Filipe-Kayode

•

UFRJ

Aprendendo na Universidade

10/01/2023

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FILIPE KAYODÈ FELISBERTO DOS SANTOS

DETERMINAÇÃO DOS TEORES DE BIXINA E ANÁLISE DA ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA E ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS DAS SEMENTES
DE DUAS VARIEDADES DE URUCUM (Bixa Orellana L.) EM DIFERENTES
TEMPERATURAS DE ESTOCAGEM

RIO DE JANEIRO
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE QUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
ii
Filipe Kayodè Felisberto dos Santos

Determinação dos teores de bixina e análise da atividade antimicrobiana e antioxidante
dos extratos das sementes de duas variedades de urucum (Bixa orellana l.) em diferentes
temperaturas de estocagem

Dissertação de mestrado apresentada ao
programa de Pós-graduação em Ciência de
Alimentos da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos para
obtenção do grau de Mestre em Ciências.
Orientadores: Joab Trajano Silva
Vânia Margaret Flosi Paschoalin
Rio de Janeiro
2013
iii

Santos, Filipe Kayodè Felisberto dos
Determinação dos teores de bixina e análise da atividade antimicrobiana e
antioxidante dos extratos das sementes de duas variedades de urucum (Bixa
orellana l.) em diferentes temperaturas de estocagem
- Rio de Janeiro, 2013. 96 f

Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) - Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Instituto de Química, 2013.
Orientadores: Joab Trajano Silva e Vânia M. F. Paschoalin
1.corante natural. 2. teores de bixina. 3. armazenamento. I. Silva, Joab
Trajano. (orient.). II. Paschoalin, Vânia Margareth Flosi (coorient.). III.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química. Programa de Pós-
graduação em Ciência de Alimentos. III. Título.
iv
FILIPE KAYODÈ FELISBERTO DOS SANTOS

Orientadores: Joab Trajano Silva e Vânia M. F. Paschoalin

Dissertação de mestrado apresentada ao programa de Pós-graduação em Ciência de
Alimentos da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos para
obtenção do grau de Mestre em Ciências.
Aprovado em: _____ de Maio de 2013.

Banca Examinadora

__________________________________________________
Joab Trajano Silva
Instituto de Química
Universidade Federal do Rio de Janeiro

________________________________________________
Tiyoko Nair Hojo Rebouças
Departamento de Fitotecnia e Zootecnia
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia

___________________________________________________
Maria Helena Miguez da Rocha Leão
Escola de Química
Universidade Federal do Rio de Janeiro

v
AGRADECIMENTOS

À Deus, pois sem Ele nada disso teria acontecido;
Aos meus pais e irmãos, por estarem sempre ao meu lado me apoiando;
Aos meus orientadores Joab T. Silva e Vânia M. F. Paschoalin pela paciência e por me
acompanharem e me incentivarem nestes dois anos de mestrado;
Aos amigos de laboratório (Eduardo Mere, Laidson Paes, Cyntia Freitas, Patrícia
Ribeiro, Luciana Golinelli, Karine Hojo, Wilson Rodrigues, Claudius Cabral, Raphael
Leonardo, Claudio Sabbatini, Thiago Alvares, Diego Baião, Ana Carolina, Raquel
Casaes e Ricardo Brettas) pelas horas de descontração, pelos almoços, pela companhia,
pela amizade e pela ajuda que me foi dada com os equipamentos e na realização dos
experimentos na bancada;
Ao secretario mais profissional e amigo Rafael Luiz pelo auxilio com a parte
burocrática, e pelos filmes e séries disponibilizados;
À professora Tiyoko Nair Hojo Rebouças (UESB) por colaborar nesta pesquisa e não
poupar esforços para que os ensaios físico-químicos fossem realizados;
Aos demais docentes do programa de Pós Graduação em Ciência de Alimentos
(PPGCAL) pelas disciplinas ministradas durante o curso;
À pesquisadora Ana Carolina Carvalho (UFRJ/IMPG) que me ensinou novas técnicas e
esteve sempre disponível para me ajudar e conversar sobre minhas dúvidas.

vi
RESUMO

Orientadores: Joab Trajano Silva e Vânia M. F. Paschoalin
Resumo da dissertação de mestrado apresentada ao programa de Pós-graduação
em Ciência de Alimentos da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências.

Bixina é o principal corante do fruto do urucum (Bixa orellana L.) sendo responsável
por mais de 80% dos carotenoides totais, cujas sementes vêm despertando interesse de
indústrias de produtos cosméticos, farmacêuticos e, principalmente de alimentos, tendo
em vista a crescente proibição da utilização de corantes sintéticos e também pelo seu
poder antioxidante. O teor de bixina sofre influência de fatores externos como
manipulação, temperatura, umidade e luminosidade, causando uma perda significativa
dos teores deste carotenoide durante o período de armazenamento. O objetivo deste
estudo foi avaliar os níveis de bixina das sementes de urucum das variedades Peruana
Paulista e Embrapa 37 armazenadas em diferentes temperaturas, avaliando sua atividade
antimicrobiana e antioxidante, utilizando técnicas de cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), determinação da concentração mínima inibitória (CMI) e testes
fotocolimétricos (utilizando o radical estável DPPH). Ambas as cultivares mostraram
decaimento dos teores de bixina após os 90 dias de armazenamento, sendo a cultivar
Peruana Paulista a 4°± 1ºC com a maior perda: 19,71% (de 2,74% para 2,2%) contra
uma diferença de 19,11% (de 4,92% para 3,98%) da cultivar Embrapa 37 na mesma
condição, quando avaliados o início e o término da análise. A avaliação da concentração
mínima inibitória mostrou que houve inibição do crescimento pela bixina purificada
apenas pelo cultivar Embrapa 37 para o microrganismo L. Monocytogenes Foi
observada atividade bacteriana com o uso do extrato bruto seco, que foram obtidos das
linhagens Embrapa 37 e Peruana Paulista, para as cepas de S. aureus L. monocytogenes,
P. aeruginosa, B. Cereus, B. subtilis e P. mirabilis. Entretanto, a cultivar Peruana
Paulista inibiu os agentes L. monocytogenes e P. aeruginosa. Na avaliação do sequestro
de radicais livres a bixina apresentou níveis elevados em ambas às variedades, sendo a
cultivar Embrapa 37 a 4°C com 54 µmoles de BHT, contra 40 e 38 µmoles de BHT, a
4°C e 25°C respectivamente para a cultivar Peruana Paulista.
Palavras-chave: corante natural, teores de bixina, armazenamento .

