 mg/mL of soluble 
solids, which corresponded to 32.2% of melanoidins. All samples showed higher HMWF 
(high molecular weigh fraction) levels in relation to IMWF (intermediate molecular weigh 
fraction). Arabica coffee samples showed 67.5% and 32.5% of HMWF and IMWF while 
Conillon coffee sample showed 80% of HMWF and 20% of IMWF. There was, on average, 
a decrease from 31.5 to 13.7 mmol Fe 
2+
/ 100g and from 47.3 to 17.6 μmols Trolox /L 
for Arabica coffee beverage antioxidant activity by the FRAP and TEAC assays, 
respectively. For Conillon coffee there was a decrease from 46.6 to 14.6 mmol Fe
2+
/ 100g 
and from 47.6 to 12.5 μmols Trolox/L, respectively. The HMWF and IMWF presented 
variations of AA (antioxidant activity) during the roasting, reaching 332.5 mmol Fe
2+
/100g 
and 211.6 μmols Trolox / L for IMWF and 183.8 mmol Fe 
2+
/ 100g and 211.4 μmols 
Trolox /L for HMWF . In all samples, the levels of phenolic compounds covalently linked 
to melanoidins was higher than those connected ionically. The caffeic acid was the most 
abundant phenolic compound incorporated, on average, 69% of the total content, followed 
by ferulic acid (22%) and p-coumaric acid (9%). In general, the relative levels of caffeic 
acid incorporated into melanoidins decreased from 28% to 98% during the roasting process, 
while the relative contents of ferulic acid and p-coumaric increased. A positive correlation 
was observed between the content of phenolics covalently linked and antioxidant activity 
measured by FRAP (r> 0.80, p <0.001, n = 19) and TEAC (r> 0.88, p <0.001, n = 19 ). 
These results demonstrate that the antioxidant activity of melanoidins is due phenolic acids 
incorporated into the structure. In the 
1
H NMR spectra were observed two groups of 
doublets with a high coupling constant (J = 16.4 Hz) at 6.5 and 7.7 ppm. These signal 
groups correspond to olefinic protons in trans configuration of chlorogenic acids. 
However, the spectral region between 5.0 ppm and 7.9 ppm changed dramatically during 
the roasting process. The HMWF dark and very dark roasts showed weak signals 
corresponding to the anomeric, olefin and aromatic protons. There was strong correlation 
between the area of the signals relating to chlorogenic acids in the
 1
H NMR spectrum and 
the content of phenolic compounds incorporated into the melanoidins (r> 0.87, p <0.0001, n 
= 19). 
Keywords: melanoidins, coffee, Maillard Reaction, antioxidant activity. 
 
11 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Capítulo 1 
Figura 1. A lenda de Kaldi, descrita no século III, d. C…………………………………..18 
Figura 2. A chegada das mudas de café no Brasil, em 1727………………………………19 
Figura 3. Implantação da ferrovia em Ribeirão Preto, SP………………………………...20 
Figura 4. Queima de um cafezal em 1929 por ordem do governo de Getúlio Vargas…….21 
Figura 5. Ilustração da árvore do café……………………………………………………..22Figura 6. Grãos verdes de café arábica (lado esquerdo) e de conillon (lado direito)….......23 
Figura 7. Fluxograma simplificado das etapas de processamento do café………………..26 
Figura 8. Ácidos clorogênicos e compostos relacionados……………………………….28 
Figura 9. Mecanismo de formação das lactonas………………………………………….29 
 
 
 
Capítulo 2 
Figura 1. Contents (mg/ml) of HMWF and IMWF in coffee Arabica and Conillon 
samples…………………………………………………………………………………..45 
Figura 2. Average relative content (%) of covalently and ionically bound phenolic acids in 
the HMWF and IMWF of 10% coffee brews…………………………………………..48 
Figura 3. Total contents (mmol/100 g) of phenolic compounds covalently and ionically 
linked to coffee brew melanoidins (sum of all phenolic compounds contents). Covalently 
bound contents were calculated from the alkaline hydrolysis procedure and subtracting the 
residual and ionically bound phenolic compounds. Ionically bound contents were calculated 
after such high ionic strength treatment and subtracting the residual phenolic 
compounds……………………………………………………………………………....49 
Figura 4. Total contents (mmol/100 g) of phenolic compounds covalently linked to coffee 
brew melanoidins (sum of HMWF and IMWF contents). Covalently bound contents were 
calculated from the alkaline hydrolysis procedure and subtracting the residual and ionically 
bound phenolic compounds…………………………………………………………….50 
12 
 
Figura 5. Relative contents of covalently bound CA, FA, and CoA in HMWF of Arabica 1, 
Arabica 2, and Conillon samples………………………………………………………….51 
Figura 6. Relative contents of covalently bound CA, FA, and CoA in IMWF of Arabica 1, 
Arabica 2, and Conillon samples………………………………………………………….52 
Figura 7. Typical 
1
H NMR spectrum of HMWF melanoidins (Arabica 1 green coffee)..56 
Figura 8. Typical 
1
H NMR spectrum of IMWF melanoidins (Conillon green coffee)…57 
Figura 9. 
13
C NMR spectrum of HMWF (dark roast of Arabica 1)………………………58 
Figura 10. 
1
H–
13
C HSQC spectrum of HMWF (dark roast of Arabica 1)…………….59 
Figura 11. 
1
H spectra of HMWF melanoidins of Arabica 1 coffee brews of increasing 
roasting degrees…………………………………………………………………………..61 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Capítulo 1 
Tabela 1. Composição química do café verde em g/100g em base seca…………………..24 
Tabela 2. Características agronômicas das plantas de café arábica e café robusta……24 
Tabela 3. Composição química do café torrado em g/100g em base seca………………..27 
 
Capítulo 2 
Tabela 1. Weigh loss (%), color, soluble solids (mg/mL) and relative contents (mg/mL) of 
IMWF and HMWF of coffee samples……………………………………………………44 
Tabela 2. Chlorogenic acids (CGA) and lactones (CGL) contents (mg/L) in coffee brews. 
Tabela 3. AA of whole and clarified coffee brews measured by FRAP (mmols Fe
2+
/L) and 
TEAC (mmols Trolox/L) assays…………………………………………………………...46 
Tabela 4. AA of IMWF and HMWF of coffee brews measured by FRAP (mmols 
Fe
2+
/100g) and TEAC (mmols Trolox/100g) assays………………………………………54 
 
Capítulo 3 
Tabela 4. Gradiente de eluição do sistema CLAE-DAD-EM……………………………..67 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 
 
%PM Perda de massa percentual 
AA Atividade Antioxidante 
ABIC Associação Brasileira da Indústria de Café 
ABTS 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt 
CGA Ácido clorogênico 
CGL 1,5-γ-lactonas dos ácidos clorogênicos 
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
CLAE-DAD-EM Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de 
Massas com Arranjo de diodos 
p-CoA Ácido p-cumárico 
CQA Ácido cafeoilquínico 
CQL Lactona do ácido cafeoilquínico 
CV Coeficiente de Variação 
diCQA Ácido dicafeoilquínico 
diCQL Lactona dos ácido dicafeoilquínico 
diFQA Ácido diferuloilquínico 
di-p-CoQA Ácido di-p-cumaroilquínico 
DP Desvio-padrão 
FA Ácido ferúlico 
FQA Ácido feruloilquínico 
FQL Lactona dos ácido feruloilquínico 
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power 
HSQC Heteronuclear single-quantum correlation 
ND Não detectado 
QA Ácido quínico 
RMN Espectroscopia de ressonância magnética 
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity 
TPTZ 2,4,6-tripyridyl-S-triazine 
Trolox® 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid 
15 
 
 
SUMÁRIO 
 
Capítulo 1…………………………………………………………………….17 
1. O café no Brasil e no mundo……………………………………………………….18 
2. Café verde: a planta, composição química geral e o processamento……………....21 
3. Compostos bioativos do café……………………………………………………….28 
3.1 Ácidos clorogênicos e lactonas…………………………………………..…………..28 
3.2 Melanoidinas…………………………………………………………………………...30 
3.3 Utilização de técnicas de RMN para análises em alimentos…………….........33 
 
