Diego-Baiao

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
EFEITO DA INGESTÃO DO SUCO DA BETERRABA SOBRE A PRODUÇÃO DE 
ÓXIDO NÍTRICO EM ADULTOS SAUDÁVEIS. 
 
 
 
 
 
 
Diego dos Santos Baião 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2014
ii 
 
 
 
 
 
 
 
EFEITO DA INGESTÃO DO SUCO DA BETERRABA SOBRE A PRODUÇÃO DE 
ÓXIDO NÍTRICO EM ADULTOS SAUDÁVEIS. 
 
 
 
 
 
DIEGO DOS SANTOS BAIÃO 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado apresentada 
ao Programa de Pós-Graduação em 
Ciência de Alimentos da Universidade 
Federal do Rio de Janeiro, como parte 
dos requisitos necessários à obtenção 
do título de Mestre em Ciências. 
 
 
 
 
 
 
Orientador: Prof.ª Drª. Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
Coorientador: Prof. Dr. Thiago da Silveira Alvares 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
 Março, 2014 
 
iii 
 
EFEITO DA INGESTÃO DO SUCO DA BETERRABA SOBRE A PRODUÇÃO DE 
ÓXIDO NÍTRICO EM ADULTOS SAUDÁVEIS. 
 
 
DIEGO DOS SANTOS BAIÃO 
 
 
Orientador: Prof.ª Drª. Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
 Coorientador: Prof. Dr. Thiago da Silveira Alvares 
 
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciência 
de Alimentos da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos 
requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências. 
 
 
Aprovada por: 
 
________________________________________________________ 
Profa. Dra. Vânia Margaret Flosi Paschoalin – IQ/UFRJ 
- Presidente - 
 
 
_______________________________________________________ 
Prof. Dr. Alexandre Guedes Torres – IQ/UFRJ 
 
 
 
_______________________________________________________ 
Prof. Dr. Carlos Adam Conte-Junior – UFF 
 
 
 
_______________________________________________________ 
Prof. Dr. Eduardo Mere Del Aguila – IQ/UFRJ 
- suplente - 
 
 
_______________________________________________________ 
Profa. Dra. Ana Rosa Cunha Machado – UERJ 
- suplente - 
 
 
 
Rio de Janeiro 
 Março, 2014
iv 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
 Março, 2014. 
 
B152 
 
Baião, Diego dos Santos. 
Efeito da ingestão do suco da beterraba sobre a produção de óxido 
nítrico em adultos saudáveis / Diego dos Santos Baião. – Rio de 
Janeiro: UFRJ/IQ, 2014. 
xiv, 73f.: il. 
 
Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin e Thiago Silveira 
Alvares. 
 
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, 
Instituto de Química, Programa de Pós-graduação em Ciência de 
Alimentos, 2014. 
 
1. Nitrato. 2. Nitrito. 3. Beterraba. 4. Óxido Nítrico. 5. Alimento 
funcional. 6. Cromatografia líquida de alta eficiência. I. Paschoalin, 
Vânia Margaret Flosi. (Orient.). II. Alvares, Thiago Silveira. (Orient.). III. 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química. 
Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos. IV. Título. 
 
CDD: 641 
 
v 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço ao Prof. Dr. Carlos Adam Conte Junior por todo apoio e conhecimento 
acadêmico transmitido a mim para o desenvolvimento do presente trabalho. 
 
A minha avó (Lúcia Lopes), mãe (Solange Lopes), tio (Jorge Lopes) e namorada 
(Natalie Ramos) pela paciência, carinho e apoio incondicional durante os 
momentos de estresse e ansiedade desenvolvidos durante o Mestrado. 
 
Aos amigos do LAABBM, principalmente Prof. Dr. Eduardo Mere Del Aguila e ao 
secretário Rafael (bola) pela ajuda, apoio e conselhos proporcionados. 
 
A Profa. Dra. Vânia Paschoalin e ao Prof. Dr. Joab Silva pela confiança que 
depositaram em mim e pela grande contribuição que deram para o 
desenvolvimento do estudo. 
 
Ao amigo e coorientador Prof. Dr. Thiago da Silveira Alvares pelos conselhos, 
apoio, paciência, ensinamentos e conhecimento acadêmico transmitido a mim 
durante o Mestrado, sem o qual nada disso seria possível. 
 
Aos órgãos de fomento, CAPES e FAPERJ, pelo apoio financeiro concedido a 
mim e ao presente projeto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vi 
RESUMO 
EFEITO DA INGESTÃO DO SUCO DA BETERRABA SOBRE A PRODUÇÃO DE 
ÓXIDO NÍTRICO EM ADULTOS SAUDÁVEIS. 
 
Diego dos Santos Baião 
 
 Orientador: Prof.ª Drª. Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
 Coorientador: Prof. Dr. Thiago da Silveira Alvares 
 
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação 
em Ciência de Alimentos, Instituto de Ciências Química, da Universidade Federal 
do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do 
título de Mestre em Ciências. 
 
O nitrato (NO3
-) presente no suco da beterraba está a emergir como um regulador 
das funções do sistema cardiovascular, devido a possível conversão a óxido 
nítrico (NO). O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da ingestão do suco da 
beterraba sobre a síntese do NO em adultos saudáveis de ambos os gêneros 
masculino e feminino. Trinta voluntários saudáveis (15 homens e 15 mulheres) 
participaram do estudo. Amostras de urina foram coletadas para medida de base 
(T0) e então os voluntários foram submetidos a dois tratamentos em dias não 
consecutivos: ingestão de 100 mL do suco da beterraba (BET) e ingestão do suco 
da beterraba reduzido em NO3
- (PLA). Novas coletas de urina foram realizadas 30 
(T30), 60 (T60), 90 (T90), 120 (T120), 150 (T150) e 180 (T180) minutos após a 
ingestão dos tratamentos. A síntese do NO foi analizada indiretamente através das 
concentrações urinárias de NO3
- e NO2
- utilizando um sistema de cromatografia 
líquida de alta eficiência. As concentrações urinárias de NO3
- aumentaram 
significativamente nos tempos T30, T60 e T90 na condição BET (T30: 1,04±0,36 
mmol/L; T60: 1,90±0,57 mmol/L e T90: 2,03±0,40 mmol/L) quando comparado ao 
tempo T0 (T0: 0,31±0,10 mmol/L) e a condição PLA (T30: 0,44±0,07 mmol/L; T60: 
0,51±0,07 mmol/L e T90: 0,50±0,10 mmol/L). As concetrações urinárias de NO2
- 
aumentaram significativamente nos tempos T60, T90 e T120 na condição BET 
(T60: 0,028±0,017 mmol/L; T90: 0,45±0,38 mmol/L e T120: 0,43±0,059 mmol/L) 
quando comparado ao tempo T0 (T0: 0,006±0,001 mmol/L) e a condição PLA 
(T60: 0,003±0,001 mmol/L; T90: 0,004±0,001 mmol/L e T120: 0,004±0,001 
mmol/L). Não foi observada interação entre os gêneros com relação a produção 
de NO. A ingestão de 100 ml do suco BET (3,33±0,080 mmol de NO3
-) foi capaz 
de estimular a síntese de NO de maneira similar em homens e mulheres 
saudáveis. 
 
Palavras-chave: nitrato, nitrito, óxido nítrico, beterraba. 
 
 
Rio de Janeiro 
 Março, 2014.
vii 
ABSTRACT 
 
EFFECT OF BEETROOT JUICE`S INTAKE ON THE NITRIC OXIDE 
PRODUCTION IN HEALTHY ADULTS. 
 
Diego dos Santos Baião 
 
 Orientador: Prof.ª Drª. Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
 Coorientador: Prof. Dr. Thiago da Silveira Alvares 
 
 
Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação 
em Ciência de Alimentos, Instituto de Ciências Química, da Universidade Federal 
do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do 
título de Mestre em Ciências. 
 
The nitrate (NO3
-) present in the beetroot juice is emerging as a regulator of the 
cardiovascular functions system because of possible conversion to nitric oxide 
(NO). The objective of the study was to evaluate the effects of ingestion of beet 
juice on NO synthesis in healthy adults of both males and females gender. Thirty 
healthy volunteers (15 men and 15 women) participated in the study. Urine 
samples were collected to measure baseline (T0) and then the volunteers 
underwent two treatments on non-consecutive days: 100 ml beetroot juice intake 
(BET) and beetroot juice reduced NO3
- intake (PLA). New urinecollections were 
performed 30 (T30), 60 (T60), 90 (T90), 120 (T120), 150 (T150) and 180 (T180) 
minutes after ingestion of the treatments. The NO synthesis was indirectly 
analyzed by urinary NO3
- and NO2
- using a system high performance liquid 
chromatography. Urinary NO3
- concentrations increased significantly in the times 
T30, T60 and T90 in the condition BET (T30: 1.04±0.36 mmol/L; T60: 1.90±0.57 
mmol/L e T90: 2.03±0.40 mmol/L), when compared to the time T0 (T0: 0.31±0.10 
mmol/L) and PLA condition (T30: 0.44±0.07 mmol/L; T60: 0.51±0.07 mmol/L and 
T90: 0.50±0.10 mmol/L). Urinary NO2
- concentrations increased significantly in the 
times T60, T90 and T120 on condition BET (T60: 0.028±0.017 mmol/L; T90: 
0.45±0.38 mmol/L and T120: 0.43±0.059 mmol/L) when compared to the time T0 
(T0: 0.006±0.001 mmol/L) and PLA condition (T60: 0.003±0.001 mmol/L; T90: 
0.004±0.001 mmol/L and T120: 0.004±0.001 mmol/L). No interaction between the 
genders with respect to NO production was observed. 100 ml BET juice intake 
(3:33±0.080 mmol of NO3
-) was able to stimulate NO synthesis similarly in healthy 
men and women efficiency. 
 
 
Keywords: nitrate, nitrite, nitric oxide, beetroot. 
 
 
Rio de Janeiro 
 March, 2014.
 
 
SUMÁRIO 
 
Resumo.................................................................................................... vi 
Abstract.................................................................................................... vii 
Lista de Tabelas....................................................................................... x 
 
Lista de Figuras........................................................................................ xi 
Lista de Anexos........................................................................................ xii 
Lista de Abreviaturas................................................................................ xiii 
CAPÍTULOS 
I. INTRODUÇÃO............................................................................. 15 
II. REVISÃO DA LITERATURA........................................................ 18 
2.1. Fontes de NO3
- e NO2
- inorgânicos.............................................. 18 
2.2. Estimativa da ingestão de NO3
- e NO2
- dietético.......................... 19 
2.3. NO3
-, NO2
- e NO........................................................................... 19 
2.4. Efeitos benéficos da suplementação de NO3
- e NO2
- dietético.... 24 
2.5. Farmacocinética da suplementação de NO3
- e NO2
- dietético..... 28 
2.6. Indicadores da produção do NO.................................................. 28 
2.7. Indicadores indiretos.................................................................... 29 
2.8. Possíveis efeitos adversos da suplementação de NO3
- e NO2
-... 30 
III OBJETIVOS................................................................................. 32 
3.1. Objetivo Geral.............................................................................. 32 
3.2. Objetivos Específicos.................................................................. 32 
IV. MÉTODOS................................................................................... 33 
4.1. Participantes................................................................................ 33 
 4.2. Desenho experimental................................................................. 33 
 
 4.3. Controle dietético......................................................................... 35 
4.4. 
 
Preparo dos sucos da beterraba.................................................. 
 