Rio de Janeiro
2013

vii

ABSTRACT

DETERMINATION THE LEVELS OF BIXIN AND ANTIOXIDANT ACTIVITY
AND ANTIMICROBIAL OF SEED OF TWO VARIETIES ANNATTO (Bixa orellana
L.) IN DIFFERENT STORAGE TEMPERATURES
Filipe Kayodè Felisberto dos Santos

Bixin is the main product of the colorant annatto (Bixa orellana L.) accounting for over
80% of the total carotenoids, whose seeds have attracted interest of industry of
cosmetics, pharmaceuticals, especially of foods, with a view to increasing prohibition
the use of synthetic dyes and also for its antioxidant power. The bixin is influenced by
external factors such as handling, temperature, humidity and light, causing a significant
loss of this carotenoid levels during the storage period. The aim of this study was to
evaluate the levels of bixin from annatto seeds of varieties Peruvian Paulista Embrapa
37 and stored at different temperatures, evaluating their antioxidant and antimicrobial
activity, using techniques of high performance liquid chromatography (HPLC)
determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and fotocolimetrics tests
(using the stable radical DPPH). Both cultivars showed decay of bixin levels after 90
days of storage, and to cultivar Peruana Paulista at 4° ± 1°C with the greatest loss:
19.71% (2.74% to 2.2%) against a difference of 19.11% (from 4.92% to 3.98%) cultivar
Embrapa 37 in the same condition, when evaluated the onset and end of the analysis.
The minimum inhibitory concentration analysis showed that there was inhibition of
growth by bixin purified only by cultivating the microorganism for Embrapa 37 L.
Monocytogenes. Bactericidal activity was observed with the use of crude dry extract,
which were obtained from strains Embrapa 37 and Peruana Paulista, to the strains of S.
aureus L. monocytogenes, P. aeruginosa, B. Cereus, B. subtilis and P. mirabilis.
However, the cultivar Peruana Paulista agents inhibited L. monocytogenes and P.
aeruginosa. In the evaluation of scavenging free radicals to bixin showed high levels in
both varieties, and the Embrapa 37 4°C with 54 µmols of BHT,, from 40 to 38 µmoles
of BHT, at 4°C and 25°C respectively for cultivating Peruana Paulista.

Keywords: natural dye, levels of bixin, storage.

Rio de Janeiro
2013

viii
SUMÁRIO

Lista de figuras........................................................................................................... p. xi
Lista de tabelas........................................................................................................... p. xii
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos..................................................................... p. xiii
Resumo....................................................................................................................... p. vi
Abstract...................................................................................................................... p. vii

1 INTRODUÇÃO............................................................................................ p. 15
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................. p. 18

2.1 Classificação e características do urucuzeiro......................................... p. 18

2.1.1 Classificação das sementes de urucum............................................ p. 20

2.1.1.1 Composição química das sementes de urucum.......................... p. 21

2.2 Propriedades antimicrobianas de plantas............................................... p. 22

2.2.1 Atividade antimicrobiana do urucum............................................... p. 24

2.2.2 Cultivares de urucum....................................................................... p. 25

2.3 Mercado do urucum no Brasil................................................................ p. 26

2.4 Carotenoides........................................................................................... p. 26

2.4.1 Atividade antioxidante dos carotenoides......................................... p. 27

2.5 Extração e diferenciação de carotenoides.............................................. p. 29

2.6 Bixina..................................................................................................... p. 29

2.6.1 Capacidade antioxidante da bixina.................................................. p. 30

2.6.2 Métodos para quantificação de bixina em sementes de urucum...... p. 32

2.6.3 Estabilidade da bixina....................................................................... p. 32

2.6.4 Oxidação da bixina: oxigênio e radicais livres................................ p. 32
ix

2.6.5 Efeito da temperatura sobre a estabilidade da bixina....................... p. 33

2.7 Corantes naturais e legislação.................................................................

p. 35

2.8 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)............................... p. 36

2.9 Concentração Mínima Inibitória (CMI) e os métodos para avaliação de
atividade antimicrobiana............................................................................. p. 36

2.10 Determinação da capacidade antioxidante da bixina pelo método
DPPH.............................................................................................................. p. 38
3 OBJETIVOS................................................................................................ p. 40

3.1 Objetivo geral.......................................................................................... p. 40

3.1.1 Objetivos específicos........................................................................ p. 40
4 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ p. 41