Objetivo geral…………………………………………………………….…..35 
Capítulo 2…………………………………………………………………….37 
1. Introduction……………………………………………………………………………39 
2. Materials and Methods……………………………………………………………….40 
2.1. Coffee Samples……………………………………………………………………40 
2.2. Coffee Brew Preparation……………………………………………………………41 
2.3. Extraction and quantification of free chlorogenic acids and lactones………41 
2.4. Isolation of coffee melanoidins………………………………………………41 
2.5. Antioxidant activity…………………………………………………………….42 
2.6. Determination of unbound, ionically bound, and covalently bound phenolic 
compounds in HMWF and IMWF………………………………………………….43 
2.7. Spectroscopic characterization of melanoidins by NMR……………………43 
3. Results and Discussion………………………………………………………………………………………………43 
 3.1. Roasted coffee samples classification………………………………………46 
3.2. Chemical characterization of coffee brews…………………………………53 
3.3. Phenolic characterization of HMWF and IMWF………………………………46 
3.4. Antioxidant activity of coffee brews, clarified coffee brews, and HMWF and 
IMWF melanoidins…………………………………………………………………53 
3.5. Spectroscopic characterization of melanoidins by NMR……………………56 
16 
 
 
Capítulo 3…………………………………………………………..63 
1. Introdução…………………………………………………………………......64 
2. Objetivos Específicos………………………………………………………….65 
3. Materiais e métodos………………………………………………………......65 
3.1 Amostras de café……………………………………………………………...65 
3.2 Bebidas de café 10%......................................................................................66 
3.3 Extração e quantificação de CGA e CGL livres………………………......66 
3.4 Isolamento das melanoidinas do café……………………………………...67 
3.5 Atividade antioxidante (AA)…………………………………………………68 
3.6 Determinação dos compostos fenólicos residuais, ligados ionicamente e 
covalentemente às melanoidinas do café…………………………………..69 
3.7 Caracterização espectroscópica das melanoidinas do café por RMN……..70 
4. Conclusão…………………………………………………………………….…71 
 
Referências…………………………………………………………….72 
Anexo………………………………………………………………….78 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 1 
Revisão Bibliográfica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
1. O café no Brasil e no mundo 
O café teve origem na Etiópia, no século IX, prevaleceu no Egito e na Europa e 
depois difundiu-se para o mundo (Wikipedia, 2015). Algumas lendas relatam a sua origem. 
A mais popular é sobre o pastor de cabras Kaldi, que viveu na Absínia, hoje Etiópia, há 
cerca de mil anos. Kaldi observou que suas cabras demonstravam uma maior vitalidade 
após mastigarem as frutas amarelo-avermelhadas dos arbustos que lá cresciam. Observando 
tal comportamento, um monge apanhou um pouco das frutas e levou consigo. No 
monastério ele provou os frutos na forma de infusão e percebeu que a bebida o ajudava a 
ser manter alerta em suas orações noturnas. Como resultado, a bebida se difundiu 
rapidamente para outros monastérios aumentando a sua demanda (Wikipedia, 2015). Outra 
lenda é aquela das tribos africanas, que preparavam os grãos de café em forma de pasta e a 
utilizavam para alimentar os animais e dar maior vitalidade aos guerreiros (Wikipedia, 
2015; ABIC,2015; ICO, 2015). 
 
Figura 1. A lenda de Kaldi, descrita no século III, d. C. 
 
O cultivo do café foi introduzido na Arábia por prisioneiros de guerra. O Iêmen foi 
um centro de cultivo importante, de onde se propagou pelo resto do mundo árabe. O 
conhecimento dos efeitos da bebida disseminou-se pelo oriente no século XVI, sendo 
torrado pela primeira vez na Pérsia. O café gerou conflitos entre os árabes, que 
consideravam suas propriedades contrárias às leis do profeta Maomé. No entanto, a 
resistência ao seu consumo não durou muito tempo. Médicos muçulmanos aderiram à 
bebida para favorecer a digestão e afastar o sono (Wikipedia, 2015; ICO, 2015). 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Egito
http://pt.wikipedia.org/wiki/Europa
http://pt.wikipedia.org/wiki/Cereal
http://pt.wikipedia.org/wiki/Cultivo
http://pt.wikipedia.org/wiki/I%C3%AAmen
http://pt.wikipedia.org/wiki/Agricultura
http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81rabes
http://pt.wikipedia.org/wiki/Bebida
http://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%A9rsia
19 
 
Em 1615, os europeus começaram a provar o café na forma de infusão. No século 
XVII, os holandeses cultivaram suas primeiras mudas no jardim botânico de Amsterdã, o 
que tornou a bebida de café parte dos hábitos dos europeus. Além disso, os europeus 
utilizavam o cafeeiro como planta decorativa. Os holandeses ampliaram o cultivo para 
Sumatra e os franceses começaram o cultivo nas ilhas de Sandwich e Bourbon. O crescente 
mercado consumidor europeu de café difundiu o plantio no Suriname, São Domingo, Cuba, 
Porto Rico, Guianas e no Brasil. Com isso, o café adiquiriu um grande valor comercial e o 
Haiti se tornou o maior exportador mundial do produto (ABIC, 2015). 
Em 1727, o café chegou em Belém do Pará (Figura 2). As mudas foram trazidas da 
Guiana Francesa pelo sargento Francisco de Mello Palheta. Devido às condições climáticas 
favoráveis, o cultivo do café difundiu-se rapidamente pelo Brasil com a produção voltada 
para o mercado interno. Os estados do Maranhão, Bahia, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná 
e Minas Gerais iniciaram seus plantios. Em pouco tempo, o café passou a ser de suma 
importância para a economia brasileira (Wikipedia, 2015; ICO, 2015). 
 
Figura 2. A chegada das mudas de café no Brasil, em 1727. 
 
No final do século XVIII, ocorreu a guerra de independência do Haiti contra a 
França. Com isso, a exportação de café daquele país declinou e o Brasil aumentou 
significativamente a sua produção, exportando o produto com maior regularidade. Os 
embarques foram realizados pela primeira vez em 1779, com a insignificante quantia de 79 
arrobas. Somente em 1806, as exportações atingiram um volume mais significativo, de 80 
mil arrobas (Wikipedia, 2015; ABIC, 2015; ICO, 2015) . 
20 
 
No Rio de Janeiro, as matas da Floresta da Tijuca tornaram-se grandes cafezais. O 
plantio estendeu-se para Angra dos Reis, Parati, São Paulo e Minas Gerais. Neste contexto, 
as fazendas de café contaram com a mão-de-obra europeia de imigrantes italianos, 
portugueses, espanhóis, alemães, suíços e eslavos. Em pouco tempo, o vale do rio Paraíba 
tornou-se a maior região produtora de café no Brasil. Com isso, ocorreu um grande 
crescimento econômico da região e um sistema complexo de estradas férreas foi 
estabelecido. Entretanto, a grande erosão do solo fizeram com que as terras para plantio se 
esgotassem rapidamente. Sendo assim, a cultura cafeeira migrou para o oeste da província 
de São Paulo, centralizando-se em Campinas e estendendo-se até Ribeirão Preto 
(Wikipedia, 2015; ABIC, 2015). 
Campinas passou a ser então o grande pólo produtor do país. Na região, os cafezais 
sofriam menos com esgotamento dos solos pela superfície plana da região. Foi implantada 
uma grande rede de estradas rodoviárias e ferroviárias na região (Figura 3). Com este novo 
pólo produtor, o café mudou seu centro de escoamento: toda a produção do oeste paulista 
era enviada para São Paulo e exportada no porto de Santos. Em 1920, a valorização do café 
tornou-se crescente, o que elevou os preços e aumentou a concorrência entre o Brasil e 
outros países (Wikipedia, 2015; ABIC, 2015). 
 
Figura 3. Implantação da ferrovia em Ribeirão Preto, SP, em 1883. 
 
Com a crise de 1929, Getúlio Vargas ordenou que todos os estoques fossem 
queimados e os preços reduzissem, tornando o café acessível à qualquer cidadão (Figura 
4). Foram queimadas 72 milhões de sacas. A partir de 1944, a oferta de café passou a ser 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Get%C3%BAlio_Vargas
21 
 
regulada por convênios entre países produtores. Em 18 de julho de 1975, ocorreu uma 
geada em São Paulo dizimando todos os cafezais (Wikipedia, 2015; ABIC, 2015). 
 
 
Figura 4. Queima de um cafezal em 1929 por ordem do governo de Getúlio Vargas. 
Neste contexto, o maior pólo produtor de café foi transferido para Minas Gerais, 
com produção de 26,6 milhões de sacas, o que corresponde a mais de 50% da produção 
nacional do produto e 17% da produção mundial. Na segunda metade do século XX, o café 
perdeu importância na economia brasileira, dando lugar ao setor industrial. Entretanto, o 
Brasil permanece como maior produtor mundial de café até os dias de hoje (Wikipedia, 
2015; ABIC, 2015). 
 