36 
 
4.5. Análises cromatográficas............................................................. 38 
4.5.1. Preparo dos padrões.................................................................... 38 
4.5.2. Análise dos padrões e sucos da beterraba.................................. 38 
4.5.3. 
 
Análise da produção de NO (NO3
- e NO2
- urinário)...................... 39 
4.6. 
 
Análise estatística........................................................................ 
 
39 
V. RESULTADOS............................................................................. 41 
 
5.1. Características dos voluntários.................................................... 41 
5.2. Cromatogramas dos sucos BET e PLA....................................... 42 
5.3. Cromatogramas das análises urinárias de NO3
-.......................... 43 
5.4. Cromatogramas das análises urinárias de NO2
-.......................... 44 
5.5. Produção de NO.......................................................................... 45 
5.5.1. 
 
Concentração urinária de NO3
-.................................................... 45 
5.5.2. Concentração urinária de NO2
-.................................................... 46 
5.6. Diferença da produção de NO entre os gêneros......................... 47 
5.6.1. Concentrações de NO3
- entre os gêneros................................... 47 
5.6.2. Concentrações de NO2
- entre os gêneros................................... 48 
VI. DISCUSSÃO................................................................................ 
 
49 
6.1. Produção de NO (NO3
- e NO2
- urinário)....................................... 49 
6.2. Diferenças na produção de NO entre os gêneros....................... 52 
VII. CONCLUSÃO.............................................................................. 
 
54 
VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................. 55 
 
x 
LISTA DE TABELAS 
 
 
 
CAPÍTULO IV 
 
TABELA 
1. : Características fisiológicas e bioquímicas dos voluntários................ 41 
xi 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
 
CAPÍTULO II 
FIGURA Página 
1. Representação esquemática da via NO3
- – NO2
-/NO e circulação 
entero-salivar. ........................................................................................... 
 
22 
2. Representação esquemática do mecanismo de vasodilatação............ 23 
 
 
CAPÍTULO III 
3. Desenho experimental das intervenções para os voluntários 
selecionados. ............................................................................................ 
 
35 
4. Preparos dos sucos BET e PLA............................................................ 37 
5. Cromatogramas representativos dos teores de NO3
- dos sucos BET 
(A) e PLA (B)............................................................................................. 
 
42 
6. Cromatogramas representativos das análises urinárias de NO3
- antes 
e após a ingestão dos sucos BET e PLA.................................................. 
 
 
43 
7. Cromatogramas representativos das análises urinárias de NO2
- antes 
e após a ingestão dos sucos BET e PLA.................................................. 
 
 
44 
8. Concentração urinária de NO3
- antes e após a ingestão dos sucos 
BET e PLA................................................................................................. 
 
45 
9. Concentração urinária de NO2
- antes e após a ingestão dos sucos 
BET e PLA................................................................................................. 
 
46 
10. Diferença entre os gêneros das concentrações de NO3
- urinário 
após a administração dos sucos BET....................................................... 
 
47 
11. Diferença entre os gêneros das concentrações de NO2
- urinário 
após a administração dos sucos BET....................................................... 
 
48 
xii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ANEXO 
 
 
 
ANEXO Página 
1. Termo de consentimento livre e esclarecido.................................... 64 
2. Documento de aprovação do comitê de ética em pesquisa do 
hospital universitário Clementino Fraga Filho – UFRJ.......................... 
 
67 
3. Cartaz para recrutamento.................................................................68 
4. Instrumento de Coleta de Dados...................................................... 
 
69 
5. Recordatório de 24 horas.................................................................. 
 
72 
6. Lista de alimentos restritos 24h antes dos dias da intervenção....... 
 
73 
xiii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
AC – Anidrase carbônica 
ALDH – Aldeído desidrogenase 
AO – Aldeído oxidase 
ATP – Adenosina trifosfato 
BH4 – Tetrahidrobiopiterina 
Ca2+ – Cálcio 
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência 
DAP – Doença arterial periférica 
desoxiHb – Desoxihemoglobina 
desoxiMb – Desoximioglobina 
FAD – Flavina adenina dinucleotídeo 
FC – Frequência cardíaca 
Fe2+ – Ferro ferroso 
Fe3+ – Ferro férrico 
FMD – Dilatação fluxo mediada 
FMN – flavina mononucleotídeo 
GCs – Guanilato ciclase solúvel 
GMPc – Monofosfato cíclico de guanosina 
GTP – Guanosina trifosfato 
Hb – Hemoglobina 
Hb3+ – Metahemoglobin 
HNO2 – Ácido nitroso 
HONOO – Ácido peroxinitroso 
IDA – Ingestão diária aceitável 
IR – Isquemia de reperfusão 
LDL – Lipoproteína de baixa densidade 
LDL-ox – Lipoproteína de baixa densidade oxidada 
KCl – Cloreto de potássio 
KNO3
- – Nitrato de potássio 
MetHba – Metahemoglobinemia 
xiv 
 
 
 
 
 
 
NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato 
NAD – Nicotinamida adenina dinucleotídeo 
N2O3 – Trióxido de dinitrogênio 
NO – Óxido nítrico 
NO+ – Íon nitrosônio 
NOS – Óxido nítrico sintase 
nNOS – Óxido nítrico sintase neuronal 
iNOS – Óxido nítrico sintase induzível 
eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial 
NO2 – Dióxido de nitrogênio 
NO2
- – Nitrito 
NO3
- – Nitrato 
OMS – Organização Mundial da Saúde 
ONOO- – Peroxinitrito 
OxiHb – Oxihemoglobina 
O2 – Oxigênio 
O2
- – Ânion superóxido 
PA – Pressão arterial 
ROS – Espécies reativas de oxigênio 
Vit. C. – Vitamina C 
XOR – Xantina Oxidorredutase 
15 
CAPÍTULO I 
INTRODUÇÃO 
A beterraba (Beta vulgaris L.) é uma hortaliça que pertence à família 
Quenopodiaceae. Ela é considerada fonte de fibras, agentes antioxidantes, 
minerais, além de apresentar um alto valor nutricional (glicídios na forma de 
sacarose) (Aquino et al., 2006; Agnes et al., 2008). Essa hortaliça é considerada 
também uma fonte importante de nitrato (NO3
-) dietético (Aquino et al., 2006; 
Lundberg et al., 2008; Agnes et al., 2008). 
Normas rigorosas a respeito do teor de NO3
- inorgânico são reguladas nos 
alimentos e também na água potável, pois até uma década atrás, esse ânion foi 
considerado um composto tóxico relacionado com o desenvolvimento de algumas 
malignidades como, por exemplo, metahemoglobinemia e seu potencial efeito 
carcinogênico (Mirvish, 1995; Lundberg et al., 2008). No entanto, recentemente o 
papel daquele ânion na função biológica tem aumentado o interesse da população 
científica. Os NO3
- provenientes de fontes endogena e exógena, participam da 
síntese de NO. 
Estudos desmonstraram que através da via L-arginina/óxido nítrico (NO), o 
nosso organismo catalisa a formação NO e L-citrulina a partir do substrato L-
arginina. Esta via depende da ação de um grupo de enzimas denominadas óxido 
nítrico sintase (NOS) e outros cofatores enzimáticos (Stuehr et al., 1985; Moncada 
et al., 1993; Siasos et al., 2006). Uma vez sintetizado, o NO pode ser rapidamente 
oxidado a NO2
- e NO3
- (Dejam et al., 2005 Dejam et al., 2004; Bryan, 2009) e 
esses ânions podem ser endogenamente re-convertidos a NO (Millar et al., 1998; 
Shiva et al., 2007; Cosby et al., 2003; Aamand et al., 2009; Li et al., 2009). 
O NO3
- proveniente da via exógena, ou seja, através da dieta, pode ser 
reduzido a NO2
- na cavidade oral por bactérias comensais que expressam a 
enzima nitrato redutase (Spiegelhalder et al., 1976; Lundberg et al., 2009). O NO2
- 
chega ao estômago onde, ao entrar em contato com o ácido gástrico, é 
decomposto de forma não enzimática a NO e outros óxidos de nitrogênio 
bioativos, através da via conhecida como nitrato-nitrito/NO (Lundberg et al., 2008; 
16 
Lundberg et al., 2009). Portanto, a teoria de que o NO3
- proveniente da dieta pode 
estimular a síntese endógena do NO, tem despertado o interesse da população 
científica e uma nova abordagem fisiológica, terapêutica e nutricional 
(Spiegelhalder et al., 1976; Lundberg et al., 2009) para esse ânion tem sido 
proposta. 
O NO é uma molécula gasosa, produzida endogenamente, que possui um 
importante papel no sistema cardiovascular ao promover a vasodilatação pelo 
relaxamento do músculo liso vascular (modulando o tônus vascular), regulando o 
fluxo sanguíneo e reduzindo a pressão arterial (PA) tanto em condições normais 
quanto em hipertensos (Arnal et al., 1999; Cosby et al., 2003; Larsen et al., 2006; 
Virdis et al., 2010). 
Existem algumas evidências na literatura demonstrando efeitos benéficos da 
ingestão do NO3
- (Ex.: suco da beterraba) sobre parâmetros bioquímicos e 
hemodinâmicos (Webb et al., 2008; Kapil et al., 2010; Bailey et al., 2009; 
Vanhatalo et al., 2011; Hobbs et al., 2012; Kelly et al., 2013). Webb et al. (2008), 
ofereceram para 14 voluntários saudáveis 500 mL de suco da beterraba ou 500 
mL de água. Após a ingestão do suco da beterraba, os autores observaram 
aumento significativo na síntese de NO (avaliado através dos seus metabólitos 
NO3
- e NO2
- plasmáticos). Kapil et al. (2010) administraram para 20 voluntários 
saudáveis (8 homens e 12 mulheres) cápsulas contendo 24 mmol de NO3
- de 
potássio (KNO3
-) ou cloreto de potássio (KCl). Em ambos homens e mulheres, as 
concentrações plasmáticas de NO3
- e NO2
- aumentaram significativamente após a 
ingestão do KNO3
-. No entanto, a concentração plasmática de NO2
- foi 
significativamente maior em mulheres quando comparado aos homens. Segundo 
os autores as possíveis explicações para este resultado foram às diferenças na 
absorção e excreção de NO3
- e NO2
-, além de diferentes cargas ou espécies 
bacterianas responsáveis pela redução do NO3
- a NO2
- na cavidade oral entre 
homens e mulheres. 
É importante salientar que esse e outros estudos (Vanhatalo et al., 2010 e 
2011; Lansley et al., 2011; Coles et al., 2012; Engan et al., 2012; Hobbs et al., 
2012; Kelly et al., 2013; Wylie et al., 2013) não avaliaram o teor de NO3
- presente 
17 
no suco da beterraba oferecido aos voluntários. Tal prática é importante para 
observar quais são os teores desses ânions que podem promover alterações 
fisiológicas e bioquímicas na saúde humana. Além disso, a maioria dos estudos 
(Webb et al., 2008; Kapil et al., 2010; Kenjale et al., 2011; Coles et al., 2012; 
Christensen et al., 2013; Velmurugan et al., 2013) utilizaram de forma inadequada 
o placebo, ou seja, não foram duplo-cego, realizaram os experimentos com 
tamanho amostral muito baixo e apenas em voluntários do gênero masculino 
(Dejam et al., 2007; Larsen et al., 2007; Webb et al., 2008; Kapil et al., 2010; Miller 
et al., 2012; Murphy et al., 2012). 
Baseado nestas limitações, o presente estudo foi realizado com o objetivo 
principal de avaliar o efeito da ingestão de uma única dose (100 mL) de suco da 
beterraba e a diferença sobre a produção de NO em homens e mulheres 
saudáveis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
CAPÍTULO II 
REVISÃO DE LITERATURA 
 
