ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA E RELATÓRIO P- AULA 2 - ANALISE DE ALIMENTOS

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CENTRO UNIVERSITÁRIO FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS - FMU
CISBEM 
 
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA
São Paulo, 28 de novembro de 2022
Sacha Yelena Santos Silveira, discente do 5º semestre de Biomedicina do Centro Universitário Faculdades Metropolitanas Unidas.
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA
Relatório técnico apresentado como requisito parcial para obtenção de aprovação na disciplina Análise de Alimentos, na FMU.
Prof. Msc. Viviane Cristina Longuini de Menezes
São Paulo, 29 de novembro de 2022
 
SUMÁRIO
1	INTRODUÇÃO..............................................................................................	3
2	DESENVOLVIMENTO..................................................................................	4
2.1	OBJETIVO GERAL.......................................................................................	4
2.2	METODOLOGIAS.........................................................................................	4
2.2.1 	PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS.....................................................	5
2.3	RESULTADOS..............................................................................................	12
3	CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES.......................................................	12
	ANEXOS .......................................................	13
REFERÊNCIAS.............................................................................................	14
1 INTRODUÇÃO
Foi realizada as análises das amostras A e B de alimentos para identificar coliformes por tubos múltiplos múltiplos (NMP). 
A importância da análise de alimentos é para evitar as infecções alimentares que são causadas por microrganismos presentes nos alimentos, podendo se agravar dependendo da sua manipulação, higienização e preparação. Por exemplo, a E. Coli é uma bactéria que pode ser encontrada em diversos alimentos, pertencente ao grupo dos organismos infecciosos juntamente coma Salmonella e Campylobacter,. 
2 DESENVOLVIMENTO
2.1.1 OBJETIVO GERAL
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS
Ao final desta atividade experimental espera-se que o aluno seja capaz de:
-	Realizar análises de identificação coliformes por tubos múltiplos (NMP);
-	Realizar a semeadura em meios sólidos específicos para alimentos e analisar os principais microrganismos causadores de toxinfecções alimentares;
- 	Realizar coloração de Gram, analisar, identificar diferenças morfológicas e arranjos;
- 	Realizar a técnica de diferenciação do microrganismo através da prova da catalase.
2.2 METODOLOGIAS 
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), 
SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS 
COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS
2.2.1 ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP)
2.2.1.1 MATERIAL E REAGENTE
Bico de bunsen, 
Alça de platina,
Pissete com Alcóol 70%, 
tubos de Durham estéreis, 
béquer de 100 mL, 
proveta de 50 mL, 
tubos de caldo EC ou caldo Mac Conkey ou caldo BHI estéreis com tampa. 
tubos de caldo BHI com 7,5% NACL com tampa e estéril.
2.2.1.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
A técnica de tubos múltiplos é a mais tradicional para a análise de coliformes (totais ou termotolerantes) e E.coli. Esta metodologia permite a quantificação por “número mais provável” (NMP) de microrganismos e é dividida em duas fases sucessivas, uma presuntiva e outra confirmativa. E esta última somente é realizada se houver crescimento positivo na etapa presuntiva.
O procedimento da fase presuntiva consiste em fazer a homogeneização e transferência de alíquotas e/ou diluições da amostra para tubos de ensaios contendo, no fundo, um tubo invertido para coleta de gás (tubo de Durhan), e o meio de cultura apropriado (caldo lauril triptose). Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24 a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de coliformes totais, resultado identificado pela ocorrência de reação ácida (coloração amarelada) ou produção de gás (retida no tudo de Durhan).
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24 a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de Durhan.
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24 a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de Durhan.
(A fase complementar serve para identificação dos coliformes termotolerantes, na qual faz-se o repique dos tubos presuntivos para outros tubos, desta vez contendo meio EC (recomenda-se que seja feito simultaneamente ao teste confirmativo), que deverão ser incubados a 44,5ºC durante 24 horas. Todo este procedimento totaliza no mínimo 72 horas para obtenção de resultado positivo para coliformes termotolerantes.)
2.2.1.3 ANÁLISE DOS TUBOS (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA)
De acordo com o número de tubos positivos em cada uma das diluições e das fases utilizadas, determina-se o número mais provável (NMP), tendo como base tabelas estatísticas.