2. Café verde: a planta, composição química geral e o processamento 
 
O café pertence à família Rubiaceae. O seu gênero correspondente é o Coffea. As 
duas espécies mais importantes esconomicamente são arabica e canephora. C. 
arabica ocupa 74% da produção de café do Brasil, enquanto que C. canephora 26%
. 
Duas 
outras espécies que são cultivadas em uma escala muito menor são Coffea liberica e Coffea 
dewevrei (ICO, 2015). 
A planta do café (Figura 5) é uma pequena árvore de até 5 m de altura e 7 cm de 
diâmetro. O tronco é cinza claro e fino. O arbusto apresenta folhas opostas e elípticas. Suas 
flores são brancas, pequenas, perfumadas e produzidas quando a planta tem entre três a 
quatro anos. Os frutos ovais apresentam até 18 mm de comprimento e de 10 a 15 mm de 
diâmetro. Além disso, são verdes e quando maduros, se tornam vermelho-brilhantes 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Minas_Gerais
22 
 
(“cereja”) ou amarelos, dependendo da variedade. Cada fruto apresenta duas sementes. Os 
grãos de café são as sementes, que apresentam de 8 a 12 mm de comprimento e são 
arrendondadas. Cada grão é coberto por uma fina película. Em torno desta, uma película 
amarela (“pergaminho”) é encontrada. Todo conteúdo do fruto está contido em uma polpa 
mucilaginosa, que forma a “carne” do fruto (John et al., 2015; Perrone, 2008). 
 
Figura 5. Ilustração da árvore do café. Silva, 2012. 
 
A espécie C. arabica (Figura 6) foi primeiramente descrita por Linnaeus em 1753. 
As variedades mais conhecidas são “Typica” e “Bourbon”, mas também existem outras, tais 
como Caturra, Mundo Novo, Tico, San Ramon e Blue Mountain. O café arábica é cultivado 
na América Latina, África Oriental e Central, Índia e na Indonésia. A espécie C. canephora 
(Figura 6), também chamado de “Robusta” é uma variedade de grande dimensão desta 
espécie. O café Robusta é cultivado na África Central, na Ásia Ocidental e no Brasil, sendo 
a variedade Conillon a mais plantada no nosso país (ICO, 2015). 
 
 
23 
 
Figura 6. Grãos verdes de café arábica (lado esquerdo) e de conillon (lado direito). 
 
Neste contexto, existem diferenças importantes entre ambas as espécies. O café 
robusta desenvolve-se em altitudes mais baixas, é mais resistente às variações climáticas, é 
mais resistente a doenças e demanda um maior conteúdo orgânico do que o café arábica. O 
grão arábica é esverdeado e oval, ao contrário do grão robusta, que é redondo e 
amarronzado. Além disso, as espécies descritas diferem-se em relação à composição 
química (Tabela 1). 
 O teor de cafeína e carboidratos, por exemplo, está presente em maior quantidade 
no café Conillon (Perrone, 2008). O mesmo perfil é observado para os ácidos clorogênicos, 
que contribuempara o amargor da bebida de café (Clarke, 2003b). 
Por outro lado, a trigonelina está presente em maiores quantidades no café Arábica. 
Este apresenta aproximadamente 60% mais lipídios que o café Conillon. Os teores de 
cinzas, proteínas e aminoácidos livres são semelhantes para ambas as espécies (Clarke, 
2003b). 
Durante o cultivo, as condições climáticas devem ser favoráveis (Tabela 2) para 
promover uma boa floração e o desenvolvimento dos frutos. 
O planta do café Arábica atinge 2,5 a 4,5 metros de altura, crescem a uma 
temperatura entre 19 °e 22ºC e em altitudes de 600 a 2200 metros. A planta de café 
Conillon é ligeiramente mais alta (4,5 a 6,5 metros), requer temperaturas mais quentes (22° 
a 26ºC) para o seu desenvolvimento e crescem em altitudes mais baixas (800 metros) 
quando comparadas ao arbusto de café Arábica. Grãos de café Arábica são ligeiramente 
ovalados e menores quando comparados aos grãos de café Conillon, que apresentam forma 
mais redonda e são maiores. Por fim, o café Arábica apresenta o dobro do número de 
cromossomos do que café Conillon (Silva, 2012). 
Tabela 1. Composição química típica do café verde em g/100g em base seca. Adaptado de 
Clarke, 2003b e Perrone, 2008. 
 Compostos Café Arábica Café Robusta 
24 
 
 Cafeína 1,2 2,2 
 Trigonelina 1,0 0,7 
 Cinzas 4,2 4,4 
 Ácidos 
 Clorogênico total 6,5 10,0 
 Alpifáticos 1,0 1,0 
 Quínico 0,4 0,4 
 Carboidratos 
 Sacarose 0,8 
 Redutores 0,1 
 Polissacarídeos 44,0 
 4,0 
 0,4 
 48,0 
 
 3,0 
 2,0 
 11,0 
 0,8 
 10,0 
 Lignina 3,0 
 Pectinas 2,0 
 Proteínas 11,0 
 Aminoácidos livres 0,5 
 Lipídeos 16,0 
 
 
 
 
Tabela 2. Características agronômicas das plantas de café arábica e café robusta. Adaptado 
de Silva, 2012. 
 Parâmetros Café Arábica Café Robusta 
Cromossomos 
Tamanho do arbusto (m) 
Folhas 
Flores 
Formato da semente 
Tamanho da semente (mm) 
Maturação (meses) 
Clima ideal 
Altitude (m) 
 44 22 
 2,5-4,5 4,5-6,5 
 Pequenas e ovais Grandes e mais claras 
 Pequenas Grandes 
 Ovalada Arredondada 
 5-13 4-8 
 7-9 9-11 
 Temperado (19-22ºC) Equatorial (22-26ºC) 
 600-2200 0-800 
 
O processamento do café (Figura 7) se inicia na colheita, que ocorre de sete a oito 
meses após floração. Ao final desse período, espera-se que 90% dos frutos estejam maduros 
e com teor de água entre 45 e 65%. Este processo é conduzido de forma manual ou 
mecanizada. Os frutos colhidos passam por lavadores, onde são removidas as impurezas e 
são separados entre frutos maduros e secos (ABIC, 2015; Silva, 2012). 
A etapa seguinte é a secagem. Esta pode ocorrer por via úmida ou seca. O primeiro 
processo requer a secagem dos grãos de café inteiros ao sol até que a umidade atinja menos 
25 
 
de 13%. Já o segundo processamento requer a secagem dos grãos descascados. O 
descascamento ocorre por descascadores mecânicos, nos quais o epicarpo (casca) e o 
mesocarpo (polpa) do fruto são removidos. O café descascado é então degomado, por meio 
da fermentação ou de forma mecânica (ABIC, 2015; Silva, 2012). O primeiro processo 
pode ocorrer por agentes biológicos naturalmente presentes, cepas de microrganismos 
selecionados ou enzimas industriais que degradam a mucilagem. Dependendo do método 
empregado, este processo pode durar de 7 a 20 horas. Na degomagem mecânica é 
empregado o equipamento denominado desmucilador (ABIC, 2015; Silva, 2012). 
A secagem de café pela via seca ocorre em duas etapas. Na primeira, o café é seco 
em terreiros, estufas ou secadores de leito fixo e a sua umidade original de 45 a 65% é 
reduzida para 30%. A segunda etapa ocorre em secadores de fluxos cruzados, concorrentes, 
contracorrentes e mistos, nos quais a umidade do é reduzida para aproximadamente 12% 
(ABIC, 2015; Silva, 2012). 
Depois de seco, o produto é armazendado. A armazenagem do café ocorre em silos 
ou tulhas, por no mínimo 10 dias. Durante este período é importante que a umidade relativa 
no ar no espaço intergranular esteja próxima de 60%, para inviabilizar a infestação de 
fungos e o reumedecimento do produto. Após este período, o café é beneficiado. O objetivo 
deste processo é remover o pergaminho do café descascado para ser obtido o grão de café 
verde. Em seguida, os grãos são limpos e classificados pelo seu tamanho. Durante a 
limpeza, materiais extrínsecos (gravetos, torrões, pedras e metais) e grãos defeituosos são 
retirados. A classificação ocorre de acordo com a cor e a densidade do grão. A 
armazenagem do café beneficiado ocorre a granel ou em sacarias. Nessa fase, são formados 
lotes de produtos homogêneos e que atendem os padrões de peneira e qualidade da bebida, 
de modo a atender as demandas de exportação e das indústrias (ABIC, 2015; Silva, 2012). 
 
26 
 
Colheita
Preparo
Secagem
Armazenagem
Beneficiamento
Armazenagem do café beneficiado
Torrefação e moagem
Mercado interno Exportação
 
Figura 7. Fluxograma simplificado das etapas de processamento do café. Adaptado de 
Silva, 2012. 
 