2.1. Fontes de NO3
- e NO2
- inorgânicos. 
Os vegetais, em geral, são considerados a principal fonte de NO3
- dietético. 
A beterraba, couve, rúcula, alface, espinafre e repolho chinês são vegetais 
classificados com alto teor de NO3
-. A batata, pepino, cenoura, feijão verde e 
berinjela são alguns exemplos de vegetais com um teor médio de NO3
- (Lidder 
et al., 2012). O teor de NO3
- nos vegetais é influenciado por fatores genéticos 
(tipo de planta, caule, folha e raiz), fatores ambientais (umidade, temperatura, 
teor de água, exposição à luz solar) e fatoresagrícolas (tipo de cultivo, 
adubação, uso de herbicidas) (Santamaría, 2006). O NO2
- é obtido de aditivos 
alimentares utilizados em carnes (incluindo bacon, mortadela, carne enlatada, 
salsicha, enlatados, carnes curadas e presuntos), produtos de panificação e 
cereais para melhorar o sabor, o aroma, a aparência e evitar o crescimento de 
alguns microrganismos, como a toxina botulínica. O NO2
- não é encontrado 
naturalmente em frutas e vegetais (Pennington et al., 1998). 
A beterraba da espécie Beta vulgaris L. pertence à família 
Quenopodiaceae e é originária de regiões européias e norte-africanas de clima 
temperado. Por isso, é produzida sob temperaturas amenas a frias (20°C e 
10°C). No Brasil, é cultivada principalmente na Região Sul e Sudeste (Alves et 
al., 2008). Essa hortaliça apresenta grande quantidade de um pigmento 
nitrogenado solúvel em água denominado betalaína. Cerca de 80% a 90% da 
composição de betalaínas das beterrabas vermelhas são betacianinas, 
conferindo uma coloração vermelho arroxeada a sua raíz tuberoza de formato 
globular (Aquino et al., 2006; Netzel et al., 2005; Alves et al., 2008). Alguns 
estudos têm mostrado que as betelaínas possuem propriedades antioxidantes 
(Kanner et al., 2001; Cai et al., 2003). A beterraba (Beta vulgaris L.) apresenta 
um elevado valor nutricional, um sabor doce acentuado e vem se destacando 
também como fonte de fibras, minerais e um alto teor de NO3
-. (Agnes et al., 
2008; Lundberg et al., 2008). 
 
 
 
 
19 
2.2. Estimativa da ingestão de NO3
- e NO2
- dietético. 
A Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1962 definiu um limite 
máximo para o consumo de NO3
- dos alimentos. Uma ingestão diária aceitável 
(IDA) de 3,7 mg de NO3
-/kg de peso corporal, o mesmo valor que é adotado 
pela Autoridade Européia em Segurança Alimentar. Esse valor equivale a ~260 
mg/dia para uma adulto com 70 kg (~4.2 mmol de NO3
-) (Katan, 2009; WHO, 
1995). A dieta vegetariana contém ~267 mg/dia para um adulto com 70 kg 
(~4,3 mmol de NO3
-), uma valor próximo a IDA e três vezes maior do que uma 
dieta considerada "normal" (que contém ~1,2 mmol de NO3
-) (Taylor, 1989). 
Devido a associação do NO3
- com a metahemoglobinemia ou “síndrome do 
bebê azul”, em 1942 foram estabelecidos limites para as concentrações de 
NO3
- na água potável. Desde então, nos EUA e na Europa foram estabelecidas 
concentrações de 45mg/L e 50 mg/L de NO3
- na água potável, 
respectivamente. Entretanto, a metahemoglobinemia é improvável de 
desenvolver na ausência de bactérias contaminantes, pois é necessário 
aconversão de NO3
- a NO2
-, para que o NO2
- formado possa oxidar o ferro 
ferroso (Fe2+) da hemoglobina em ferro férrico (Fe3+), impedindo a hemoglobina 
de fixar e transportar o oxigênio a nível celular (Avery, 1999). A IDA para o 
NO2
- é de 0,06 mg/ kg de peso corporal (Hord et al., 2009). 
 
2.3. NO3
-, NO2
- e NO. 
Até uma década atrás, esses dois ânions inorgânicos (NO3
- e NO2
-) eram 
considerados compostos tóxicos desfavoráveis derivados da nossa 
alimentação, pois estavam relacionados com o desenvolvimento de algumas 
malignidades como, por exemplo, a metahemoglobinemia e o câncer gástrico. 
Por isso, normas rigorosas a respeito dos níveis desses ânions foram 
reguladas nos alimentos e também na água potável (Mirvish,1995; Hord et al., 
20090). 
Mas, tanto o NO3
- quanto o NO2
- pode ser originado de duas fontes, 
endógena e exógena. A formação endógena do NO3
- e NO2
- ocorre através do 
metabolismo do NO, pela via L-arginina/NO. Uma vez no meio intracelular, o 
aminoácido L-arginina é convertido em NO e L-citrulina pela ação da enzima 
NOS e outros cofatores enzimáticos: calmodulina, Ca+, BH4, NAD, NADPH, 
FAD, FMN e O2 (Siasos et al., 2006). Além disso, o shear stress (força de 
 
20 
cisalhamento do fluxo sanguíneo exercida nas células endoteliais) pode 
estimular a NOS a produzir NO. Existem três isoformas da NOS: NOS neuronal 
(nNOS ou tipo I), NOS induzível (iNOS ou tipo II) e NOS endotelial (eNOS ou 
tipo III). (Stuehr et al., 1985; Moncada et al., 1993). Uma vez sintetizado, o NO 
é rapidamente oxidado a NO2
- por autoxidação ou pela ação da proteína 
plasmática transportadora de cobre (ceruloplasmina) e oxidado a NO3
- pela 
oxihemoglobina (oxiHb). O NO2
- formado pode também sofrer ação da oxiHb e 
gerar NO3
- (Dejam et al., 2005 Dejam et al., 2004; Bryan, 2009). 
A dieta constitui a principal fonte exógena potencial para aquisição de 
NO3
- e NO2
-. Em uma dieta Ocidental, a maior parte da ingestão de NO3
- é 
proveniente de produtos hortícolas (cerca de 80%), onde o teor do mesmo em 
plantas pode variar entre as diferentes espécies e são influenciados por fatores 
genéticos, padrões metabólicos, exposição à luz, utilização de fertilizantes e 
quantidade de NO3
- do solo. Geralmente, vegetais verdes folhosos como o 
alface e o espinafre, assim como também a couve e a beterraba são ricos em 
NO3
-. Uma única porção de algum desses vegetais contém mais NO3
- do que é 
formado endogenamente em um dia. A água potável também pode conter 
quantidades consideráveis deste ânion (Wennmalm et al., 1994; Weitzberg & 
Lundberg, 1998; Lijima et al., 2002). Uma forma de se aumentar à ingestão de 
vegetais na alimentação é por meio de uma variedade de sucos produzido ou 
provenientes desses alimentos. Se forem preparados e acondicionados 
corretamente (tempo e temperatura), a perda dos teores de NO3
- se torna 
insignificante (Tamme et al., 2010). 
Mas, o interesse na função biológica desses dois ânions tem aumentado, 
devido a descoberta da geração de NO no estômago através da redução ácida 
de NO2
- a NO, sendo uma via alternativa para a via L-arginina/NO (Benjamin et 
al., 1994, Lundberg et al., 1994). 
Por meio da via NO3
- - NO2
-/NO, o NO3
- ingerido é absorvido pela porção 
proximal do intestino delgado (possivelmente no jejuno) para a corrente 
sanguínea ou tecidos, onde cerca de 60% desse ânion é excretado na urina e 
25% é extraído pelas glândulas salivares, concentrando-se na saliva, 
participando do ciclo entero-salivar. O NO3
- salivar é reduzido a NO2
- na 
cavidade oral por meio da ação da enzima nitrato redutase, expressa por 
bactérias comensais orais, que utiliza esse ânion como aceptor terminal de 
 
21 
elétrons para a geração de ATP ou para incorporar em sua biomassa 
(Spiegelhalder et al., 1976; Lundberg et al., 2009). Ao chegar ao meio ácido 
gástrico, o NO2
- é protonado, formando o ácido nitroso (HNO2) que se 
decompõe espontaneamente (não enzimática) a NO e outros óxidos de 
nitrogênios bioativos, como o dióxido de nitrogênio (NO2) trióxido de 
dinitrogênio (N2O3) e íon nitrosônio (NO
+). Possivelmente, o HNO2 pode ser 
decomposto também a NO pela ação de ácido ascórbio e polifenóis (Lundberg 
et al., 2005, Lidder et al., 2012). No jejuno, os NO3
- e NO2
- remanescentes são 
rapidamente absorvidos para a corrente sanguínea ou tecidos, onde ocorre o 
acúmulo do NO3
- e NO2
- proveniente da dieta com os que foram sintetizados 
endogenamente pela via L-arginina/NO. A maior parte do NO3
- é excretado na 
urina e uma pequena parte é extraída pelas glândulas salivares, concentrando-
se na saliva, dando continuação ao ciclo entero-salivar (Lundberg et al., 2008; 
Spiegelhalder et al., 1976; Wagner et al., 1984). Uma pequena parte das 
concentrações plásmáticas de NO3
- e NO2
- podem sofrer ação da enzima 
xantina oxidorredutase (XOR), que tem atividade semelhante a enzima NO3
- 
redutase. A XOR é uma enzima que não necessita de O2 para catalisar a 
formação de NO a partir dos NO3
- e NO2
- remanescentes e em condições de 
hipóxia e isquemia, sua expressão e atividade aumentam. O NO2
- pode ser 
reduzido a NO bioativo também pela ação das enzimas desoxihemoglobina 
(desoxiHb) e desoximioglobina (desoxiMb), principalmente quando os níveis de 
O2 estão baixos (Lundberg et al., 2005). Outras enzimas e compostos compotencial redox, como a aldeído oxidase (AO), aldeído desidrogenase (ALDH), 
anidrase carbônica (CA), Vitamina C (Vit C.) e polifenóis têm a capacidade de 
sintetizar NO a partir da redução do NO2
- (Millar et al., 1998; Shiva et al., 2007; 
Cosby et al., 2003; Aamand et al., 2009; Li et al., 2009, Lidder et al., 2012) (Ver 
Fig. 1). 
 