Acesse as tabelas de NMP e os procedimentos completos para análise de coliformes, segundo o FDA, no link: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm#tab1
Usando a Tabela, é possível estimar o número de organismos a partir de qualquer combinação de resultados positivos e negativos com 95% de confiança dos dados.
2.2.2 SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS
Semeadura e isolamento 
Material enriquecido em caldo TSB de swab ou “in natura”: 
Placas: esgotar o material em um ponto da placa e com a alça comum de níquel-cromo flambada e fria, realizar a semeadura com estrias para isolamento a partir do ponto de aplicação da amostra (semeadura direta) (Fig 1 a 4);
Fig 1
Fig 2
Fig 3
Fig 4
Fig 5
As placas a serem utilizadas serão Agar MacConkey e Agar Manitol.
Levar para a estufa a 36,5°C por 24h, para obter a multiplicação dos Mos. Do meio.
2.2.3 Avaliar o crescimento microbiano nos diferentes meios de cultura e realizar a identificação dos microrganismos.
(ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA)
Interpretação 
Crescimento no Agar MacConkey – Gram Negativos 
Fermentadores de Lactose – Colônia Rosa
Não Fermentadores de Lactose – Colônia Incolor ou Branca
Crescimento no Agar Manitol – Gram Positivas
Colônia pequeno e rodeadas de uma zona vermelha – estafilococos não-patogênicos
Colônia maiores e rodeadas de uma zona amarela – Staphylococcus aureus fermentadores do manitol 
2.2.4 Prova da catalase 
Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos, realizar uma bacterioscopia e depois a prova da catalase. 
a) Em um tubo de ensaio limpo, colocar cerca de 5 mL de peróxido de hidrogênio 20 volumes 
b) Com auxílio de uma alça, transferir uma colônia para o tubo e emulsioná-la no peróxido. 
c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO.
2.2.4 Coloração de Gram
1 INTRODUÇÃO
A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O método da coloração de Gram é baseado nacapacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto as paredes celulares de bactérias Gram negativas não o fazem.
2.2.4.1 OBJETIVO
Nesta aula o aluno irá executar o método de coloração de Gram, em esfregaços já previamente preparados e fixados pelo calor. Posteriormente, o aluno realizará a visualização dos esfregaços corados no microscópio óptico empregando a objetiva de imersão, deverão ser capazes de caracterizar a morfologia individual, a formação de agrupamentos e diferenciação da coloração da célula bacteriana.
2.2.4.2 MATERIAL E REAGENTE
Bico de Bulsen,
• Alça de Platina;
• Tubos de Ensaio;
• Algodão;
• Estante para tubo de ensaio;
• Conta-gotas;
• Placa de Patrick;
• Hagar Chocolate;
• Microscópio Ótico
• Lâmina
• Lamínula
• Cristal Violeta
• Lugol
• Fucsina
2.2.4.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Com todos os materiais sobre a bancada inicia-se pelo processo de esterilização da alça de platina sobre o bico de bulsen, para esterilizá-la deve-se segurá-la da mesma forma como se segura uma caneta, e rodá-la em cima do bico de bulsen para que o fogo percorra toda sua extensão, depois deve-se incliná-la aproximadamente 45º e esperar que ela fique incandescente; após a esterilização a alça de platina deve ficar apoiada no bico de bulsen para que ela não saia da área de proteção do mesmo. Tudo que for pego com a mão direita ou esquerda deve-se permanecer neste mesmo lado, visto que a troca de objetos de uma mão para a outra pode ocasionar acidentes devido ao risco que o bico de bulsen apresenta por se tratar de um emissor de chama.
Manuseando na área de segurança, pega-se o tubo de ensaio, retira-se o algodão que está tampando-o e com um conta gotas coleta-se a salina que está no tubo; esta salina deve ser pingada (uma gota) na lâmina que vai ao microscópio; no final deste procedimento deve-se passar o tubo de ensaio no bico de bulsen e tampá-lo novamente com algodão. Segurando de maneira leve a alça de platina, deve se abrir a placa de Patrick e esfregar a alça nela superficialmente para que possa ser retirada uma finíssima camada de microrganismos
que ali cresceram; tampa-se novamente a placa e realiza-se um esfregaço desta camada na lâmina que contêm a salina.
Com o bico de bulsen aceso, e com um prendedor segurando a lâmina, realiza-se a secagem da placa de maneira lenta, sem que ela corra risco de estourar.
Após a secagem foi realizado o processo de coloração; para corar devem-se realizar os seguintes passos:
a. Pingar o cristal violeta e esperar um minuto
b. Sobre ele pingar lugol e esperar mais um minuto,
c. Colocar solução de álcool cetona e lavar com água,
d. Cobrir com Fucsina e esperar 30 segundos,
e. Lavar e deixar secar.
2.2.4.4 ANÁLISE E LEITURA (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA)
Observar ao microscópio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de óleo mineral na lâmina e focalizar com objetiva de imersão.
Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram + ou -), a forma e o arranjo das células.
Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com papel absorvente.
As bactérias que tiverem a característica irão formar cristais violeta em seu interior e se diferenciarão das demais pela coloração mais acentuada.
	Morfologia
	Arranjo 
	Gram
	Cocos 
	Estreptococus
	positiva
	Bacilos 
	Estreptobacilos
	negativa
	