4.1 Obtenção das amostras............................................................................ p. 41

4.2 Preparo das amostras............................................................................... p. 41

4.3 Extração da bixina................................................................................... p. 41

4.4 Determinação do teor de bixina.............................................................. p. 42

4.5 Caracterização da bixina por espectrometria de infravermelho (FTIR).. p. 42

4.6 Purificação da bixina para utilização como padrão................................. p. 43

4.7 Separação da bixina por CLAE............................................................... p. 43

4.8 Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro dos extratos de B.
orellana L...................................................................................................... p. 43

4.8.1 Preparo do material microbiológico.................................................. p. 44

4.8.2 Avaliação preliminar - Método de difusão em ágar.......................... p. 44

4.8.3 Determinação da CMI....................................................................... p. 45
4.9 Atividade antioxidante pelo método DPPH............................................ p. 45

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ p. 47

5.1 Espectros no infravermelho (FTIR) do extrato bruto de sementes de
x

urucum........................................................................................................... p. 47

5.2 Determinação dos teores de bixina em sementes de urucum por
espectrofotometria......................................................................................... p. 49

5.3 Verificação dos padrões de bixina por CLAE......................................... p. 50

5.4 Avaliação do teor de bixina por CLAE................................................... p. 52

5.5 Atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar..................... p. 59

5.6 CMI das estirpes bacterianas................................................................... p. 61

5.7 Avaliação da atividade antioxidante (DPPH).........................................p. 62
6 CONCLUSÃO.............................................................................................. p. 65
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... p. 67
8 ANEXOS....................................................................................................... p. 79
xi
LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Bixa orellana L............................................................................... p. 18
Figura 2. Flor de Bixa orellana L................................................................... p. 19
Figura 3. Frutos de Bixa orellana L............................................................... p. 19
Figura 4. Cápsula de Bixa orellana L............................................................. p. 20
Figura 5.
Número de publicações indexadas sobre atividade antimicrobiana
ao redor do mundo na última década.............................................. p. 23
Figura 6.
Número de publicações indexadas sobre atividade antimicrobiana
por região do mundo na última década........................................... p. 24
Figura 7. Estruturas moleculares do isopeno, β-ionona e do licopeno.......... p. 27
Figura 8. Reações de carotenoides e radicais livres....................................... p. 28
Figura 9. Estrutura química da bixina............................................................ p. 29
Figura 10. Estabilidade do radical livre DPPH................................................. p. 39
Figura 11.
Representação esquemática do processo de extração das
sementes........................................................................................... p. 42
Figura 12. Espectro na região do infravermelho da cultivar Embrapa 37........ p. 48
Figura 13. Espectro na região do infravermelho da cultivar Peruana Paulista. p. 48
Figura 14. Cromatograma das diferentes concentrações do padrão de bixina.. p. 51
Figura 15.
Curva padrão da bixina elaborado em CLAE usando detector de
arranjo de diodos............................................................................. p. 51
Figura 16.
Cromatogramas dos extratos das cultivares Embrapa 37 e Peruana
Paulista durante 90 dias de armazenamento..................................... p. 57
Figura 17.
Ensaios em Placas de Petri para avaliação de atividade
antimicrobiana................................................................................... p. 60
Figura 18.
Curva de calibração do BHT (µmoles) por porcentagem de
sequestro de radicais livres (%SRL).................................................
p. 63
Figura 19.
Avaliação da atividade antioxidante das cultivares de urucum,
bixina e extratos brutos, utilizando o método de sequestro de
radicais DPPH................................................................................... p. 63

xii
LISTA DE TABELAS

Tabela I Características físico-químicas das sementes de urucum................ p. 21
Tabela II Diferentes concentrações das amostras utilizadas no ensaio........... p. 45
Tabela III
Determinação dos teores de bixina em sementes de urucum ao
longo do armazenamento por 90 dias a 4° e 25°C...........................
p. 49
Tabela IV
Concentração de bixina nos extratos das cultivares ao final dos 90
dias de armazenamento.................................................................... p. 58
Tabela V
Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana de extratos de B.
orellana L. pelo método de difusão em ágar...................................
p. 59
Tabela VI
Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) de
extrato bruto de B. orellana L.......................................................... p. 61

xiii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS.

Aam Decaimento da absorbância das amostras
AAPH 2,2'-azobis-amidinopropano
Ac Decaimento da absorbância do controle
ADI Acceptable Daily Intake (Consumo diário aceitável)
AH Antioxidante
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC
American Type Culture Collection (Coleção americana de tipos
de culturas)
BHA butil hidroxianisol
BHT butil hidroxitolueno
CAR Carotenoide
CCA Cromatografia de Coluna Aberta
CCD Cromatografia de Camada Delgada
CI Color Index
CMB Concentração Mínima Bactericida
CMI Concentração Mínima Inibitória
CMH Caldo Muller Hinton
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CNTP Condições Normais de Temperatura e Pressão
COX Enzima ciclogenase
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico

Densidade óptica

xiv
DPPH 2,2–Difenil–1–picril–hidrazila

EEC
European Economic Community (Comunidade Econômica
Europeia)
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
ERO Espécie Reativa de Oxigênio
FAO
Food and Agriculture Organization (Organização das Nações
Unidas para Agricultura e Alimentação)
FTIR
Fourier Transform Infrared Radiation (Espectroscopia de
infravermelho por transformada de Fourier)
IAL Instituto Adolfo Lutz
JECFA
Joint Expert Commitee on Food Additives (Comitê conjunto de
peritos em aditivos alimentares)
NCCLS
National Committee for Clinical Laboratory Standards
(Comitê nacional para padrões clínicos de laboratório)
OMS Organização Mundial da Saúde
SRL Sequestro de radicais livres
Trx Tioredoxina
TrxR Tioredoxina redutase
UESB Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
UV-Vis Espectroscopia no ultravioleta visível
15