A torrefação é um processo dependente do tempo e da temperatuta. Neste, 
modificações químicas e físicas ocorrem no interior dos grãos, assim como o processo de 
pirólise e a perda de massa (Bonnländer et al., 2005; Vitorino et al., 2001). Na indústria, 
este processo ocorre através de torradores com troca de calor por condução e por 
convecção. No primeiro caso, a troca de calor ocorre por meio da superfície metálica 
aquecida de uma cuba esférica, cônica ou cilíndrica. No segundo caso, uma mistura de 
gases aquecidos a 450 ºC é utilizada. No terceiro caso, os grãos de café são resfriados 
(Silva, 2012). 
O processo de torrefação pode ser dividido em três estágios; secagem, torrefação e 
resfriamento. No primeiro, ocorre a liberação de água e compostos voláteis dos grãos e a 
coloração do grão muda de verde para amarelo. No segundo, ocorrem reações químicas 
27 
 
exotérmicas de pirólise com liberação de gás carbônico,a cor dos grãos varia de marrom 
claro a escuro devido à caramelização dos açúcares e à Reação de Maillard. No terceiro, 
ocorre a condensação de substâncias aromáticas no interior dos grãos de café (Bekedam et 
al., 2008). 
Durante a torrefação, compostos fenólicos sofrem elevada degradação (Tabela 3), 
dando origem a pigmentos e compostos voláteis responsáveis pelo aroma do produto 
torrado (Perrone et al., 2008). Entretanto, os teores de lipídeos, polissacarídeos, proteínas e 
de cafeína permanecem relativamente inalterados. Além disso, são formadas as 
melanoidinas, um grupo de compostos nitrogenados responsáveis por aproximadamente 
25% do peso seco do café torrado (Clarke, 2003a). 
 
Tabela 3. Composição química do café torrado em g/100g em base seca. Adaptado de 
Clarke, 2003a e Perrone, 2008. 
 Compostos Café Arábica Café Robusta 
 Cafeína 1,3 2,4 
 Trigonelina 1,0 0,7 
 Cinzas 4,5 4,7 
 Ácidos 
 Clorogênico total 2,5 3,8 
 Alpifáticos 1,6 1,6 
 Quínico 0,8 1,0 
 Carboidratos 
 Sacarose 0,0 
 Redutores 0,3 
 Polissacarídeos 33,0 
 0,0 
 0,3 
 37,0 
 
 3,0 
 2,0 
 7,5 
 0,0 
 11,0 
 25,0 
 Lignina 3,0 
 Pectinas 2,0 
 Proteínas 7,5 
 Aminoácidos livres 0,0 
 Lipídeos 17,0 
 Melanoidinas e outros 25,5 
 produtos da caramelização 
 
 
 
 
28 
 
3. Compostos bioativos do café 
3.1 Ácidos clorogênicos e lactonas 
 
Os ácidos clorogênicos (CGA) (Figura 8) são os compostos fenólicos majoritários 
no café. São ésteres formados entre o ácido quínico (QA) com uma a quatro moléculas de 
derivados de ácidos trans-cinâmicos, principalmente os ácidos caféico (CA), ferúlico (FA) 
e p-coumárico (p-CoA). Os ésteres podem ser formados na posição 1, 3, 4 ou 5 do QA. 
Dessa forma, podem ser fornados os ácidos cafeoilquínicos (CQA), dicafeoilquínicos 
(diCQA), feruloilquínicos (FQA) e p-coumaroilquínicos (p-CoQA), com pelo menos três 
isômeros de posição em cada classe, e os ácidos cafeoilferuloilquínicos (CFQA), com pelo 
menos seis isômeros de posição (Perrone, 2008; Farah et al., 2006; Trugo e Marae, 1984). 
 
Figura 8. Ácidos clorogênicos e compostos relacionados. Farah & Donangelo, 
2006. 
29 
 
 
No grão verde, os teores de CGA variam de 7 a 10% em C. canephora e de 5 a 
7,5% em C. arabica (Clifford, 1999; Clifford, 2000). Os CGA são precursores na formação 
de lignina e protegem a planta contra microrganismos agressores. O 5-CQA é o mais 
prevalente dentre os CGA, representando até 62% do total (Bekedam et al., 2008). Seguido 
deste, os outros oito isômeros mais prevalentes são, em geral: 4-CQA, 3-CQA, 3,5-diCQA, 
4,5-diCQA, 3,4-diCQA, 5-FQA, 4-FQA e 3-FQA. Os isômeros 3-CQA e 4-CQA 
representam até 10% do teor total de CGA, e as classes diCQA e FQA representam de 15 a 
20% e de 5 a 13% respectivamente (Perrone, 2008; Farah et al., 2006; Trugo e Macrae, 
1984). A relação CQA/diCQA aumenta de acordo com a maturação do fruto, devido à 
hidrólise dos diCQAs em mono-ésteres (Montavon et al., 2003). 
Durante a torrefação os CGA são convertidos em lactonas (CGL) através da perda 
de uma molécula de água do ácido quínico e formação da ligação éster intramolecular 
(Figura 9) (Moreira et al., 2012; Perrone, 2008). Além disso, estudos mostram que ocorre a 
condensação desses compostos a produtos de grande complexidade estrutural e de alto peso 
molecular, denominados melanoidinas (Moreira et al., 2012; Nunes e Coimbra, 2010; 
Bekedam et al.,2008). Os teores de CGA nas bebidas de café dependem do blend de 
espécies/cultivares usado, do grau de torrefação, da granulometria do café e do modo de 
preparo da bebida (Clifford, 2000). O modo de preparo doméstico por percolação extrai de 
80 a 100% dos CGA e CGL presentes nos grãos torrados (Farah et al., 2006). 
 
 Figura 9. Mecanismo de formação das lactonas. Farah et al., 2006. 
 
Estudos a partir de sistemas-modelo mostram que durante a torrefação ocorre a 
descarboxilação do 5-CQA gerando uma gama de fenóis simples. Com isso, compostos 
amargos presentes na bebida de café parecem ser gerados pela oligomerização de um único 
fenol (4-vinilcatecol) a partir de porções de ácido caféico liberados mediante torrefação 
(Moreira et al., 2012). Além disso, esses compostos participam da formação de pigmentos, 
aroma e sabor do café torrado (Perrone, 2008; Farah et al., 2006). 
30 
 
Muitas propriedades farmacológicas do café têm sido atribuídas à esses compostos 
em estudos in vitro, com modelos animais e seres humanos. A maior parte está associada à 
sua atividade antioxidante, visto que esses compostos são capazes de quelar metais de 
transição e de sequestrar radicais livres, interrompendo reações em cadeia entre eles. A 
prevenção da oxidação de lipoproteínas e do DNA é um exemplo de atividade antioxidante 
destes compostos (Laranjinha et al., 1994). 
Além disso, o consumo moderado do café tem sido atribuído ao menor risco relativo 
de hipertensão, doenças coronarianas, diabetes tipo II, mal de Alzheimer, câncer de cólon, 
cirrose hepática, câncer de fígado, alcoolismo, depressão e suicídios (Perrone, 2008; 
Moreira et al., 2005; Pereira et al., 2003; Trute et al., 1997; Basnet et al., 1996). As CGL 
também têm sido estudadas, devido ao seu potencial efeito hipoglicemiante e sobre a 
função cerebral, como por exemplo, a sua atuação sobre os receptores de adenosina (Farah 
et al., 2006). 
 
3.2 Melanoidinas 
 
As melanoidinas são um conjunto de moléculas com peso molecular intermediário a 
elevado, nitrogenadas e de coloração marrom (Coelho et al., 2014; Moreira et al., 2012; 
Forgliano et al., 2011;; Perrone, 2008; Bekedam et al., 2008; Gniechwitz et al., 2008). 
Estes compostos são responsáveis pela cor e por parte do aroma característicos de café, pão, 
malte e carne. Dentre esses alimentos, o café é considerado a maior fonte de melanoidinas 
na dieta humana (Moreira et al., 2012). Estudos com sistemas-modelo mostram que esses 
compostos são parcialmente hidrofóbicos (Gniechwitz et al., 2008), aniônicos (Nunes e 
Coimbra, 2010) e apresentam propriedades redutoras (Homma et al., 1997). 
As melanoidinas são formadas durante a Reação de Maillard através de diversos 
mecanismos, tais como ciclização, isomerização e condensação de compostos de baixo 
peso molecular (Bekedam et al., 2008). Sendo assim, a formação das melanoidinas ocorre 
durante a torrefação do café e sua composição química varia de acordo com os teoresdos 
compostos presentes no grão verde: sacarose (após a inversão), polissacarídeos 
(galactomananas e arabinogalactomananas), aminoácidos, proteínas (da parede celular e de 
estoque) e CGA (Nunes and Coimbra, 2007). Sua estrutura quimica é relativamente 
31 
 