 
 
22 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Representação esquemática da via NO3
-–NO2
-/NO e circulação 
entero-salivar. 
 
O NO é uma molécula produzida endogenamente sob a forma de gás e 
possui uma meia-vida muito curta (5 a 10 segundos). É caracterizada pelo 
baixo peso molecular (30,01 g/ mol) e em condições normais de temperatura e 
pressão, o NO possui solubilidade moderada em água (1.9 mM a 25°C). Tem 
uma melhor solubilidade em solventes apolares. Quando presente em sistemas 
biológicos, o NO encontra-se em maior concentração em ambientes lipofílicos 
(membranas e regiões hidrofóbicas de proteínas) (Archer, 1993; Kiechele et al., 
1993; Barreto et al., 2005). Essa molécula gasosa possui 11 elétrons de 
valência e um elétron não emparelhado, sendo altamente reativo. Além de ser 
rapidamente oxidada a NO2
- e NO3
- (Archer, 1993; Kiechele et al., 1993), tanto 
na fase aquosa como na fase gasosa, o NO pode reagir também com o radical 
ânion superóxido (O2
-) e produzir peroxinitrito (ONOO-). O ONOO- pode 
isomerizar o NO3
- ou pode ser protonado para formar o ácido peroxinitroso 
(HONOO), que por sua vez, pode se dividir em radicais hidroxila e NO2. Na 
presença do grupamento heme presente em algumas proteínas (Ex.: 
hemoglobina e mioglobina), o NO reage com a oxiHb para produzir 
metahemoglobina (Hb3+) e NO3
- (Lundberg et al., 2004)
 
23 
O NO destaca-se pelos efeitos que exerce na regulação do tônus vascular 
por atravessar o endotélio e difundir-se para as células musculares lisas dos 
vasos sanguíneos. Nas células musculares lisas, o NO ativa uma enzima 
denominada guanilato ciclase solúvel (GCs). Essa enzima catalisa a conversão 
do trifosfato de guanosina (GTP) para formar o monofosfato cíclico de 
guanosina (GMPc). O GMPc formado diminui as concentrações de Ca2+ 
intracelular por ativar a bomba de cálcio dentro da célula muscular lisa, 
promovendo a vasodilatação por meio da redução do tônus vascular (Arnal et 
al., 1999; Zago & Zanesco, 2006). Os íons de Ca2+ desempenham um 
importante papel na vasodilatação. A musculatura lisa não possui uma proteína 
reguladora que está presente no músculo esquelético, a troponina, que quando 
é ativada pelos íons de Ca2+, promove a contração da musculatura. A 
contração da musculatura lisa depende da interação entre o Ca2+ e a 
calmodulina. Portanto, uma diminuição da concentração de Ca2+ afeta a 
combinação entre Ca2+/calmodulina, ocasionando um relaxamento da 
musculatura lisa vascular ou a vasodilatação (Webb, 2003) (Ver Fig. 2). 
 
 
Figura 2: Mecanismo de vasodilatação mediado pela ação do NO. 
 
24 
2.4. Efeitos benéficos da suplementação de NO3
- e NO2
- dietético. 
A dinfunção endotelial é caracterizada como um estado patológico onde o 
endotélio sofre alterações estruturais e funcionais que prejudicam a 
manutenção da homeostase e do tônus vascular. Pode ser resultante de uma 
diminuição da síntese de NO (a partir da NOSe) ou de sua biodisponibilidade 
(Lidder et al., 2012). Stokes et al. (2009) observaram deficiências das 
respostas vasodilatadoras do endotélio em ratos alimentados por 3 semanas 
com uma dieta enriquecida em colesterol. Mas, a função endotelial foi 
restaurada ao normal após a administração de NO2
- em água. Bondonno et al., 
(2012) observaram um pequeno aumento da dilatação fluxo mediada (FMD) da 
artéria braquial ao longo de 4 min em 30 voluntários saudáveis, após a 
ingestão de 200 mg de espinafre (fonte de NO3
-). Webb et al., (2008) 
observaram também uma redução siginificativa da disfunção endotelial (~60%) 
induzida por um insulto isquêmico agudo no antebraço de 14 indivíduos 
saudáveis após a suplementação de 500 mL de suco da beterraba. Entretanto, 
Bahra et al. (2012) não observaram nenhum efeito na função endotelial de 
voluntários saudáveis. A FMD não se alterou por um período de 3 h após a 
ingestão dietética de NO3
-. 
A hipercolesterolemia é caracterizada por uma concentração plasmática 
de colesterol maior que 240 mg/dl e pode levar a um episódio aterosclerótico 
devido à quantidade elevada da lipoproteína de baixa densidade (LDL). A LDL 
pode ser oxidada (LDL-ox) por meio da exposição a espécies reativas de 
oxigênio (ROS). Essa LDL-ox exerce uma função pró-inflamatória, estimulando 
o endotélio a sintetizar na sua superfície quimiocinas, fatores de crescimento, 
células de adesão molecular (P-selectina), molécula de adesão vascular tipo 1, 
molécula de adesão intercelular tipo 1, além da diferenciação de monócitos em 
macrófagos. Por meio da sua ação antioxidante, o NO desempenha um efeito 
inibidor da oxidação das moléculas de colesterol LDL, pois reage com os 
radicais livres e ROS responsávies pela oxidação dessa molécula de colesterol 
(Naseem et al., 2005; Rubbo et al., 1994). 
No que diz respeito à inflação, tanto o NO derivado do endotélio quanto o 
derivado das plaquetas desempenham um efeito protetor por inibir a adesão, 
ativação, agregação e recrutamento plaquetário, ou seja, a
 
25 
formação de um processo trombótico. As plaquetas são fragmentos 
subcelulares circulantes no sangue que desempenham um importante papel na 
hemostasia primária, parando o sangramento nos vasos decorrente de injurias 
e atuando também nos processos imunológicos (Freedman et al., 2003). A 
ação inibitória que o NO exerce sobre as plaquetas ocorre por vários 
mecanismos. Para inibir a ativação e agregação plaquetária, o NO pode 
estimular a produção de GMPc para promover uma redução dos níveis de Ca2+ 
intracelulares, por inibir a liberação desse cátion pelo receptor tubular denso, 
por aumentar a taxa de extrusão, diminuir a entrada de Ca2+ do meio 
extracelular e aumentar a atividade da Ca2+-adenina trifosfatase do retículo 
sarcoplasmático. Além disso, o NO pode catalisar a fosforilação do receptor de 
tromboxano A2 e dos receptores de membrana glicoproteína IIb/IIIa. Para inibir 
a adesão das plaquetas, o NO pode estimular a diminuição da expressão da 
proteína P-selectina e até mesmo se difundir pelas membrans plaquetárias, 
exercendo suas funções em outras plaquetas (Hobbs et al., 2003; Jin et al., 
2005; Zanesco et al., 2005). Entretanto, foi publicado recentemente na 
literatura um estudo mostrando que uma pequena produção nas concentrações 
de NO (estimulado pela NOSe plaquetária) pode estimular e amplificar a 
secreção e agregação plaquetária. Portanto, parece que em altas 
concentrações, o NO estimula a inibição plaquetária, mas em baixas 
concentrações, ocorre um estímulo da ativação (Marjanovic et al., 2005). 
Após um período de isquemia, ou seja, a falta de suprimento sanguíneo a 
um tecido ou órgão causado por um coágulo sanguíneo, o restabelecimento do 
suprimento sanguíneo pode privar esse tecido ou órgão de oxigênio e 
nutrientes, levando a isquemia de reperfusão (IR). Alguns estudos têm 
demonstrado a interação NO com a função mitocondrial. Em condições de 
hipóxia como acontece na IR, a geração de NO por meio da desoxiMb, XOR e 
outras enzimas podem regular a respiração mitocondrial por meio da inibição 
do complexo IV, modulando os gradientes de oxigênio. É interessante notar 
que a XOR geralmente contribui para a IR, pois está relacionada com a síntese 
de ROS, como o O2
-. Mas em condições de hipóxia, o NO2
- pode alterar a 
atividade da XOR para gerar danos ao O2
- (Webb et al., 2004; Duranski et al., 
2005; Bryan et al., 2008; Lundberg et al., 2009). Kenjale 
 
26 
et al. (2011) suplementaram 8 voluntários com doença arterial periférica (DAP) 
com 500 mL de suco da beterraba. A DAP é caracacterizada por oclusõesateroscleróticas que prejudicam o fluxo sanguíneo para as extremidades 
inferiores, resultando em um suprimento de O2 inadequado para os tecidos, 
ocasionando claudicação. Os autores observaram um retardo da claudicação 
(18%) e um aumento do tempo de caminhada total (17%). Como a via L-
Arginina/ NOS é dependente de O2 para a síntese de NO, a via nitrato-
nitrito/NO pode ser considerada uma alternativa para garantir concentrações de 
NO suficientes durante essa condição (Lundberg et al., 2009). 
A hipertensão arterial é uma doença crônica, de etiologia multifatorial, 
onde a pressão arterial (PA) se encontra elevada (pressão arterial sistólica 
≥ 130 mm Hg e pressão arterial diastólica ≥ 90 mmHg). Essa doença afeta 
milhões de pessoas em todo o mundo, sendo um dos principais fatores de risco 
para a morbidade e mortalidade, pois pode causar lesões em órgãos e tecidos, 
tais como coração, cérebro, rins e retina. Além disso, é considerada um 
importante fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares 
(Larsen et al., 2006; Zago et al., 2006; Kapil et al., 2010). No Brasil, a 
prevalência da hipertensão arterial chega a valores superiores a 30% da 
população como um todo, sendo a população idosa a mais afetada, > 50% 
entre os idosos com 60-69 anos e 75% entre os idosos acima de 70 anos. 
A prevalência e a relação da mesma entre os gêneros foram de 36% para 
os homens e 30% para as mulheres, sendo similar a de outros países (Dórea et 
al., 2004; Pereira et al., 2009). 
Conforme já foi relatado, o NO é um importante vasodilatador e 
consequentemente um importante regulador do tônus vascular, sendo o seu 
papel na PA é extremamente relevante. Alguns estudos em animais mostraram 
que uma redução da síntese de NO, por L-NAME (análogo do L-Arginina) levou 
a uma HA dose-dependente (Ribeiro et al., 1992; Zatz et al., 1998). Estudos 
semelhantes em humanos avaliaram as respostas vasomotoras em hipertensos 
e observaram que nestas condições havia reduzida biodisponibilidade de NO 
(Creager et al., 1990; Heiss et al., 2006; Kleinbongard et al. 2003). 
A administração de NO3
- dietético tem demonstrado efeitos positivos 
pressão sanguínea devido a possível síntese de NO pela via NO3
- - NO2
-/NO 
(Larsen et al., 2006; Adrogue et al., 2007). Web et al. (2008) observaram uma 
 