1 INTRODUÇÃO
Compostos naturais de origem mineral, animal ou vegetal são usados desde longa data
como ingredientes na fabricação de produtos alimentícios, cosméticos e medicamentos,
havendo registros escritos da utilização desses produtos pelas civilizações egípcias e
chinesas antigas, datados de milhares de anos atrás.
Bixa orellana L. é um arbusto que recebeu este nome em homenagem a Francisco de
Orellana, o primeiro botânico e explorador a estudá-lo. O nome popular urucum deriva
do vocábulo tupi uru-ku, que significa amarelo. No Brasil, esta planta também é
conhecida como urucum-uva, urucu-bravo, açafrão e bixa, e por nomes indígenas como
aluitê, nukirê, bixe e bichá. Entretanto, devido a sua ampla distribuição geográfica, ela
possui mais de 50 nomes populares duferentes (ANGELUCCI, ARIMA & KUMAGAI,
1980; CARVALHO & HEIN, 1989). Na América espanhola, a planta é conhecida como
achiote, anoto, achote, anoto, onotillo, roekoe, schirabaeli, koessewee, koesowe, bija,
cacicuto, uruca, achiotillo, arnotto, arnolta, roucou, chancaguarica, kuxub, achihuiti,
achiti, shambu, huantra, atta, santo domingo, analto e guajachote. Na Espanha é
conhecido como bija; na França como roucouyere. Na Alemanha como Orleansbaum.
Na Itália, Inglaterra e Estados Unidos como annatto, em Angola como kisafu e diteque,
e na Índia como lathau ou kolsewil (SANCHEZ, 1965). Tem-se conhecimento que os
índios do Brasil, do México, Peru e Porto Rico, untavam-se com seu óleo e sementes
para participar de ritos cerimoniais, além de usar essa mistura como camuflagem, que os
protegia de picadas de insetos e do sol (ALONSO, 2004).
O urucum é empregado com frequência na culinária asiática, africana e europeia,
introduzido pelos espanhóis, que foram os responsáveis pela expansão do consumo
deste produto pelo mundo, resultando no aumento de sua produção já no século XIX
(SANDI et al., 2003). Atualmente, o urucum é uma importante fonte de matéria-prima
para a indústria de alimentos, com um consumo de cerca de 1,5 milhão de litros/ano do
corante líquido hidrossolúvel (norbixina), usados, por exemplo, pela indústria de massas
(cerca de 500 mil litros/ano), lacticínios, principalmente de queijo, (200 mil litros/ano),
e pela indústria de sorvetes e confeitarias (cerca de 120 mil litros/ano), com a estimativa
do consumo adicional de 2,8 t/ano de bixina e norbixina por outras indústrias dealimentos (FRANCO, 2006).
16
Apesar de usado há muitos séculos como corante pelos índios, seu uso comercial vem
aumentando continuamente em função das exigências do mercado por produtos
saudáveis, da crescente divulgação quanto aos efeitos nocivos dos corantes sintéticos, e
da proibição pela legislação de diversos países do uso de determinados corantes
artificiais em alimentos e cosméticos (SÃO JOSÉ, 2006). Corantes a base de urucum
representam cerca de 70% do mercado mundial de corantes naturais empregados na
indústria de alimentos. O Brasil foi o responsável por cerca de 40% da produção
mundial de sementes de urucum em 1999, com cerca de 60% das sementes destinadas à
produção de colorífico, 15% para fabricação de corantes e 25% para exportação in
natura, principalmente para Estados Unidos, Inglaterra, França e Japão (CARVALHO,
1999).
Os processos em uso no Brasil para a extração do pigmento do urucum a partir da
camada externa das sementes de Bixa orellana L. baseiam-se na extração mecânica e/ou
com óleos vegetais, para a produção de extratos lipossolúveis; com soluções alcalinas,
para a produção do extrato hidrossolúvel; ou ainda com o uso de solventes orgânicos
(acetona, etanol, hexano, propilenoglicol e clorofórmio), para produção do corante na
forma de pasta ou em pó, após a eliminação do solvente. O pigmento extraído consiste
basicamente de bixina, um carotenoide que representa mais de 80% dos carotenoides
totais das sementes, a partir da qual são obtidos os demais pigmentos de urucum, como
norbixina, sal de norbixina e produtos de degradação térmica (TOCCHINI &
MERCADANTE, 2001; BARETH, STROHMAR & KITZELMANN, 2002; KOUL,
KOUL & TIKOO, 2003; BAUTISTA et al., 2004). A existência de formulações
lipossolúvel e hidrossolúvel do corante do urucum faz com que ele possa ser aplicado
em grande número de produtos alimentícios. Com vantagem adicional, este corante
apresenta maior estabilidade quando comparado a outros corantes naturais, tem
coloração atrativa e sua cultua é abundante tanto nas regiões tropicais da América do
Sul, como também da Índia e África (SILVA e STRINGHETA, 2005).
Os extratos de urucum apresentam diversas propriedades bioativas, devido à presença
da bixina e norbixina, como capacidade antioxidantes contra espécies reativas de
oxigênio e nitrogênio (BOBBIO, 2001; SILVA et al., 2001; KURNIAWATI et al.,
2007; CHISTÉ et al., 2011; TSURUMA et al., 2012), atividade antimieloma (REDDY
et al., 2005; TIBODEAU et al., 2010) e antimicrobiana (FREIXA et al., 1998;
17
FLEISCHERA et al., 2003; KURNIAWATI et al., 2007; TAMIL SELVI et al., 2011),
demonstrando a capacidade preservativa desta planta na conservação e em agregar
propriedades nutracêuticas aos alimentos (GONÇALVES, 2005; FLEISCHER et al.,
2003).
Neste estudo, os teores de bixina das sementes de dois cultivares de urucum (Peruana
Paulista e Embrapa 37) foram quantificados por absorção em =470nm e por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE/HPLC). A estabilidade da bixina nas
sementes destes dois cultivares foi monitorada durante o armazenamento por até 90 dias
em diferentes temperaturas (4°C e 25°C) e sem luminosidade. Foi investigada a
capacidade antimicrobiana deste pigmento com base na determinação de sua
concentração mínima inibitório em diferentes espécies de bactérias e também a
capacidade antioxidante da bixina e dos extratos de urucum foram determinadas por
ensaio com o radical 2,2 difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) (SANCHEZ-MORENO,
1998; SILVA, et al. 1999),