	
	
 
Quando as estruturas celulares, como você explicaria a possibilidade de comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram?
A Gram Positiva possui 50% do peso da célula de peptideoglicano, já o Gram Negativo possui apenas 10%. Quando se trabalha com o cristal de violeta e lugol tem uma formação interna na célula, o gram + cora e nunca mais descora por conta da parede espessa, a gram - quando insere o álcool cetona arrasta a coloração por conta da parede ser mais fina, descorando.
2.3 RESULTADOS
Relatar os resultados obtidos a partir dos experimentos e dos estudos realizados.
3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES
Nesta seção são descritas claramente as conclusões retiradas das discussões e dos experimentos realizados no decorrer da pesquisa, e finalizada a parte textual do trabalho, ou seja, RESPONDA OS OBJETIVOS DA AULA PRÁTICA. Recomendações são declarações concisas de ações, julgadas necessárias a partir das conclusões obtidas, a serem usadas no futuro.
ANEXO
TÉCNICAS DE SEMEADURA
Semeadura em Placas de Petri:
O material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o número, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento adequada.
Estrias Múltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra. Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. A semeadura poderá ser realizada em um sentido ou em vários, de acordo com a pessoa que realizará a técnica, lembrando-se sempre que o objetivo principal desta técnica de semeadura é a obtenção do isolamento bacteriano.
Semeadura em Meio Líquidos:
Difusão: Técnica que consiste em acrescentar microrganismos através da alça ou agulha de platina em meios líquidos. Tem como principal finalidade a observação de propriedades bioquímicas através de testes microbiológicos, bem como poderá ser utilizada para o favorecimento do crescimento bacteriano, quando é realizada em meios que possibilitem o enriquecimento.
Técnica para semeadura em meios líquidos:
Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás
da chama para proteção do operador);
Retirar a rolha de algodão do tubo que contém o microrganismo a ser semeado ou
repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão
direita. A ROLHA OU TAMPA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MÍNIMO, ATÉ
O FINAL DA OPERAÇÃO;
Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria;
Flambar novamente a boca do tubo e fechar;
Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar;
Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar;
Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa
REFERÊNCIAS
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS – ABNT. NBR 10719: apresentação de relatórios técnico-científicos. Rio de Janeiro, 1989. 9 p.
bsjoi.ufsc.br/files/2010/.../Modelo_de_relatorio_tecnico-cientifico.do
Não devem ser referenciadas fontes bibliográficas que não foram citadas no texto. Caso haja conveniência de referenciar material bibliográfico sem alusão explícita no texto, isto deve ser feito na seqüência das referências, sob o título “Bibliografia Recomendada”.
As referências são alinhadas somente à margem esquerda do texto, digitadas em espaço simples e separadas entre si por dois espaços simples. Além disso, devem estar em ordem alfabética, por autor.