27 
redução aguda na PA sistólia e diastólica (~10.4 mmHg±3,0 mmHg e ~8,1±2,1 
mmHg, respectivamente) de 14 indivíduos saudáveis após a ingestão de 500 
mL de suco da beterraba. Kapil et al. (2010) sumplementaram 9 individuos 
saudáveis com 250 mL de suco da beterraba. Os autores observaram uma 
redução de 5,4±1,5 mmHg na PA sistólica. Mas, os atores não observaram 
reduções na PA diastólica e frequência cardíaca (FC). Existem outros estudos 
na literatura mostrando o efeito benéfico do NO3
- dietético sobre parâmetros 
hemodinâmicos (Vanhatalo et al., 2010; Hobbs et al., 2012; Bondono et al., 
2012). 
Recentemente, tem sido investigada uma possível propriedade 
ergogênica do NO3
- dietético, associando sua ingestão à melhora do 
desempenho físico. Durante o exercício ocorrem alterações metabólicas e 
cardiovasculares onde fluxo sanguíneo bem como a demanda de O2 aumentam 
para os musculos ativos. Por isso, a redução de NO2
- a NO pela via NO3
- – 
NO2
-/ NO ou pela ação das enzimas XOR, desoxiHb, desoxiMb, AO, CA, 
ALDH, entre outras, é aumentada em condições onde a disponibilidade O2 é 
baixa ou a função da NOS está prejudicada (Castello et al., 2006). Vanhatalo et 
al. (2010) suplementaram 8 indivíduos saudáveis com 500 mL de suco da 
beterraba por um período de 15 dias. Os autores observaram uma redução de 
~ 4% no custo de O2 e ~5% na PA (sistólica e diastólica) durante o exercício de 
intensidade moderada. Estes efeitos foram observados após 5 e 15 dias de 
suplementação contínua de 500 mL de suco da beterraba. Lansley et al. (2011) 
observaram uma melhoria de 2,8% e 2,7% no desempenho contra o relógio em 
relação a 4 e 16 km de distancia percorridos por 9 voluntários saudáveis 
fisicamente ativos após a suplementação aguda de 500 mL de suco da 
beterraba. 
 Devido a suas propriedades de regulação do fluxo sanguíneo, 
contratilidade muscular e melhora da respiração mitocondrial (Stamler et al., 
2001), o NO pode proporcionar o aumento do suprimento sanguíneo e reduzir o 
custo de O2 no exercício submáximo e máximo, aumentando a duração do 
exercício até a exaustão (Bailey et al., 2009; Larsen et al., 2007 e 2010). 
 
 
28 
2.5. Farmacocinética após suplementação do NO3
- e NO2
- dietético. 
Diversos estudos avaliaram a suplementação de NO3
- e NO2
- derivados 
tanto de origem endógena quanto de origem exógena, principalmente sobre a 
saúde cardiovascular, sendo um fator importante para a interpretação dos 
efeitos biológicos, a concentração sistêmica desses ânions (Dejam et al., 2004; 
Bryan., 2009; Lundberg et al., 2009). Concentrações plasmáticas normais de 
NO3
- e NO2
- em humanos são de 20-40µM e 0,03-0,5µM, respectivamente 
(Gladwin et al., 2000; Garg et al., 2009; Kapil et al., 2010). Embora a maior 
parte do NO3
- ingerido, cerca de 60% é excretada na urina, 25% á absorvida 
ativamente pelas glândulas salivares, onde será reduzida na cavidade oral (na 
saliva) de forma eficiente a NO2
- pelas bactérias comensais orais, onde será 
absorvido pelo intestino delgado proximal para a corrente sanguínea, dando 
continuidade a esse ciclo (Lundberg et al., 2004). Alguns estudos comprovaram 
que uma ingestão elevada de NO3
- dietético (~250 mg) elevou em até sete 
vezes a concentração de NO3
- urinário, plasmático e salivar em voluntários 
humanos saudáveis em torno de 4-6 horas após a ingestão. E, após a ingestão 
dietética elevada de NO3
-, a concentração de NO2
- na urina, saliva e no plasma 
também aumentaram em quantidades e tempos característicos de cada estudo 
(Bartholomew et al., 1984; Pannala et al., 2003; Kapil et al., 2010). 
 
2.6. Indicadores da produção do NO. 
A detecção do NO em amostras biológicas representa um grande desafio, 
devido a sua meia-vida ser de apenas poucos segundos (Archer, 1993). O NO 
não é o único meio pelo qual o endotélio altera o tônus vascular. A 
vasodilatação pode ser promovida através da produção de prostaglandinas e 
fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio. A acetilcolina, outro 
vasodilatador dependente do endotélio que pode alterar o tônus vascular 
através do estimulo da síntese de prostaglandinas e NO. Por isso, diversas 
técnicas têm sido descritas na literatura para detectar a produção de NO de 
forma direta ou indireta (Schrage et al., 2005). 
A utilização de técnicas como a ressonância eletrônica para-magnética 
(Xia e Zweier, 1997) e a quimiluminescência (Laver et al., 2008), além da 
detecção eletroquímica utilizando sensores intravasculares (Davies e Zhang, 
2008), utilizadas para quantificar diretamente a produção de NO em modelos 
 
29 
biológicos, são de elevado custo e pouco usuais. Por este motivo, o presente 
trabalho revisou somente estudos utilizando indicadores indiretos. 
 
2.7. Indicadores indiretos. 
A quantificação do GMPc, além de NO3
- e NO2
- em fluidos biológicos, são 
métodos bastante utilizados para determinar o efeito do NO sobre a enzima GC 
e a sua oxidação. Após ser sintetizado, o NO difunde-se rapidamente das 
células endoteliais para a musculatura lisa dos vasos sanguíneos para ativar a 
GCs, que por sua vez irá formar o GMPc, a partir da quebra do GTP. A 
formação do GMPc promove a ativação da bomba de cálcio dentro da célula 
muscular lisa, diminuindo as concentrações de Ca2+ intracelular que promoverá 
a redução do tônus vascular. Desta forma, o aumento intracelular de GMPc 
induz o relaxamento da musculatura lisa e, consequentemente, à vasodilatação 
(Bode-bogër et al., 1998). 
Contudo, os níveis de GMPc podem aumentar por muitas razões 
independentes da síntese do NO. Agonistas, como aatriopeptina II, liberados 
em resposta ao aumento do volume plasmático, podem estimular a enzima 
GCs e desta forma aumentar as concentrações da GMPc causando um 
aumento do fluxo sanguíneo coronariano por um mecanismo independente do 
NO (Rapoport et al., 1986). 
O NO é rapidamente oxidado a NO2
- e, subsequentemente a NO3
- em 
soluções aquosas, (ex.: fluidos biológicos) e pode reagir com O2
− para produzir 
-ONOO. O NO2
- é oxidado pela oxiHb para formar NO3
- e MetHb. O NO reage 
diretamente com a oxiHb para produzir NO3
- e MetHb, com esta reação 
ocorrendo tanto no sangue arterial como no venoso. Levando em consideração 
os valores de pH do sangue e das células (aproximadamente 7,4 e 7,1, 
respectivamente), o NO3
- não sofre degradação nestes compartimentos. Então, 
o NO é rapidamente oxidado a NO2
- (metabólito relativamente estável). 
Teoricamente, a atividade da NOS in vivo é melhor avaliada pela medida 
de NO3
- na urina. A maior parte do NO3
- e NO2
- originado de outras fontes, tais 
como dieta (alimentos de origem animal e vegetal), água mineral e síntese de 
bactérias, o que pode causar ruído em seus resultados. Por esta razão, não é 
apropriado medir NO3
- e NO2
- no plasma e na urina como indicador da 
produção endógena de NO quando não há controle da dieta. Em princípio este
 
30 
problema pode ser minimizado ao realizar uma dieta com baixo teor de NO3
- e 
NO2
-, além do jejum. O tempo necessário para completa excreção de NO3
- e 
NO2
- exógeno varia de 12h a três dias, dependendo da ingestão prévia e 
função renal (Ellis et al., 1998). Em humanos saudáveis, consumindo uma dieta 
com baixo teor de NO3
- e NO2
- (210 µmol/dia), aproximadamente 50% do NO3
- 
urinário originado da síntese sistêmica do NO a partir da L-arginina (Castillo et 
al., 1996). Parece que após 12 h de jejum, as concentrações plasmáticas de 
NO3
- e NO2
- permaneceram constantes em sujeitos saudáveis consumindo uma 
dieta com baixo teor de NO3
- e NO2
- (Rhodes et al., 1995). Sob estas 
condições, as medidas do NO3
- e NO2
- no plasma parecem ser indicadores 
válidos para síntese de NO através da NOS, enquanto que sua medida na 
urina parece refletir a síntese sistêmica de NO (Tsikas et al., 2005). 
 
2.8. Possíveis efeitos adversos da suplementação de NO3
- e NO2
-. 
No passado, as duas principais preocupações relacionadas à saúde com 
NO3
- e NO2
- inorgânico era o risco do desenvolvimento de 
metahemoglobinemia (MetHba) e seu potencial carcinogênico. 
A MetHba ou "síndrome do bebê azul" é causada pelo aumento da 
concentração de MetHb no sangue, que ocorre tanto por alterações na síntese 
ou no metabolismo da hemoglobina (Hb) (Greer et al., 2005). A formação da 
molécula de MetHb ocorre quando o NO2
- oxida o íon Fe2+ do grupo heme da 
molécula de Hb para o estado Fe3+. Essa nova conformação impede a ligação 
com o oxigênio. Além disso, o Fe3+ pode levar a uma mudança alostérica do 
grupamento heme da Hb parcialmente oxidada, aumentando a sua afinidade 
pelo O2. Portanto, a hipóxia tecidual provocada pela MetHba está relacionada 
com a diminuição da Hb para transportar O2 como também pela liberação 
prejudicada de O2 para os tecidos (Avery, 1999; Baraka et al., 2001; Silva et al., 
2003). Devido a uma menor produção de ácido gástrico, lactentes (< 3 anos de 
idade) estão mais suscetíveis para desenvolver MetHba devido a maior 
redução de NO3
- a NO2
- por bactérias gástricas. Entretanto, não foi comprovado 
na literatura a associação do NO3
- e NO2
- com a MetHba em adultos e crianças 
(Cornblath et al., 1948; Kortboyer et al., 1997; Dejam et al., 2007). 
 