18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Classificação e características do urucuzeiro
O urucuzeiro (família Bixaceae, gênero Bixa) é uma árvore pequena, com altura
geralmente inferior a 6 metros, mas podendo atingir até 8 metros, com diâmetro na base
do caule de 15 a 20 cm. A planta apresenta uma copa ampla, com muitas ramificações.
O tronco é reto e de casca lisa, íntegra, de coloração cinza-clara. As folhas são simples e
alternadas (Figura 1). São ricas em glândulas coloridas não visíveis a olho nu. As flores
são grandes, ornamentais, hermafroditas, de coloração rósea e branca, de 3 a 5 cm de
diâmetro (Figura 2), que aparecem em cachos contendo de 3 a mais de 20 flores que
surgem nas extremidades dos ramos. Os frutos são cápsulas ovoides (conhecidos
também como cachopas), achatadas, ovaladas, hemisféricas elipsoides ou cônicas,
contendo numerosas sementes, rodeadas de uma polpa mole e vermelha. As cápsulas
abrem-se em duas partes iguais e sua cor varia desde castanho-escuro ou avermelhado
até verde ou amarelo-pálido, de acordo com a variedade da planta (Figuras 3 e 4). São
densamente cobertos por espinhos flexíveis e possuem, em média, 54 sementes que
contém o pigmento (FRANCO et al., 2002).

Figura 1. Bixa orellana L. Disponível em: <http://www.botanicalgarden.ubc.ca/potd/2009/11/
bixa_orellana.php>. Acesso em: 09/01/2013
19

Figura 2: Flor de Bixa orellana L. Disponível em: <http://commons.wikimedia.org/wiki/
File:Bixa_orellana_flower.jpg>. Acesso em: 09/01/2013

Figura 3: Frutos de Bixa orellana L. Disponível em: <http://commons.wikimedia.org/wiki/
File:Ricado_belize.jpg>. Acesso em: 09/01/2013.
20

Figura 4: Cápsula de Bixa orellana L. Disponível em: <http://commons.wikimedia.org/wiki/
File:Bixa_orellana_fruit_open.jpg>. Acesso em: 09/01/2013.
O ponto de colheita do urucum influi na qualidade final do produto. O maior teor de
bixina ocorre no momento em que os frutos estão maduros e oferecem resistência aos
dedos quando apalpados. Normalmente, colhem-se os cachos com frutos maduros e
secos (OLIVEIRA et al., 1996). No Nordeste e Centro Sul do Brasil a colheita é
realizada aproximadamente aos 130 dias após a abertura da flor, quando é possível
verificar a porcentagem das cápsulas secas. No Norte, esse período é reduzido para 60 a
80 dias. Na região Nordeste, a primeira colheita, a mais significativa, ocorre nos meses
de junho e julho, enquanto que a segunda, conhecida como safrinha, realiza-se no
período novembro a dezembro (FRANCO et al, 2002).
2.1.1 Classificação das sementes de urucum
As sementes de urucum podem ser classificadas em três tipos (Tabela 1), de acordo com
seu teor de umidade, teor de bixina, odor, presença de material estranho e mofo ou
bolor. As sementes classificadas como tipo três são consideradas fora dos padrões
exigidos para que possam ser comercializadas (FRANCO et al., 2002).

21
Tabela I: Características físico-químicas das sementes de urucum.
Especificação
Classe
Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3
Umidade ≤ 10% > 10 a 14% > 14%
Teor de Bixina > 2,5% 2 a 2,5% < 1,8%
Impurezas < 5% < 5% < 5%
Material estranho Nenhuma Nenhuma Nenhuma
Fonte: Urucuzeiro: Agronegócio de Corantes Naturais. FRANCO et al., (2002).