desconhecida, devido à complexidade de produtos gerados durante a Reação de Maillard 
(Bekedam et al., 2008). 
Existem três principais hipóteses sobre formação das melanoidinas. Heyns (1970) e 
Tressl (1998) sugerem que as melanoidinas são polímeros formados por unidades de 
furanos e/ou pirróis ligados por reações de policondensação durante os estágios avançados 
da Reação de Maillard. Hofmann (1998) detectou substâncias coloridas de baixo peso 
molecular capazes de realizarem ligações cruzadas com proteínas através de grupos ε-
amino da lisina ou arginina, produzindo compostos marrons e de alto peso molecular. Kato 
e Tsuchida (1981), e mais recentemente, Cammerer et al. (1995) sugeriram que o esqueleto 
das melanoidina é formado por produtos de degradação de açúcares, formados nas fases 
iniciais da Reação de Maillard, polimerizados através de condensações do tipo aldol, e, 
possivelmente, ligados a compostos com o grupamento amino. 
Apesar das propostas apresentadas fornecerem informações importantes sobre a 
formação das melanoidinas, as estruturas sugeridas são baseadas principalmente em estudos 
com sistemas-modelo. Em alimentos, a composição química das melanoidinas é 
provavelmente muito mais complexa, devido à presença de muitos outros compostos. 
Sendo assim, é provável que todas as estruturas propostas possam ser encontradas para as 
melanoidinas do café (Bekedam et al., 2008). 
O teor de melanoidinas em café pode ser determinado por subtração aos teores de 
carboidrato, proteína e cafeína. Outra forma de mensuração desses compostos ocorre pela 
sua absorbância em 405 nm, um comprimento de onda em que a intensidade da coloração 
marrom é medida (Bekedam et al., 2008). Atualmente, técnicas analíticas mais sofisticadas 
têm sido empregadas para o isolamento e quantificação das melanoidinas do café (Nunes e 
Coimbra, 2010). A fração de peso molecular elevado (FPME) da bebida de café tem sido 
isolada por diálise, utilizando membranas com corte de peso molecular de 2 kDa 
(Gniechwitz et al., 2008) e de 12 a 14 kDa (Nunes and Coimbra, 2008); por diafiltração 
com membranas de 3 kDa (Bekedam et al., 2008; Bekedam et al., 2006; Bekedam et al., 
2007); e ultrafiltração com membranas de 100, 50, 10, e 3 kDa (Gniechwitz et al., 2008; 
Delgado-Andrade, 2005; Marco et al., 2011). A grande diversidade de técnicas utilizadas 
com membranas de diferentes pontos de corte sugere que os autores ainda não chegaram a 
um consenso sobre o peso molecular mínimo das melanoidinas (Moreira et al., 2012). Com 
32 
 
isso, a grande limitação dos estudos com melanoidinas é a grande diversidade de métodos 
analíticos para o seu isolamento o que sugere a obtenção de frações muito heterogêneas 
entre eles (Nunes e Coimbra, 2010). 
O processo de incorporação de compostos fenólicos às melanoidinas do café tem 
sido assunto de debate na comunidade científica, uma vez que o destino dos CGA 
degradados durante a torrefação nunca foi completamente compreendido. A incorporação 
do 5-CQA, CA, FA e QA foi observada nas FPME e nas frações de peso molecular 
intermediário (FPMI). Além disso, estudos mostram a presença da ligação éster destes 
compostos às melanoidinas, após o tratamento das frações com a solução alcalina. Estas 
ligações covalentes detectadas mostram que a fusão alcalina é o melhor método de 
obtenção de compostos fenólicos ligados covalentemente às melanoidinas (Bekedam et al., 
2008; Nunes and Coimbra, 2007). 
De acordo com Perrone (2012), os CGA são incorporados às melanoidinas e 
degradados continuamente, com maior taxa de degradação do que incorporação. Além 
disso, este estudo mostra que a incoporação ocorre em sua maior parte de forma covalente, 
através da ligação do grupamento hidroxila do CA com uma cadeia lateral de 
polissacarídeo ou com um grupamento amino de aminoácido. Em contraste, Coelho (2014) 
observou maiores teores de CGA ligados ionicamente do que covalentemente em 
melanoidinas isoladas por ultrafiltração. 
De acordo com Nunes e Coimbra (2010), a interação entre os grupamentos 
hidroxilas dos CGA e o grupamento amino dos peptídeos ocorrerá preferencialmente de 
forma iônica. A ocorrência da ligação iônica foi observada em melanoidinas isoladas por 
ultrafiltração (Delgado e Morales, 2005). Entretanto, a liberação de compostos ligados 
covalentemente às melanoidinas foi observada após o tratamento alcalino da FPME 
(Bekedam et al., 2008). Baixos teores de CA (0,5% a 0,9%) e FA (0,1%) foram 
encontrados, em contraste com os teores de QA (1,7% a 3,7%). Isto sugere que maiores 
teores de QA são esterficados às melanoidinas (Nunes e Coimbra, 2010). 
Rufian-Henares (2007) e Vignoli (2013) sugeriram que a atividade antioxidante 
(AA) da FPME ocorre devido aos CGA ligados ionicamente e covalentemente às 
melanoidinas. O mecanismo pelo qual as melanoidinas exercem AA ainda não se encontra 
muito claro na literatura. Entretanto, sabe-se que este potecial é baseado na sua capacidade 
33 
 
de quelar metais e de se ligar aos radicais livres (Delgado-Andrade, 2005). De acordo com 
Richelle (2001), a AA das melanoidinas reduz ao decorrer da torrefação e a atividade 
máxima ocorre em torras médias. Os diferentes tipos de ensaios para a verificação da AA 
das frações e a grande variabilidade da sua composição química contribuem para a 
obtenção de resultados muitas vezes discrepantes. 
A relevância fisiológica das melanoidinas do café permanece desconhecida. 
Entretanto, Coelho (2014) relatou que formas condensadas de compostos fenólicos 
presentes nas melanoidinas associados aos polissacarídeos não digeríveis podem atuar 
como “esponjas”, ligando-se à radicais livres no trato gastrointestinal. Ullman et al. (2011) 
demonstraram que as FPMEs isoladas por ultrafiltração apresentam atividade antioxidante, 
o que sugere uma possível proteção contra radicais livres no cólon que poderiam estar 
associados ao desenvolvimento de câncer de cólon. De acordo com Ushida (2013), as 
melanoidinas apresentam a habilidade de inibir a lipoperoxidação, protegendo assim o 
organismo humano contra a aterosclerose e outras doenças ligadas ao estresse oxidativo. 
 
4. Utilização de técnicas de RMN para análises em alimentos 
 
A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma técnica não 
destrutiva e amplamente utilizada para a elucidação estrutural de moléculas orgânicas. 
Durante a análise, a substância é colocada sob influência de um campo magnético, o que 
acarreta no desdobramento dos níveis de energia de spin nuclear e na inversão do momento 
magnético. O pulso de radiofrequência excita o sistema, que retorna ao seu estado de 
equilíbrio através da relaxação. A relaxação de uma molécula está diretamente ligada a sua 
dinâmica e flexibilidade (Novoa-carballal et al., 2011). 
Neste contexto, os núcleos a serem estudados devem conter um número de massa 
ímpar, número atômico ímpar ou ambos. Consequentemente, eles possuirão um momento 
magnético. Neste contexto, núcleos como 
1
H, 
13
C, 
15
N, 
19
F e 
31
P podem ser estudados. 
(Pavia et al., 2010). A técnica de RMN possui algumas vantagens, como elevada 
reprodutibilidade e simplicidade analítica de preparação de amostras, detecção de uma 
grande variedade de compostos e elaboração de experimentos bidimensionais (2D). A sua 
34 
 
desvantagem está na baixa sensibilidade quando comparada as demais técnicas (Tyagi et 
al., 2010). 
O do RMN (1D), como RMN de 
1
H e RMN de 
13
C são amplamente difundidos. No 
entanto, o RMN (2D) têm sido tão utilizado quanto o RMN (1D) (Kaiser, 2010; Reynolds e 
Enríquez, 2002). A importância dos espectros 2D está no mapeamentodas interações 
intramoleculares e intermoleculares. As interações mais observadas são: homonucleares 
(por exemplo, 
1
H-
1
H) e heteronucleares (por exemplo,
1
H-
13
C). O HSQC (Heteronuclear 
single-quantum correlation), por exemplo, é uma correlação heteronuclear, mostrando 
núcleos de 
1
H e 
13
C diretamente conectados (Claridge, 2009). 
A aplicação do RMN (1D) para a análise de alimentos tem sido cada vez maior. Wei 
et al. (2012) utilizaram RMN de 
1
H em grãos de café arábica para investigar a variação da 
concentração relativa de CGA, sacarose, ácidos alifáticos, hidroximetilfurfural, 
polissacarídeos, trigonelina e ácido nicotínico em torras claras, médias e escuras. Bosco 
(1999) analisou o café expresso por RMN de 
1
H e obeservou o comportamento da cafeina, 
QA e trigonelina durante o processo de torrefação. 
No caso das melanoidinas do café, não é possível detectar compostos individuais 
por RMN (1D), sendo necessário fazer uso dos experimentos bidimensionais (RMN-2D) 
(Forseth e Schroeder, 2011). No estudo de Gniechwitz et al. (2008), por exemplo, foi 
utilizada RMN (2D) para obeservar a incorporação de compostos fenólicos às melanoidinas 
do café. Entretanto, poucos são os estudos que tentam elucidar a estrutura química destas 
moléculas. A extrema complexidade e diversidade de estruturas, além da grande 
dificuldade de isolamento das melanoidinas torna este assunto de grande interesse no meio 
científco (Wei et al., 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
35 
 