 
 
31 
Estes resultados tem levantado explicações alternativas para a MetHba 
observada especialmente em lactentes, incluindo gastroenterites e produção de 
NO mediada pela NOSi (induzida por uma contaminação bacteriana) (Powlson et 
al., 2008). Assim, há uma inveridicidade nas provas que sustentam a hipótese que 
tanto o NO3
- quanto o NO2
- são tóxicos. 
Em 1970, alguns pesquisadores na Alemanha e dos EUA sugeriram que o 
NO3
- e NO2
- dietético poderiam reagir com aminas secundárias (N- alquilamidas) no 
estômago e sofrer uma reação de nitrosação, formando N-nitrosaminas, que são 
substâncias cancerígenas que podem levar ao desenvolvimento de tumores 
(Spiegelhalder et al., 1976; Tannenbaum et al., 1976). O NO3
- e NO2
- são 
adicionados as carnes curadas e processadas atuando como potentes 
antioxidantes, agente atimicrobiano, desenvolvedores de sabor, aroma e 
estabilizadores da cor vermelha características desse alimentos. O consumo de 
carnes vermelhas e processadas está associado ao aumento do risco de câncer 
(Norat et al., 2005; Varraso et al., 2007; Santarelli et al., 2008). No entanto, alguns 
estudos realizados nesta mesma linha de pesquisa não conseguiram mostrar uma 
ligação entre as N-nitrosaminas e a ingestão de NO3
- e NO2
- com o 
desenvolvimento de câncer em humanos (Messinga et al., 2003; Hord et al., 2009; 
Tang et al., 2011). 
Um estudo realizado em voluntários saudáveis, suplementando uma elevada 
dose de NO3
- dietético (300 mg) não demonstrou nenhum efeito significativo nas 
concentrações plasmáticas de 3-nitrosaminas (Pannala et al., 2003). Mas existem 
alguns grupos que podem estar mais susceptíveis ao desenvolvimento de tumores 
quando exposto a uma alta ingestão de nitrato. McColl e colaboradores (2007) 
demonstram um aumento da reação de nitrosação na junção gastro-esofágico de 
pacientes com esôfago de Barrett. Somente estudos futuros mostrarão se existem 
mesmo grupos em que a redução do nitrato e nitrito pode ser maléfica. 
A dieta DASH (Dietary Approaches to Stop Hypertension) surgiu através de 
um estudo realizado entre universidades dos EUA com o objetivo de reduzir a 
pressão arterial e melhorar o perfil metabólico excede a IDA de NO3
- por ~ 500%. A 
regulamentação de NO3
- e NO2
- deve ser reavaliada. 
 
32 
 
CAPÍTULO III 
OBJETIVOS 
 
3.1. Objetivo Geral 
O objetivo principal do presente estudo foi avaliar o efeito da ingestão de 100 
mL do suco da beterraba sobre a produção de NO em adultos saudáveis de 
ambos os gêneros masculino e feminino. 
 
 
3.2. Objetivos Específicos 
 Determinar os efeitos da suplementação de NO3
- sobre: 
 
(1) Produção de NO (através do indicador indireto NO2
- na urina) antes e a cada 
30 minutos ao longo de 3h após a ingestão dos tratamentos; 
 
(2) Determinar a concentração máxima do NO3
- na urina antes e a cada 30 
minutos ao longo de 3h após a ingestão dos tratamentos; 
 
(3) Comparar a produção de NO após a ingestão dos tratamentos em homens e 
mulheres; 
 
(4) Avaliar as concentrações de NO3
- e NO2
- nos sucos da beterraba rico e 
reduzido em NO3
-. 
 
 
 
 
 
 
33 
CAPÍTULO IV 
MÉTODOS 
 
4.1. Participantes. 
 Homens e mulheres com idades entre 18 e 40 anos, aparentemente 
saudáveis foram convidados a participar do presente estudo. O recrutamento foi 
realizado através de cartazes distribuídos em todo o Centro de Tecnologia da 
Universidade Federal do Rio de Janeiro (Anexo 3). 
Os critérios de exclusão dos voluntários no presente estudo foram: presença 
de doenças crônico degenerativas (diabetes mellitus, dislipidemias, hipertensão, 
câncer, insuficiência renal e doenças pulmonares), infecção urinária, tabagistas, 
participantes de outro estudo envolvendo a suplementação de alguma droga, 
gravidez e lactação (WHO, 2000; NCEP ATPIII, 2001; ADA, 2004). Todos os 
parâmetros de saúde supracitados foram comprovados através da apresentação 
de exames clínicos recentes (até 3 meses da realização dos mesmos). A infecção 
urinária foi avaliada através da presença de NO3
- na urina, utilizando tiras 
reagentes Uriquest Plus (Labtest). 
Todos os voluntários assinaram um termo de consentimento livre e 
esclarecido de acordo com as orientações institucionais e a Resolução n.°196/96 
do Conselho Nacional de Saúdeque informará a respeitos dos procedimentos 
experimentais e sobre os riscos inerentes ao estudo. 
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital 
Universitário Clementino Fraga Filho (protocolo # 23091313.0.0000.5257) do Rio 
de Janeiro, Brasil. 
 
4.2. Desenho experimental. 
Trata-se de um estudo randomizado, cruzado, duplo-cego e controlado por 
placebo, onde todos os voluntários realizaram 2 visitas ao Laboratório, com 
intervalo de 1 semana entre elas. Na primeira visita, ao chegarem ao laboratório, 
os voluntários permaneceram em repouso durante 10 minutos. Posteriormente, os 
voluntários responderam a um questionário (Anexo 4) onde relataram a presença 
 
34 
ou não das seguintes patologias: diabetes, hipertensão, câncer, doenças 
pulmonares, doenças renais e alergias alimentares. No mesmo questionário, os 
voluntários responderam também, se são praticantes regulares de exercício físico 
bem como a frequência, caso a resposta seja positiva e se fazem uso de alguma 
medicação ou suplementos de vitaminas e minerais (Sustagem®, ginseng, 
complexo B. Centrum®, Sundown®, Targifor C®, etc). E para voluntários do sexo 
feminino, assinalaram se estão em período gestacional ou de lactação. Foram 
também apresentados exames clínicos recentes. 
Os voluntários que atenderam aos critérios de inclusão do estudo, 
responderam também a um recordatório de 24 horas (Anexo 5) para verificar se 
houve restrição de alimentos ricos em NO3
- e NO2
- bem como o jejum estipulado 
até o momento das visitas. Amostras de urina foram coletadas para medida de 
base (T0). Após a coleta de urina, os voluntários foram submetidos a um dos dois 
tratamentos em dias diferentes e não consecutivos: (1) BET = 100 mL de suco da 
beterraba rico em NO3
- e (2) PLA = 100 mL de suco da beterraba reduzido em NO3
-
. Novas coletas de urina foram realizadas 30 (T30), 60 (T60), 90 (T90), 120 (T120), 
150 (T150) e 180 (T180) minutos após a ingestão de um dos tratamentos (Figura 
3). Todas essas etapas descritas acima foram realizadas em um ambiente tranquilo 
e com temperatura controlada. 
A escolha do volume do suco da beterraba utilizado no presente estudo foi 
baseada em evidências anteriores que demonstraram efeito positivo da ingestão de 
70 mL e 150 mL do suco da beterraba sobre parâmetros bioquímicos e 
hemodinânimos, respectivamente (Engan et al., 2012; Wylie et al., 2013; Kelly et 
al., 2013) Uma pessoa externa, não participante identificou de forma aleatória os 
rótulos dos tratamentos (BET e PLA) através de códigos (números). Esses 
números indicaram a ordem de chegada dos voluntários no laboratório (Ex.: o 
primeiro voluntário a chegar recebeu a embalagem de número 1, o segundo 
voluntários recebeu a embalagem de número 2 e assim sucessivamente). Os 
códigos foram entregues aos pesquisadores envolvidos somente no final do 
estudo. Foi providenciado um volume de 200 mL (1 copo pequeno) de água com 
 
35 
baixo teor de NO3
- para os voluntários beberem após cada coleta de urina durante 
o período do estudo. 
As 2 visitas foram realizadas no período de 07:00 às 10:00 horas e os 
voluntários foram avisados a realizarem jejum de pelo menos 11 horas antes das 
duas visitas (jejum + intervenção). Após o término de cada visita, todos os 
voluntários receberam um lanche contendo: café, leite, biscoito e fruta. 
 
Figura 3: Desenho experimental das intervenções para os voluntários 
selecionados. 
 
 
4.3. Controle dietético. 
No dia anterior as 2 visitas ao LAABBM/DBq/IQ/UFRJ, os voluntários foram 
orientados a restringir alimentos ricos em NO3
- e NO2
- da dieta. Foi distribuída uma 
lista com os alimentos a serem evitados em um período de 24h antes do início do 
 
36 
estudo (Anexo 6). O consumo de vegetais tais como: beterraba, espinafre, aipo, 
couve, abóbora, rúcula, alface e água mineral com gás, os quais contêm elevada 
concentração de NO3
-, além de carnes vermelhas (porco, cordeiro, carneiro e 
fígado), queijos maturados, embutidos e feijão que contém elevada concentração 
de NO2
- foram evitados. Também foi orientado aos voluntários não fazer uso de 
qualquer antisséptico bucal. 
 
4.4. Preparo dos sucos da beterraba. 
Beterrabas vermelhas (Beta vulgaris L) foram adquiridas de supermercados 
locais (localizados no Estado do Rio de Janeiro), higienizadas conforme 
recomendado pela ANVISA (MS, Resolução RDC nº 216, de 15/09/2004), sendo 
colocadas em um recipiente limpo, contendo 1 colher de sopa de água sanitária (a 
200 ppm de cloro ativo) em 1 litro de água, por 20 minutos. Após, as beterrabas 
foram cortadas em 4 cubos e pesadas. Cerca de 1 unidade média (~350g) foi 
liquidificada utilizando uma centrífuga de alimentos (modelo: CE 700, marca: Black 
& Decker). Esse suco da beterraba rico em NO3
- (BET) foi armazenado a -80º C 
imediatamente após o preparo. Também, foi realizado o preparo do suco da 
beterraba reduzido em NO3
- (PLA), onde 100 mL de suco da beterraba, após ser 
preparado, foi colocado em um pote ou cambuca estéril contendo 80 g da resina de 
troca iônica PUROLITE A-520E, que é seletiva para o ânion NO3
-, sob agitação por 
1 hora e a uma temperatura ambiente de 10° C. Após esse período, o suco de 
beterraba juntamente com a resina foi acondicionado em uma coluna de vidro 
(SIGMA) estéril, que estava acoplada a um quitassato estéril. Por meio de uma 
bomba a vácuo foi feita a eluição do suco da beterraba reduzido em NO3
- (placebo), 
que foi imediatamente transferido para uma garrafa estéril e armazenado a – 80° C 
(Figura 4). Portanto, o suco placebo foi uma bebida semelhante na textura, sabor, 
aparência e odor ao do suco da beterraba rico em NO3
-. 
A água com baixo teor de NO3
- oferecida aos voluntários após cada coleta de 
urina, foi preparada seguindo o mesmo procedimento que o suco placebo. A água 
foi colocada em um pote estéril contendo 50 g da resina de troca iônica PUROLITE 
 A-520E, que é seletiva para o ânion NO3
-, sob agitação por 30 minutos e a uma
 
37 
temperatura ambiente de 10° C. Todos os materiais utilizados para o preparo dos 
sucos foram lavados com álcool e posteriormente, com água destilada e 
deionizada (água D-D). A secagem foi feia em uma estufa a 100° C. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4: Preparo dos sucos BET e PLA. A: higienização das beterrabas em 
solução clorada por 20 minutos; B: centrífuga de alimentos (modelo: CE 700, 
marca: Black & Decker) utilizada para o preparo do suco; C: suco da beterraba 
em um erlenmeyer estéril contendo 80 g da resina de troca iônica PUROLITE A-
520E; D: suco da beterraba reduzido em NO3
- sendo eluido para um quitassato 
estéril por meio de um bomba à vácuo. 
A B 
C D 
 
38 
4.5. Análises cromatográficas. 
Os teores NO3
- e NO2
- foram quantificados através do método descrito por 
Alvares et al. (2012a e 2012b) com modificações. 
 