2.1.1.1 Composição química das sementes de urucum
Na literatura especializada são encontradas muitas informações sobre a composição
química da semente, raiz e folhas do urucum. Contudo, devido a diferentes procedências
das plantas, métodos analíticos empregados, ou a instabilidade apresentada por alguns
de seus componentes, os percentuais variam bastante. A semente bruta apresenta como
composição típica 40-45% de celulose, 3,5-5,5% de açúcares, 0,3-0,9% de óleo
essencial, 3% de óleo fixo, 1,0-4,5% de pigmento, 13-16% de proteína, além de alfa e
beta caroteno, taninos e saponinas. Entre os ácidos graxos presentes na fração lipídica
são encontrados principalmente o ácido linolênico, α-linoléico e oléico. Possui ainda
10,6% de aminoácidos e seis dos oito aminoácidos essenciais contemplados no padrão
ideal da OMS. As cinzas (5,4%) apresentaram alto conteúdo de fósforo, ferro e zinco,
com reduzido teor de cálcio (GLEW et al., 1997).
A coloração avermelhada doarilo da semente de urucum é dada principalmente pela
presença da bixina, que representa mais de 80% do conteúdo de carotenoides do arilo da
semente. Entretanto, outros carotenoides também estão presentes, como a norbixina, β-
caroteno, criptoxantina, luteína, zeaxantina e metilbixina (TIRIMANNA, 1981;
HALLAGAN et al., 1995; MERCADANTE et al., 1999), com numerosos outros
pigmentos presentes em menor quantidade, incluindo seis apocarotenoides (C30 e C32),
oito diapocarotenoides (C19, C22, C24, e C25) e um derivado de carotenoide (C14)
(MERCADANTE et al., 1999), além do pigmento orellina, hidrossolúvel e de cor
amarela. O extrato da semente de urucum também é uma rica fonte de terpenos, como o
E,E,E-geranilgeraniol, e outros isoprenóides, como farnesilacetona, geranilgeranil
octadecanoato, geranilgeranil formato, δ-tocotrienol e flavanóides como luteolina e
22
apigenina (JONDIKO & PATTENDEN, 1989; FREGA et al., 1998; PINO &
CORREA, 2003).
A análise química das folhas de B. orellana demonstrou a presença de flavonoides
bissulfatados apigenina-7-bissulfato, luteolina-7-bissulfato e hipoaletina-8-bisulfato
(HARBORNE, 1975), esteróis, taninas e saponinas (SHILPI et al., 2006) e de um óleo
essencial contendo principalmente os sesquiterpenos ishwarano e bixageneno
(LAWRENCE & HOGG, 1973). Em outro estudo, realizado com extrato de folhas secas
com diclorometano, foram isolados os compostos ishwarano, fitol, poliprenol,
estigmasterol e sitosterol (RAGA et al., 2011). As raízes contém o triterpeno ácido
tomentosico (SCHNEIDER et al., 1965). Bixaganeno, bixeina, bixol, crocetina, ácido
ellagico, isobixina, ácido salicílico e ácido tomentosico também foram encontrados na
composição do corante (VENUGOPALAN et al., 2011).
2.2 Propriedades antimicrobianas de plantas
Existem vários registros históricos sobre a utilização das plantas para tratamento de
doenças desde 4.000 a.C. O primeiro registro médico depositado no Museu da
Pensilvânia é datado de 2.100 a.C. e inclui uma coleção de fórmulas de trinta diferentes
drogas de origem vegetal, animal ou mineral (HELFAND et al., 1990). O manuscrito
Egípcio “Ebers Papirus” (1.500 a.C.), contém 811 prescrições e 700 drogas e o primeiro
texto chinês sobre plantas medicinais (500 a.C.) relata nomes, doses e indicações de uso
de plantas para tratamento de doenças. Algumas dessas plantas ainda são utilizadas,
como Ginseng (Panax spp), Ephedra spp, Cassia spp e Rheum palmatum L., inclusive
como fontes para indústrias farmacêuticas.
As propriedades antimicrobianas de substâncias presentes em extratos e óleos essenciais
produzidos pelas plantas como uma consequência do metabolismo secundário, também
são reconhecidas empiricamente há séculos e foram comprovadas cientificamente
apenas recentemente (JANSEN et al., 1987). Estudos sobre as atividades
antimicrobianas de extratos e óleos essenciais de plantas nativas têm sido relatados em
muitos países tais como Brasil, Cuba, Índia, México e Jordânia, que possuem uma flora
diversificada e uma rica tradição na utilização de plantas medicinais para uso como
antibacteriano ou antifúngico. (MARTÍNEZ et al., 1996; NAVARRO et al., 1996;
AHMAD & BEG, 2001; MAHASNEH et al., 1999; DUARTE et al., 2005).
23
Recentemente, vários grupos de pesquisadores de diferentes países têm estudado a
inibição de C. albicans por extratos, óleos essenciais e substâncias isoladas de plantas.
Em muitos países tais como Índia, África e países da América Latina, as maiorias dos
trabalhos iniciam a partir de um levantamento etnofarmacológico, que identifica as
espécies usadas mais frequentemente pela população. Alguns países da América Latina
mantêm programas de triagem de produtos naturais para atividade antimicrobiana, como
é o caso de Cuba (MARTÍNEZ et al., 1996), Honduras (LENTZ et al., 1998) México
(NAVARRO et al., 1996; ROJAS et al., 2001) e Brasil (SARTORATTO et al., 2004; )
(DUARTE et al., 2005). As pesquisas sobre investigação de produtos naturais ativos
contra microrganismos aumentaram significativamente nos últimos anos, conforme
apresentado na Figura 5,
Figura 5: Número de publicações indexadas sobre atividade antimicrobiana ao redor do mundo
na última década. Disponível em:
</http://www.multiciencia.unicamp.br/artigos_07/a_05_7.pdf>.