 
 
 
 
 
Objetivo geral 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36 
 
O objetivo geral do presente trabalho foi investigar o efeito da torrefação sobre a 
composição química das melanoidinas do café por CLAE-DAD-EM e RMN e sua relação 
com a atividade antioxidante da bebida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 2 
Chemical and spectroscopic caracterization of 
coffee melanoidins and their relationship with the 
antioxidant activity 
 
Manuscrito a ser submetido ao periódico Food Chemistry 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
1. Introduction 
 
Melanoidins are the final brown products of the Maillard Reaction. They are high-
molecular weight nitrogenous compounds responsible for the color and aroma 
characteristics of coffee, bread, malt, and meat, among other thermally processed foods. 
Among these types of foods, coffee is regarded as the largest source of melanoidins in 
human diet (Coelho et al., 2014; Moreira et al., 2012; Coimbra et al., 2010). 
Melanoidins correspond to approximately 25% of roasted coffee weight (Hernández 
Perez et al., 2012; Perrone et al., 2009). During the coffee roasting process, they can be 
formed from sucrose, arabinogalactans, galactomannans, amino acids, proteins, and 
chlorogenic acids (CGA). All the forementioned compounds can increase the complexity 
and heterogenicity of this family of molecules. (Coelho et al., 2014; Vignoli et al., 2014; 
Moreira et al., 2012; Wang et al., 2011; Gniechwitz et al., 2008). 
All such compounds may exert biological activities such as antioxidant, anti-
inflammatory, antihypertensive, and antiglycative (Moreira et al., 2012). Despite the 
intense decrease in the CGA content in coffee brews during roasting, some studies show 
that these compounds are partially incorporated into melanoidins during this process, 
justifying their potential bioactivity (Coelho et al., 2014; Vignoli et al., 2014; Wang et al., 
2011; Bekedam et al., 2008; Borelli et al., 2002). 
Different methods have been employed for the isolation of coffee melanoidins. The 
high molecular weight fraction (HMWF) has been isolated by dialysis using membranes 
with molecular weight cut-off (MWCOs) of 2 kDa and 12-14 kDa, by diafiltration using 
hollow fiber with MWCO of 3 kDa. Through ultrafiltration, the HMWF has been isolated 
using membranes with MWCOs of 100, 50, 10 and 3 kDa (Coimbra, et al., 2010; 
Gniechwitz et al., 2008). The diversity of separation techniques with different MWCOs 
proves that researchers have not reached a consensus regarding the minimum molecular 
weight for melanoidins (Moreira et al., 2012). 
All these factors contribute to keeping the chemical structure of coffee melanoidins 
still unknown. Their structural elucidation is extremely complex, the diversity of their 
structures is large, and the isolation of melanoidins fraction is a very laborious process and 
subject to changes. Nevertheless, the characterization of the chemical structure of 
39 
 
melanoidins remains a topic of great academic interest. The analytical complexity of 
melanoidins structure challenges any investigation using conventional analytical 
approaches, such as CLAE-DAD. In this context, nuclear magnetic resonance (NMR) 
spectroscopy has been featuring promissing results in the food science field, due to the 
possibility of analyzing a variety of compounds simultaneously, and to the amount of 
structural information that can result from it. Moreover, NMR analysis has other 
advantages over chromatographic techniques, such as short-time procedures, easy sample 
preparation, and non-destructive technique (Wei et al., 2010). On the other hand, HPLC 
technique is more sensitive than NMR. HPLC doesn’t require high pressures, the system is 
compact and it’s easier to calculate the concentration of each compound. 
The aim of the present study was to investigate the effect of roasting on the 
chemical structure of coffee melanoidins by both HPLC-DAD and NMR spectroscopy, and 
to investigate its relationship with the antioxidant activity of these macromolecules. 
 
2. Materials and Methods 
 
2.1. Coffee Samples 
 
Two samples of good quality green Coffea arabica (named Arabica 1 and 2) were 
obtained from producers in Guaxupé, Minas Gerais, Brazil. A good quality sample of green 
Coffea canephora cv. Conillon was obtained from Cocam Company, located in Espírito 
Santo, Brazil. Arabica samples were roasted in a domestic fluidized bed roaster (Fresh 
Roast SR500, USA) at 220 °C for 3, 4, 5, 6, and 8 min. The Conillon sample was roasted at 
the same conditions for 4, 5, 6, 8, 10, and 12 minutes. Roasting degrees were determined by 
weight loss percentage during roasting, as well as by comparison with color disks from the 
“Roasting Color Classification System” (Agtron-SCAA, Reno, NV, USA, 1995), following 
the standards used by the Brazilian Coffee Industries Association (ABIC). The moisture 
(w/w) of coffee beans was determined gravimetrically after oven drying at 105 °C, 
according to the official method of AOAC (AOAC, 2005). 
 
 
40 
 
2.2. Coffee Brew Preparation 
 
The green and roasted coffee beans were frozen in liquid nitrogen and subsequently 
ground. Coffee brews were prepared at 10% (w/v), in triplicate, by adding 40 mL of boiling 
water to 4 g of ground coffee. The material was vortexed for 10 seconds and then filtered 
through a paper filter (Whatman nº 1). Coffee brews were kept at -20°C until analysis. 
Soluble solids (w/v) of coffee brews were determined gravimetrically after oven drying at 
105 °C, according to the official method of AOAC (AOAC, 1990). 
 
2.3. Extraction and quantification of free chlorogenic acids and lactones 
 
The coffee brews samples were clarified in triplicate by adding Carrez’s solutions, 
K2Fe(CN)6 (0.3 M) and Zn(OAc)2 (1.0 M). After 15 min the colloidal suspension was 
filtered through paper filter (Whatman nº 1), yielding the clarified coffee brew, which was 
kept at -20 °C until analysis. Coffee brews were clarified in order to exclude high 
molecular weight compounds such as melanoidins. The contents of CGA and lactones 
(CGL) from cliarified coffee brews were determined in triplicate by LC-DAD-MS. The LC 
equipament (Shimadzu, Kyoto, Japan) comprised a LC-10ADvp quartenary pump, a CTO-
10ASvp column oven, an 8125 manualinjector (Rheodyne), with a 5 µL loop and a SPD 
M10Avp diode array detector (DAD). This LC sistem was interfaced with a LC MS 2010 
mass spectrometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) fitted with a electrospray ion source. The 
chromatographic separation was achieved using a C18 column Kromasil® (150 x 2.1 mm, 
5 μm) maintained at a constant temperature of 40° C. The mobile phase used was a gradient 
between 0.3% aqueous formic acid (eluent A) and methanol (eluent B) with a flow rate of 
0.2 ml/min, as described by Perrone et al. (2012). The identification of CGA and CGL was 
performed by their molecular weight. 3-CoQA, 5-CQA, 4-CoQA, 5-CoQA and their 
respective lactones were quantified using the molar extinction coefficient of 5-CQA 
standard. 3-FQA, 3-CQA, 4-CQA, 4-FQA, di-CQA and their respective lactones were 
quantified through their own molar extinction coefficient. 
 
 
41 
 
2.4. Isolation of coffee melanoidins 
 
The isolation of the intermediate molecular weight fraction (IMWF) and the high 
molecular weight fraction (HMWF) rich in melanoidins from the coffee brews was carried 
out by ultrafiltration process, according to Andrade and Morales-Delgado (2005). Aliquots 
of the samples were introduced into a ultrafiltration apparatus with MWCO of 3 kDa 
(Millipore, USA), subjected to centrifugation (4276.35 g, 4°C, 15 min), and then the 
retentate was successively washed with Milli-Q water, and recentrifuged. The obtained 
retentate was transferred to a new ultrafiltration apparatus with MWCO of 10 kDa and 
subjected to successive washings and centrifugations. The filtered and retained fractions of 
the second ultrafiltration step were lyophilized (Labconco, USA). 
 