4.5.1. Preparo dos padrões. 
Foram realizados os preparos dos padrões de NO3
- (Fluka, Sigma Aldrich) e 
NO2
- (Fluka, Sigma Aldrich) nas concentrações 2; 1; 0,5; 0,25 e 0,125 µM. Os 
padrões não foram filtrados e diluídos após o preparo. 
 
4.5.2. Análise dos padrões e sucos da beterraba. 
As amostras do suco da beterraba foram filtradas (50 µL da amostra mais 450 
µL de H2O destilada e deionizada) através de ultrafiltros com ponto de corte em 10-
kDa (Vivaspin 2, GE Healthcare®) a 14.000g por 15 min. Posteriormente, as 
amostras foram diluídas na proporção de 1:10 para a análise de NO2
- e 1:200 para 
a análise de NO3
-. Assim, as amostras do suco da beterraba tiveram uma diluição 
total de um 1:100 e 1:2000 para a análise de NO2
- e NO3
-, respectivamente. 
Para a análise de NO3
-, cerca de 100 µL da amostra do suco da beterraba 
ultrafiltrado e diluído ou padrão de NO3
- (0-2 µM) foram transferidos para os vials. 
Foi realizada a conversão do NO3
- a NO2
- através da adição de 10 µL da enzima 
nitratoredutase (Aspergillus species, EC 1.6.6.2 - Roche Diagnostico, Mannheim, 
Alemanha) e 10 µL de 120 µM NADPH (Roche Diagnostico, Mannheim, Alemanha). 
As soluções foram incubadas em temperatura ambiente por um período de 1 h. 
Após a conversão de NO3
- a NO2
-, estas soluções foram utilizadas diretamente 
para a análise do NO2
-. 
Para a análise do NO2
-, cerca de 100 µL da amostra do suco da beterraba 
ultrafiltrado e diluído ou padrão de NO2
- (0-2 µM) foram transferidos também para 
os vails. Foi adicionado 10 µL de 316 µM de 2,3 - diaminonaftaleno (Sigma Aldrich), 
em 0,62 M de HCl, por 10 minutos. Em seguida, foi adicionado 5 µL de 2,8 M de 
hidróxido de sódio (Reagen, Ultrapure Chemicals do Brasil LTDA). Esta solução foi 
misturada e usada diretamente para a separação por cromatografia líquida de alta 
eficiência (CLAE). 
 
39 
O aparelho de CLAE (Shimadzu®), com injetor automático, foi equipado com 
uma coluna de 3.5 µm de fase reversa C18 Kromasil® (100 x 4,6 mm, I,D. 
Supelco®) protegida por uma coluna guarda de 5 µm de fase reversa C8 
Nucleosil® (1 x 4,6 mm, I.D. Supelco®) e um detector de fluorescência RF-10AXL 
(Shimadzu®). A fluorescência foi monitorada com excitação a 375 nm e emissão a 
415 nm. A separação ocorreu por gradiente de uma solução tampão de fosfato de 
sódio 15 mM (pH 7,5) e metanol com a taxa de fluxo de 1,3 mL/min. 
 
4.5.3. Análise da produção de NO (NO3
- e NO2
- urinário). 
As amostras de urina foram coletadas 24 horas após o período de restrição de 
NO3
- e NO2
- dietético e 11 horas após o jejum realizado pelos voluntários, por meio 
de coletores de urina universal estéril (J. PROLAB). Essas amostras foram 
armazenadas imediatamente em eppendorfs (2 mL) e a – 80ºC no 
LAABBM/DBq/IQ/UFRJ para posteriores análises. Determinação de NO3
- e NO2
- 
urinário foram utilizados como marcadores indiretos da produção de NO e foram 
avaliados também como descrito por Alvares et al. (2012a e 2012b). As amostras 
de urina foram filtradas (50 µL da amostra mais 450 µL de H2O destilada e 
deionizada) através de ultrafiltros com ponto de corte em 10-kDa (Vivaspin 2, GE 
Healthcare®) a 14.000g por 15 min. As amostras de urina tiveram uma diluição 
total de 1:10 e 1:2000 para a análise de NO2
- e NO3
-, respectivamente. Para a 
análise de NO3
- e NO2
- urinário, foram realizados os mesmos procedimentos 
descritos nos métodos para a análise de NO3
- e NO2
- nos sucos da beterraba (Ver 
o subtópico 4.5.2). 
As concentrações de NO3
- e NO2
- na urina foram corrigidas pela creatinina 
urinária, a qual foi determinada para todas as amostras de urina utilizando um 
analisador bioquímico semiautomático (Reflotron® Plus, ROCHE). 
 
4.6. Análise estatística. 
Foi realizada uma análise de variância one-way (ANOVA) com medidas 
repetidas para identificar as diferenças nos teores de NO3
- e NO2
- entre os sucos 
BET e PLA. 
 
40 
A significância estatística foi definida no nível de confiança de 0,05. Os resultados 
dos teores de NO3
- e NO2
- dos BET e PLA analisados foram convertidos de 
micromol/litro (µmol/L) para milimol (mmol) de NO3
- e NO2
- em 100 ml de suco da 
beterraba, a fim de fazer uma comparação com outros estudos publicados na 
literatura. 
Foi realizada também uma análise de variância two-way (ANOVA) 2 x 7 com 
medidas repetidas nos dois fatores (gênero x tempo) para identificar diferenças na 
variável produção de NO entre os gêneros (masculino x feminino) e o tempo da 
coleta de dados (T0, T30, T60, T90, T120, T150 e T180) antes e após a 
administração do suco BET e PLA. Foi realizado o teste de Bonferroni quando o F 
foi significativo. A significância estatística foi definida no nível de confiança de 0,05. 
Todas as análises foram realizadas utilizando um software disponível no mercado 
(IBM SPSS ® Statistics versão 20 para Windows, Chicago, IL, EUA). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
CAPÍTULO V 
RESULTADOS 
 
5.1. Características dos voluntários. 
Um total de 30 voluntários terminaram o estudo. As intervenções (BET e PLA) 
foram bem toleradas pelos voluntários. Foi relatado apenas coloração alterada na 
urina (urina avermelhada) somente durante o período do estudo (após a ingestão 
do suco BET e PLA). Tal condição é esperada em estudos desta natureza. A tabela 
1 mostra os parâmetros fisiológicos e bioquímicos avaliados nos sujeitos 
selecionados. 
Características Homens (n. 15) Mulheres (n. 15) 
Idade 26,7±6,4 29,1±5,1 
Peso 79,5±12,5 62,5±10,3 
Altura 1,77±0,07 1,63±0,06 
IMC (kg/m2) 25,8±2,8 24,9±9,7 
Tabagismo 0 0 
Prática de Atividade Física 7 4 
Doenças Crônicas 0 0 
Glicemia (jejum) 93,0±4,9 94,7±4,0 
Triglicerídeos 112,5±28,1 133,8±34,8 
Colesterol total 193,0±27,6 181,6±46,4 
LDL-c 110,4±20,1 109,0±19,1 
HDL-c 45,7±5,7 57,9±11,8 
Ureia 27,5±6,4 27,0±5,9 
Creatinina 0,9±0,1 0,8±0,1 
Ácido Úrico 3,8±0,5 3,2±0,7 
TGO 17,1±8,2 25,5±8,3 
TGP 23,3±11,3 27,7±4,0 
Infecção Urinária Negativo Negativo 
Tabela 1. Características fisiológicas e bioquímicas dos voluntários. Os valores são 
apresentados em media ± desvio padrão. IMC, Índice de Massa Corporal; LDL-c, 
lipoproteína de Baixa Densidade; HDL-c, Lipoproteína de Alta Densidade; TGO, 
Transaminase Glutâmico Oxalacética; TGP, Transaminase Glutâmico Pirúvica.
 
42 
5.2. Cromatogramas dos sucos BET e PLA. 
Os cromatogramas referentes à avaliação dos teores de NO3
- do suco BET e 
PLA estão descritos na figura 5. Os teores de NO3
- do suco BET foi de 3,33±0,080 
mmol e do suco PLA foi de 0,01±0,01 mmol em 100 mL. Os teores de NO2
- para 
os sucos BET e PLA foram insignificantes (dados não mostrados). 
 
 
 
 
 
Figura 5. Cromatogramas representativos dos teores de NO3
- do suco BET (A) e 
PLA (B). 2,3-Diaminonaftaleno (1); NO3
- (2) e NO2
- (3). BET = suco da beterraba 
rico em NO3
-; PLA = suco da beterraba reduzido em NO3
-. 
 
43 
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
200000
400000
600000
800000
E
Minutos
F
lu
or
es
cê
nc
ia
 (
m
V
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
100000
200000
300000
400000
Minutos
F
lu
or
es
cê
nc
ia
 (
m
V
)
5.3. Cromatogramas das análises urinárias de NO3
-. 
 A figura 6 mostram os cromatogramas das análises urinárias de NO3
- dos 
voluntários antes (T0) e 1 hora e 30 minutos (T90) após a ingestão dos sucos BET 
e PLA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Cromatogramas representativos das análises urinárias de NO3
- antes e 
após a ingestão dos sucos BET e PLA. (A) T0 e (B) T90 após ingestão de BET. (C) 
T0 e (D) T90 após a ingestão de PLA. T0 = basal; T90 = 1 hora e 30 min pós-
ingestão do suco; BET = suco da beterraba rico em NO3
-; PLA = suco da beterraba 
reduzido em NO3
-. 2,3-Diaminonaftaleno (1) e NO3
- (2). 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
50000
100000
150000
200000
250000
A
Minutos
F
lu
or
es
cê
nc
ia
 (
m
V
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
100000
200000
300000
A
Minutos
F
lu
or
es
cê
nc
ia
 (
m
V
)
A B 
C 
1 
2 
1 
2 
D 
1 
2 
1 
2 
 
44 
5.4. Cromatogramas das análises urinárias de NO2
-. 
 Os cromatogramas referentes às análises urinárias de NO2
- antes (T0) e 1 
hora e 30 minutos (T90) após a ingestão dos sucos BET e PLA são mostrados na 
figura 7. 
 