Muitas plantas dos biomas brasileiros, tais como o cerrado, a floresta amazônica e a
mata atlântica têm sido utilizadas como fármacos naturais pelas populações locais no
tratamento de várias doenças tropicais, incluindo esquistossomose, leishmaniose,
malária e infecções fúngicas e bacterianas. Além disso, muitas plantas exóticas foram
introduzidas no Brasil desde a colonização e incorporadas na medicina popular. No
Brasil, a investigação sobre produtos naturais com atividade antimicrobiana também
aumentou significativamente nos últimos anos (Figura 6). Entretanto, apesar da rica
biodiversidade, somente estão disponíveis dados sobre 44 espécies de plantas
24
pertencentes a 20 famílias, com atividade positiva, incluindo espécies nativas e exóticas.
O baixo número de registros pode ser consequência da disseminação restrita dos
resultados de pesquisa, geralmente apresentados em eventos científicos locais ou
regionais. Além disso, a maioria dos estudos são testes isolados com uma ou poucas
espécies, geralmente baseados em informações etnofarmacológicas, diferentemente de
pesquisas que abrangem a flora de uma região definida, onde várias famílias botânicas
são estudadas.

Figura 6: Número de publicações indexadas sobre atividade antimicrobiana por região do
mundo na última década. (NA= América do Norte; LA = América Latina (Brasil em branco);
AF = África; EU = Europa; AS = Ásia e OC = Oceania). Disponível em:
</http://www.multiciencia.unicamp.br/artigos_07/a_05_7.pdf>.

2.2.1 Atividade antimicrobiana do urucum
Diversos estudos vêm sendo realizados para avaliar a capacidade antimicrobiana dos
compostos do urucum. Testes realizados por IROBI (1996), utilizando extrato de folhas
de Bixa orellana L. apresentou significativa ação antibacteriana, principalmente frente á
bactérias Gram positivas (Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis). GONÇALVES
(2005), utilizando um extrato alcoólico de urucum apresentou atividade antimicrobiana
contra Streptococcus pyogens, Proteus mirabilis e Staphylococcus aureus, confirmando
o seu uso na terapia popular. Outros estudos demonstraram efeito inibidor do extrato de
Bixa orellana sobre Bacillus cereus, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus
em concentrações de 0,08, 0,31 e 0,16% (v/v) respectivamente. Em concentrações de
25
0,63 % (v/v) a bixina inibe o crescimento de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus
casei subsp. casei, Lactococcus lactis e Paenibacillus polymyxa. As concentrações para
inibição do crescimento de Listeria monocytogenes e Enterococcus durans foram de
1,25 e 2,5% (v/v), respectivamente. Também foi detectada atividade contra Neisseria
gonorrhoeae, Trichomona vaginalis, Enterococcus. faecalis e Cryptococcus
neoformans (Concentração Mínima Inibitória de 0,078 mg/ml). Entretanto, nestes
estudos não foi encontrada atividade inibitória sobre o crescimento de Lactobacillus
plantarum, Bifidobacterium bifidum, levaduras e algunas bacterias Gram negativas
(IROBI, 1996; CASTELLO et al., 2002; GALINDO-CUSPINERA et al., 2003;
FLEISCHER et al., 2003).
2.2.2 Cultivares de urucum
No Brasil são cultivadas diversas variedades de urucum. A variedade Bico de pato foi a
primeira a ser introduzida na Bahia. Apresenta porte alto, medindo 2,28 m em média de
altura e folhas de coloração verde intenso. A cultivar Peruana paulista, desenvolvida
pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) é a mais cultivada no
Brasil (FRANCO, 2002). Entretanto, o genótipo Piave é reconhecido como a de melhor
atributo em função da produção de corante e rendimento, sendo a maisusada pelas
indústrias de corantes líquidos. Cultivar com características de porte baixo, com altura
média em torno de 1,68 m e apresenta baixo teor de bixina (1,75%). A cultivar Casca
vermelha possui porte alto, medindo em torno de 2,05 m de altura, apresentando uma
superfície de tamanho médio de folhas de aproximadamente 127,53 cm
2
com coloração
verde clara e dispõe de um bom teor de bixina, em torno de 2,68%. A cultivar Casca
verde é um cultivar predominante do Estado da Paraíba. Tem como características o
porte alto, medindo 2,14 m de altura em média e bom aspecto agronômico. Apresenta
bom teor de bixina 2,94% (FRANCO et al., 2002). Um novo cultivar, Embrapa-37,
apresenta plantas de porte médio (1,54 m de altura), com copa compacta e hemisférica,
com tendência a crescimento lateral e ramos próximos ao solo. O teor de bixina, neste
cultivar, fica em torno de 5,0% a 5,5% (EMBRAPA, 2001).