2.5. Antioxidant activity 
 
The antioxidant activity (AA) of coffee brews, clarified coffee brews, and isolated 
melanoidins fractions (IMWF and HMWF) was assessed by FRAP (Ferric Reducing 
Antioxidant Power) (Moreira et al., 2005) and TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant 
Capacity) (Re et al., 1999) assays. 
 
2.6. Determination of unbound, ionically bound, and covalently bound phenolic 
compounds in HMWF and IMWF 
 
The unbound phenolics refer to those compounds that were not removed from the 
melanoidins after the washing procedure and may be seen as contamination of these 
fractions. They were measured in triplicate by LC-DAD after addition Carrez’s solutions to 
IMWF and HMWF, as described by Perrone et al. (2012). The material was dissolved in 
water (10 mg/mL) and Carrez’s solutions were added (1:100 v/v) for clarification. After 
centrifugation, the supernatant was analyzed by LC-DAD-MS, using the same 
chromatographic conditions described in item 2.3. 
The contents of ionically (non-covalently) bound phenolic compounds were 
determined in triplicate by LC-DAD-MS after treatment of melanoidins with saturated 
42 
 
NaCl solution. Solutions containing 10 mg/mL HMWF and IMWF in 2 M NaCl were 
prepared and incubated for 12 hours. Subsequently, Carrez’s solutions were added to the 
mixture (1:100 v/v) and, after centrifugation, the supernatant was analyzed by LC-DAD-
MS (Delgado-Andrade & Morales, 2005; Perrone et al., 2012). The contents of ionically 
bound phenolic compounds was obtained by subtracting the contents of unbound (residual) 
phenolic compounds from the analytical results. 
The contents of phenolic compounds covalently linked to melanoidins were 
determined in triplicate by LC-DAD (Perrone et al., 2012). The volume of 750 μL of 2M 
NaOH solution containing 2% (w/v) ascorbic acid and 20 mM ethylenediamine- tetraacetic 
acid was added to 750 μL of HMWF and IMWF solutions (10 mg/mL). After incubation 
for 1 h at 30 °C, 330 μL of 5M HCl and Carrez’s solutions (1:100 v/v) were added. After 
centrifugation, the supernatant was analyzed by LC-DAD-MS. The contents of covalently 
bound phenolic compounds was obtained by subtracting the contents of unbound (residual) 
and ionically (non-covalently) bound phenolic compounds from the analytical results. 
 
2.7. Spectroscopic characterization of melanoidins by NMR 
 
All HMWF and IMWF were analyzed by 
1
H NMR. The analysis were performed on 
a Bruker DMX-750 (Billerica, MA), with 500 MHz, and a cryogenic probe with 5 mm at a 
temperature of 300 K. Samples (10 mg) were dissolved in deuterium oxide (0.7 mL) prior 
to analysis. The presaturation technique was used. The HMWF of Arabica 1 coffee roasted 
for 5 min was also analyzed by 
13
C NMR, and NMR using two-dimensional heteronuclear 
single quantum coherence (HSQC) experiment, which was performed on the same 
equipment. Also the standard 5-CQA 
1
H NMR analysis were performed under the same 
conditions to confirm its chemical shift. All HMWF, IMWF and 5-CQA were scanned 16 
times, equivalent to 5 minutes for each sample. The number of scans in HMWF of Arabica 
1 coffee roasted during 5 min were 24,675 for 
13
C NMR, 128 for 
1
H NMR, 64 for HSQC, 
corresponding to a longer acquisition time, improving the ratio signal/noise and turning the 
peak area more precise. The signal or group of signals areas of interest were automatically 
integrated by the TopSpin
TM
 software. The coupling constant was measured for each 
https://www.google.com.br/search?espv=2&biw=1517&bih=741&q=billerica+massachusetts&stick=H4sIAAAAAAAAAGOovnz8BQMDgwsHnxCXfq6-gVFBcbJZhRIHiF1SVZWhpZWdbKWfX5SemJdZlViSmZ-HwrHKSE1MKSxNLCpJLSoOmSTzcIYzl-v-1dl7pnCputheM5oGACssFkthAAAA&sa=X&ei=JWopVfKdEIukgwTT34Ig&sqi=2&ved=0CH8QmxMoATAQ
https://www.google.com.br/search?espv=2&biw=1517&bih=741&q=massachusetts&stick=H4sIAAAAAAAAAGOovnz8BQMDgysHnxCXfq6-gVFBcbJZhRIniG2abV6cpKWVnWyln1-UnpiXWZVYkpmfh8KxykhNTCksTSwqSS0qTvrHKtiu6MmkrZr0LM199_bHQd-fAwBiRd4LYgAAAA&sa=X&ei=JWopVfKdEIukgwTT34Ig&sqi=2&ved=0CIABEJsTKAIwEA
43 
 
doublet. The chemical shift for all compounds ranged from 0 to 8.5 ppm in 
1
H NMR and 
from 0 to 220 ppm in 
13
C NMR. All 
1
H NMR, 
13
C NMR and HSQC specters are annexed. 
 
3. Results and Discussion 
 
 3.1. Roasted coffee samples classification 
 
The roasting of green coffee samples resulted in different color degrees: from very 
light to very dark roasts for Arabica 1 and 2 samples (with 13.9% to 22.0% of weight loss), 
and from very light to dark roasts for Conillon sample (with 15.6% to 22.5% of weight 
loss) (Table 1). These results are in agreement with literature data and occur due to loss of 
water combined to the wide variety of volatile organic compounds generated during 
roasting, which are responsible for the aroma of the ground coffee (Perrone, 2008). 
 
3.2. Chemical characterization of coffee brews 
 
The coffee brews presented on average 21.0 mg/ml of soluble solids in coffee 
Conillon and, on average, 18.6 mg/ml in coffee Arabica. (Table 1). From this content, 
32.2% corresponded to melanoidins (IMWF and HMWF), considering all coffee samples. 
During the roasting process, melanoidins contents displayed a variable behavior, but in 
general, their content (6.4 mg/mL) was similar in both species. The same was observed in 
Vignoli et al. (2014), when it was obeserved that both species have simliar levels of 
melanoidins at the same point of roasting. All samples showed higher levels of HMWF 
than IMWF. Arabica coffee samples showed, on average, 67.5% and 32.5% of HMWF and 
IMWF in relation to the total of melanoidins, respectively. Also, Conillon coffee showed 
80% of HMWF and 20% of IMWF. The maximum contents of melanoidins were observed 
in light and medium roasts of coffee samples (Figure 1), while dark and very dark roasts 
showed lower levels in both species. According to Bekedam et al. (2008), the roasting 
process causes a reduction in HMWF and IMWF polymerization, information that confirms 
the obtained results. 
 
44 
 
 
Table 1. Weigh loss (%), color, soluble solids (mg/mL) and relative contents (mg/mL) of 
IMWF and HMWF of coffee samples
a
. 
Roasting time 
(min) 
Weight 
loss (%) 
Color 
(SCAAdisc) 
Soluble solids 
(mg/mL) 
IMWF 
(mg/mL) 
HMWF 
(mg/mL) 
 Arabica 1 
Green - - 26.5 0.8 5.9 
3 14.0 Very light 19.0 0.5 2.7 
4 17.0 Medium 17.6 7.8 11.0 
5 18.5 Medium 22.0 3.9 7.4 
6 19.5 Dark 20.3 6.3 9.1 
8 22.4 Very dark 20.0 0.9 3.7 
 Arabica 2 
Green - - 11.5 0.5 4.2 
3 13.8 Very light 14.4 0.9 2.8 
4 16.3 Medium 13.7 0.9 3.5 
5 17.6 Medium 20.6 0.9 5.0 
6 18.2 Dark 20.8 5.9 4.1 
8 21.6 Very dark 17.7 0.8 3.3 
 Conillon 
Green - - 25.2 0.7 12.0 
4 15.6 Very light 19.6 1.0 3.1 
5 16.7 Light 19.1 1.0 10.2 
6 17.8 Medium 18.9 1.0 10.9 
8 19.6 Medium 20.6 0.9 2.9 
10 21.6 Dark 21.6 0.8 2.4 
12 22.5 Dark 19.6 0.8 2.2 
a 
Solube solids results are presented in three true replicates; CV was lower than 10% for green and roasted 
samples. 
 