 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
100000
200000
300000
Minutos
F
lu
or
es
cê
nc
ia
 (
m
V
)
Figura 7. Cromatogramas representativos das análises urinárias de NO2
- antes e 
após a ingestão dos sucos BET e PLA. (A) T0 e (B) T90 após ingestão de BET. (C) 
T0 e (D) T90 após a ingestão de PLA. T0 = basal; T90 = 1 hora e 30 min pós-
ingestão do suco; BET = suco da beterraba rico em NO3
-; PLA = suco da 
beterraba reduzido em NO3
-. 2,3-Diaminonaftaleno (1) e NO2
- (3). 
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
100000
200000
300000
A
Minutos
F
lu
or
es
cê
n
ci
a 
(m
V
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
200000
400000
600000
D
Minutos
F
lu
or
es
cê
n
ci
a 
(m
V
)
B A 
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
100000
200000
300000
A
Minutos
F
luor
es
cê
nc
ia
 (
m
V
)
C D 
1 
3 
3 
1 
1 
3 
1 
3 
 
45 
5.5. Produção de NO. 
5.5.1. Concentração urinária de NO3
-. 
As concentrações urinárias de NO3
- antes e após a ingestão dos sucos BET 
(rico em NO3
-) e PLA (reduzido em NO3
-) estão descritas na Figura 5. Não foram 
observadas diferenças significativas nas concentrações urinárias de NO3
- antes da 
ingestão dos sucos BET (T0: 0,31±0,10 mmol/L) e PLA (T0: 0,33±0,06 mmol/L). 
Entretanto, após a ingestão do suco BET, houve um aumento significativo na 
concentração urinária de NO3
- no tempo T30: (1,04±0,36 mmol/L), atingindo um 
pico no tempo T90 (2,03±0,40 mmol/L). Foi observada uma redução significativa 
no tempo T120 (1,21±0,31 mmol/L). As concentrações urinárias de NO3
-
permaneceram reduzidas até o final do estudo (T150: 1,05±0,31 mmol/L e T180: 
0,79±0,42 mmol/L). Não foi observada diferença significativa na concentração 
urinária de NO3
- após a ingestão do suco PLA ao longo do período do estudo (T30: 
0,44±0,07 mmol/L; T60: 0,51±0,07 mmol/L; T90: 0,50±0,10 mmol/L; T120: 
0,53±0,08 mmol/L; T150: 0,52±0,08 mmol/L e T180: 0,50±0,12 mmol/L). 
T0 T30 T60 T90 T120 T150 T180
0
1
2
3
BET
PLA
*, *, #
#
#
#
#
#*,
*, *, *,
Tempo (min)
N
O
3-
u
ri
ná
ri
o
(m
m
o
l/L
) 
/ m
m
o
l c
re
at
in
in
a
Figura 8. Concentração urinária de NO3
- antes e após a ingestão do suco BET e 
PLA. T0 = basal; BET = suco da beterraba rico em NO3
-; PLA = suco da beterraba 
reduzido em NO3
-. O símbolo * (P<0,001) indica diferença significativa em relação 
ao T0; O símbolo # (P<0,001) indica diferença significativa em relação ao PLA. 
Valores estão expressos em médias ± desvio padrão. 
 
46 
5.5.2. Concentração urinária de NO2
-. 
As concentrações urinárias de NO2
- antes e após a ingestão dos sucos BET 
(rico em NO3
-) e PLA (reduzido em NO3
-) estão apresentadas na Figura 6. Não 
foram observadas também diferenças significativas nas concentrações urinárias de 
NO2
- antes da ingestão dos sucos BET (T0: 0,006±0,001 mmol/L) e PLA (T0: 
0,003±0,001 mmol/L). Não ocorreu também alteração significativa na concentração 
urinária de NO2
- após a ingestão do suco PLA (T30: 0,003±0,001 mmol/L; T60: 
0,003±0,001 mmol/L; T90: 0,004±0,001 mmol/L; T120: 0,004±0,001 mmol/L; T150: 
0,004±0,001 mmol/L e T180: 0,004±0,001 mmol/L). Após a ingestão do suco BET, 
houve um aumento não significativo na concentração urinária de NO2
- no tempo 
T30 (0,011±0,03 mmol/L), mas foi observado um aumento significativo no tempo 
T60 (0,028±0,017 mmol/L), atingindo um pico no tempo T90 (0,45±0,038 mmol/L). 
A concentração urinária de NO2
- permaneceu elevada até o final do estudo (T120: 
0,043±0,059 mmol/L; T150: 0,034±0,023 mmol/L; 180 min: 0,030±0,015 mmol/L). 
T0 T30 T60 T90 T120 T150 T180
0.00
0.05
0.10
0.15
BET
PLA
#
#
# #
#
*
*
*,
**
**
Tempo (min)
N
O
2-
u
ri
ná
ri
o
(m
m
o
l/
L)
 / 
m
m
o
l 
cr
ea
ti
n
in
a
 
Figura 9. Concentração urinária de NO2
- antes e após a ingestão de suco BET 
e PLA. T0 = basal; BET = suco da beterraba rico em NO3
-; PLA = suco da 
beterraba reduzido em NO3
-. O símbolo * (P<0,001) indica diferença 
significativa em relação ao T0; O símbolo ** (P<0,001) indica diferença 
significativa em relação ao T30. O símbolo # (P<0,001) indica diferença 
significativa em relação ao PLA. Valores estão expressos em médias ± desvio 
padrão. 
 
 
47 
5.6. Diferença da produção de NO entre os gêneros. 
5.6.1 Concentrações urinárias de NO3
- entre os gêneros. 
As concentrações urinárias de NO3
- entre os voluntários de ambos os 
gêneros após a ingestão do suco BET são mostrados na Figura 7. As 
concentrações de NO3
- urinário na linha de base foram semelhantes entre os 
gêneros masculino e feminino (T0: 0,33±0,09 mmol/L e 0,30±0,10 mmol/L, 
respectivamente). Foi observado um rápido aumento, na mesma proporção 
para ambos os gêneros masculino e feminino no tempo T30 (1,04±0,28 
mmol/L e 1,04±0,38 mmol/L, respectivamente) da ingestão do suco BET. O 
pico das concentrações urinárias de NO3
- ocorreram no tempo T60 para o 
gênero masculino (2,16±0,40 mmol/L) e feminino (2,03±0,27 mmol/L). Não 
foram observadas diferenças significativas entre as concentrações urinárias de 
NO3
- dos voluntários masculino e feminino após o tempo T90 da ingestão do 
suco BET (T90: 2,09±0,34 mmol/L e 1,96±0,60 mmol/L; T120: 1,22±0,16 
mmol/L e 1,20±0,21 mmol/L; T150: 1,03±0,30 mmol/L e 1,05±0,37 mmol/L; 
T180: 0,82±0,59 mmol/L e 0,74±0,14 mmol/L, respectivamente). 
T0 T30 T60 T90 T120 T150 T180
0
1
2
3
M
F
Tempo (min)
*
** *
N
O
3-
ur
in
ár
io
(m
m
ol
/L
) 
/ m
m
ol
 d
e 
cr
ea
ti
ni
na
Figura 10. Diferença entre os gêneros das concentrações de NO3
- urinário 
após a administração de suco BET. M = masculino; F = feminino. O símbolo * 
(P<0,01) indica diferença significativa em relação ao T0 dos gêneros 
masculino e feminino. Valores estão expressos em médias ± desvio padrão.
 
48 
5.6.2 Concentrações urinárias de NO2
- entre os gêneros. 
As concentrações urinárias de NO2
- entre os voluntários de ambos os 
gêneros após a ingestão do suco BET são mostrados na Figura 8. As 
concentrações urinárias de NO2
- foram semelhantes na linha de base e no 
tempo T30 para os gêneros masculino e feminino (T0: 0,006±0,001 mmol/L e 
0,007±0,002 mmol/L; T30: 0,01±0,001 mmol/L e 0,02±0,002 mmol/L, 
respectivamente). Foi observado um aumento significativo no tempo T60, 
atingindo um pico urinário no tempo T90 para os gêneros masculino e feminino 
(T60: 0,05±0,011 mmol/L e 0,058±0,003 mmol/L; T90: 0,076±0,033 mmol/L e 
0,085±0,011 mmol/L, respectivamente). A concentração urinária de NO2
- 
permaneceu elevada até o final do estudo para ambos os gêneros, masculino 
e feminino (T120: 0,072±0,024 mmol/L e 0,074±0,014 mmol/L; T150: 
0,055±0,013 mmol/L e 0,059±0,010 mmol/L; T180: 0,041±0,023 mmol/L e 
0,046±0,011 mmol/L, respectivamente). 
T0 T30 T60 T90 T120 T150 T180
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
M
F
Tempo (min)
*
*
*
*
*
**
****
**
* *
N
O
2
-
u
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(m
m
o
l/L
) /
 m
m
o
l d
e 
cr
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tin
in
a
Figura 11. Diferença entre os gêneros das concentrações de NO2
- urinário após a 
administração de suco BET. M = masculino; F = feminino. O símbolo * (P<0,01) 
indica diferença significativa em relação ao T0 dos gêneros masculino e feminino; 
O símbolo ** (P<0,01) indica diferença significativa em relação ao T30 do gênero 
feminino. Valores estão expressos em médias ± desvio padrão. 
 
49 
CAPÍTULO VI 
DISCUSSÃO 
O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar os efeitos da 
ingestão do suco da beterraba (100 mL) sobre a síntese de NO (avaliado 
indiretamente pelos marcadores NO3
- e NO2
- urinário) em adultos saudáveis de 
ambos os gêneros. Através da análise de NO3
- e NO2
- por CLAE, utilizando um 
injetor automático (melhorando a precisão, diminuindo o risco de contaminação 
com outras substâncias na preparação e análises das amostras, e no 
aparecimento de “ruídos” no cromatograma) foi possível determinar as 
concentrações urinárias corretas desses ânions. 
A suplementação aguda de 100 mL do suco da beterraba (contendo 
3,33±0,080 mmol de NO3
-) aumentou as concentrações urinárias dos marcadores 
da produção de NO (NO2
- e NO3
-). Enquanto o aumento da concentração urinária 
de NO3
- após a ingestão do suco BET ocorreu em T30, a concentração urinária de 
NO2
- aumentou significativamente em T60. Houve uma redução da concentração 
urinária de NO3
- em T120. Entretanto, a concentração urinária de NO2
- permaneceu 
significativamente elevada até o final do estudo. Após a ingestão de 100 mL do 
suco placebo, não foram observados alterações nas concentrações urinárias de 
NO3
- e NO2
-. 
Os resultados da produção de NO observados no presente estudo 
demonstram que não ocorreram diferenças significativas nas concentrações 
urinárias de NO3
- e NO2
- na linha de base e por todo o período de estudo