 Twelve CGA and seven CGL were identified and quantified in the coffee brew 
Arabica and Conillon samples according to their retention time: 3-CQA, 3-CoQA, 5-CQA, 
3-FQA, 4-CQA, 5-CoQA, 4-CoQA, 3-CQL, 5-FQA, 4-CQL, 4-FQA, 3-CoQL, 4-CoQL, 3-
FQL, 4-FQL, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA and 3,4-diCQL. During roasting, CGA 
contents decreased from 51.7% to 96.5% in comparison to green coffee brews. These brews 
were prepared with beans roasted from 3 to 8 min (Arabica) and from 4 to 12 min 
(Conillon). The reduction of CGL ranged from 4.4% to 0.5%. Out of all the quantified 
CGA, 5-CQA was the most abundant, representing an average of 64.7% of the total CGA in 
coffee brews prepared with green beans and 35.2% of the total CGA in coffee brews 
prepared with roasted beans. 
45 
 
 
A ra b ica 1
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
1 1
IM W F (m g /m l)
H M W F (m g /m l)
R o a s tin g tim e (m in )
H
M
W
F
 a
n
d
 I
M
W
F
 (
m
g
/m
l)
C o n illo n
0 2 4 6 8 1 0 1 2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
1 1
1 2
IM W F (m g /m l)
H M W F (m g /m l)
R o a s tin g tim e (m in )
H
M
W
F
 a
n
d
 I
M
W
F
 (
m
g
/m
l)
A ra b ica 2
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
1
2
3
4
5
6
7
R o a s tin g tim e (m in )
H
M
W
F
 a
n
d
 I
M
W
F
 (
m
g
/m
l)
IM W F (m g /m l)
H M W F (m g /m l)
 
Figure 1. Contents (mg/ml) of HMWF and IMWF in coffee Arabica and Conillon samples. 
 
The CGL formation during roasting reached a maximum for brews prepared with 
coffee beans that had been roasted for 3 to 4 min. Those corresponded, on average, to 3,5% 
of the CGA contents observed in the respective green coffee brews. On the next minutes of 
roasting, CGL contents in coffee brews were greatly reduced, reaching an average of 0,5% 
for brews prepared with very dark beans (Arabica coffee) and dark beans (Conillon coffee) 
(Table 2). 
 
 
 
 
 
 
46 
 
Table 2. Chlorogenic acids (CGA) and lactones (CGL) contents (mg/L) in coffee brews
a,b,c
. 
Roasting 
time (min) 
Total 
CQA 
Total 
FQA 
Total 
diCQA 
Total 
CoQA 
Total 
CQL 
Total 
FQL 
Total 
diCQL 
Total 
CoQL 
 Arabica 1 
Green 1784.8
1
 140.4
1
 48.2
1
 63.8
1
 ND
d
 ND ND ND 
3 1152.9
2
 62.4
2
 22.0
2
 54.7
2
 17.4
1
 14.6
1
 0.4
1
 19.7
1
 
4 381.1
3
 30.8
3
 5.0
3
 51.6
3
 8.8
2
 4.0
2
 0.4
1
 3.0
2
 
5 305.3
4
 23.6
3
 4.5
3
 49.2
4
 7.0
2
 3.7
2
 0.4
1
 3.0
2
 
6 185.9
5
 16.0
3
 3.7
3
 41.5
5
 4.2
3
 3.2
2
 0.1
1
 3.1
2
 
8 72.7
6
 4.0
1
 2.5
3
 18.4
6
 1.4
4
 1.4
3
 ND 3.0
2
 
 Arabica 2 
Green 3904.8
1
 166.3
1
 14.5
1
 61.9
1
 ND ND ND ND 
3 1072.9
2
 82.2
2
 7.5
2
 55.6
2
 33.9
1
 6.3
1
 0.9
1
 2.7
1
 
4 582.4
3
 26.2
3
 2.6
3
 54.6
2
 15.7
2
 4.7
2
 0.7
1
 1.2
2
 
5 541.0
4
 18.4
3
 1.8
3
 51.5
3
 15.9
2
 4.7
2
 0.1
1
 0.1
3
 
6 361.2
5
 12.4
3
 0.8
3
 46.1
4
 12.4
3
 4.1
2
 0.1
1
 0.1
3
 
8 124.9
6
 4.3
3
 0.4
3
 18.3
5
 8.0
4
 3.4
2
 ND 0.1
3
 
 Conillon 
Green 5528.9
1
 1009.8
1
 799.5
1
 363.7
1
 ND ND ND ND 
4 2857.8
2
 381.9
2
 101.5
2
 293.7
2
 112.4
1
 90.9
1
 46.4
1
 11.5
1
 
5 1620.1
3
 216.3
3
 50.1
3
 188.2
3
 91.2
2
 58.8
2
 31.3
2
 10.0
1
 
6 596.4
4
 114.0
4
 15.4
4
 90.6
4
 58.5
3
 25.9
3
 11.1
4
 6.6
1
 
8 214.8
5
 56.5
5
 8.0
5
 42.5
5
 40.5
4
 13.6
4
 3.0
4
 6.4
1
 
10 155.6
6
 28.5
6
 4.5
6
 37.2
6
 11.8
5
 6.1
5
 1.5
4
 3.8
1
 
12 80.7
7
 15.8
6
 3.0
7
 24.3
7
 8.0
6
 4.4
6
 1.0
4
 3.2
1
 
a
Results are presented as mean of three true replicates; CV was lower than 10% for green and roasted 
samples. 
b
CQA = caffeoylquinic acid, FQA = feruloylquinic acid, diCQA = dicaffeoylquinic acid, CoQA = 
coumaroylquinic acid, CQL = caffeoylquinic acid lactone, FQL = feruloylquinic acid lactone, diCQL = 
dicaffeoylquinic acid lactone, CoQL = coumaroylquinic acid lactone. 
c
Different superscript arabic numerals 
in each column of the same subsets indicate that samples are statistically different (p<0.05). 
d
Not detected. 
 
3.3. Phenolic characterization of HMWF and IMWF 
 
Ionically bound and residual CGA derivatives were detected in the HMWF and 
IMWF of coffee brews. This was not observed by Perrone et al. (2012), who did not detect 
ionically bound CGA after such high ionic strength treatment was employed. Moreoever, 
residual CGA weren’t detect too. They are remaining molecules after melanoidins isolation, 
like "contaminants". These results may be explained by the different methods used in both 
studies for the isolation of the melanoidins from the coffee brew. Perrone et al. (2012) 
employed dyalisis with five water renewals, which should be more efficient eliminating the 
residual bound CGAs from the melanoidins’ structure than ultrafiltration. 
47 
 
In this study we investigated the relative contents of phenolic acids covalently and 
ionically bound to the HMWF, IMWF in order to verify the distribution of these phenolic 
compounds in melanoidins fractions. In Arabica 1 melanoidins samples, a higher 
percenatage of phenolic acids covalently linked to the HMWF (65%) was observed in 
comparison to those covalently linked to the IMWF (21%). This behavior was different to 
that observed in Arabica 2 and Conillon samples, which presented, on average, 39% of 
phenolic acids covalently linked to the HMWF and 49% linked to the IMWF. In all 
samples, the content of phenolic compounds covalently linked to melanoidins was higher 
than the ionically bound phenolic acids in HMWF and IMWF. The same was observed by 
Coelho et al. (2014), which reported that the incorporation of phenolic compounds in 
coffee melanoidins resulted in a significantly higher amount of ester-linked phenolic 
compounds in the HMWF, ranging from 0.5 to 1.4 mmol/100g. According to these authors, 
these phenolic compounds may be connected by aryl-ether, stilbene-type linkages, and 
biphenyl linkages that can be cleaved by alkaline fusion. In contrast, Bekedam et al. (2008) 
and Perrone et al. (2012) showed that the linkage between the caffeic acid (CA) moiety of 
CGA and the melanoidin backbone occurred mostly through nonester bonds, via one of the 
hydroxyl groups of CA to a sugar or amino moiety. Small amounts of compounds ionically 
linked to the HMWF were found in our study. Coffee Arabica 1 and 2 presented, on 
average, 8.1% of those, a percentage higher than those obtained in the Conillon samples, 
which presented only 1.0% of the compounds ionically linked. Moreover, only Arabica 2 
samples presented ionically bound phenolic acids linked to the IMWF (19.6%) (Figure 2). 
 
 
 
 
48 
 
A ra b ic a 1 A ra b ic a 2 C o n illo n
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
1 0 0
Io n ic a lly b o u n d ( IM W F )
Io n ic a lly b o u n d (H M W F )
C o v a le n tly b o u n d (H M W F )
C o v a le n tly b o u n d ( IM W F )
P
h
e
n
o
li
c
 A
c
id
s
 (
%
)
 
Figure 2. Average relative content (%) of covalently and ionically bound phenolic acids in 
the HMWF and IMWF of 10% coffee brews. 
 
 
An increase followed by a decrese of