26
2.3 Mercado de urucum no Brasil
Em 1999 a produção brasileira de grãos de urucum situava-se, em torno de 10.000 a
12.000 t/ano, sendo que desse total, 60% eram destinados à fabricação de
colorau/colorífico, 30% à fabricação de corantes e 10% à exportação. Em 2000, foi
estimado em 1.200 t o consumo de colorífico no Brasil, principalmente na região
Nordeste ou em áreas de maior concentração de imigrantes nordestinos. Para o segmento
de condimentos, especiarias e temperos, o colorífico representa 44,6%, seguido da
pimenta-do-reino com 35,4%, a canela 4,1%, o cominho 4,0% e 11,9% para a pimenta
com cominho, bicarbonato, orégano, louro, erva doce, cravo, camomila e outros
(FRANCO, 2006). Entre as principais indústrias de corantes que utilizam o urucum como
matéria prima destacando-se Christian Hansen, IFF, Firace, Quest, Baculerê
Agroindustrial, Biocon, Kienast & Kratschmer, Adicon, Liotécnica, Refinações de Milho
Brasil (São Braz) e Penina.
O mercado do urucum no Brasil tem sofrido importantes oscilações decorrentes da oferta
e da procura. Nos anos de 1990, 1991 e 1992, os preços pagos aos produtores variaram de
US$ 0,70 a 1,00/kg de grãos. A partir de 1999 os preços voltaram a subir, devido à queda
na produção, pois alguns produtores abandonaram suas áreas ou dispensaram menores
investimentos no cultivo, desestimulados pelos preços baixos e dificuldades na
comercialização nos anos anteriores. O aumento de preço foi consequência da menor
oferta do produto e do aumento da procura pela indústria de corantes e agroindústria de
colorau e colorífico, estimado em cerca de 5% ao ano. Nas safras de 1999, 2000 e 2001
os preços voltaram a estimular os produtores, que têm recebido entre US$ 0,80 a 1,00/kg
de grãos (FRANCO, 2006).
2.4 Carotenoides
Constituem um dos mais importantes grupos de corantes naturais e são encontrados em
todas as plantas e animais, com uma produção natural estimada de 100 milhões de
toneladas/ano (ISLER, 1971). WACHERNRODER, em 1981, isolou o β-caroteno a
partir de cenouras, e deu o nome de caroteno aos cristais obtidos (HGUES, 1994).
BERZELIUS, em 1837, extraiu pigmentos mais polares de folhas coletadas no outono,
dando o nome de xantofilas aos pigmentos de cor amarela que foram isolados.
RICHARD WILLSTATTER, em 1907, estabeleceu a fórmula empírica dos
27
carotenoides e TSWETT, em 1911, usando técnicas de cromatografia, separou vários
pigmentos que ele coletivamente chamou de carotenoides (JOHNSON, 2007).
Estes pigmentos naturais são classificados em carotenos (hidrocarbonetos) e xantofilas
(derivados oxigenados). A estrutura básica reflete sua biossíntese e consiste de oito
unidades isoprenóides colocadas de forma que os dois grupos metila laterais mais
próximos do centro da molécula separados um dos outros por quatro átomos de
carbono, enquanto que todos os outros grupos metilas estão separados por três átomos
de carbono. Uma série de ligações duplas conjugadas constitui o grupo cromóforo
característico. A estrutura acíclica básica C40 pode ser modificada por hidrogenação,
desidrogenação, ciclização ou oxidação (BRITTON, 1976; DAVIES, 1976).
A maioria destes corantes possui três grupamentos metilas substituindo posições dos
anéis ciclo-hexenila encontrados nas extremidades da cadeia poliênica, similar à
configuração cíclica da β-ionona (Figura 7). O γ-caroteno, a capxantina e o licopeno são
exceções, os dois primeiros carotenoides possuem apenas um anel em uma das
extremidades da cadeia, e o licopeno é acíclico (VILELA, 1976).

Figura 7: Estruturas moleculares do isopeno, β-ionona e do licopeno RIBEIRO &
SERAVALLI, 2004.
2.4.1 Atividade antioxidante dos carotenoides
Os carotenos apresentam propriedades antioxidantes, por terem a capacidade de reagir
com o oxigênio singleto, uma forma reativa do oxigênio molecular que apresenta dois
elétrons de spins opostos ocupando o mesmo orbital (tempo de vida relativamente
28
longo) ou orbitais diferentes (tempo de vida extremamente curto) (RONSEIN et al.,
2006). Os carotenoides protegem as células de danos oxidativos provocados por radicais
livres e por espécies reativas de oxigênio (ERO) que podem ser gerados no citoplasma,
nas mitocôndrias ou na membrana, atacando lipídios, proteínas, carboidratos e DNA
(SHAMI & MOREIRA, 2004). Assim, os carotenoides desempenham um papel
bastante importante na prevenção de doenças associadas ao processo de estresse
oxidativo, como o câncer, arteriosclerose, catarata e retardo do processo de
envelhecimento (RIBEIRO & SERAVALLI, 2004).
A proteção antioxidante é fornecida pelos carotenoides acíclicos com nove ou mais
duplas ligações conjugadas. O licopeno, por exemplo, é mais eficaz do que o β-
caroteno, pois possui onze duplas ligações, enquanto que o β-caroteno, com om mesmo
número de carbonos, possui nove ligações conjugadas devido à presença dos anéis em
ambas as extremidades da molécula (DI MASCIO et al, 1989; MC BRIDE, 1996). Os
carotenoides são capazes de sequestrar ERO’s, como o radical peroxila e o oxigênio
singleto (FOOTE et al., 1970), estabilizando o elétron desemparelhado do radical por
ressonância, neutralizando, desta forma, as espécies altamente reativas (BURTUN &
INGOLD, 1984). Em ordem crescente de capacidade de sequestrar o oxigênio singleto
estão o licopeno, astaxantina/cantaxantina, β-caroteno/bixina, luteína e crocina
(FONTANA et al., 2000).
Os carotenoides ao combaterem as espécies reativas de oxigênio, podem interagir de
três maneiras distintas: (1) transferências de elétrons, (2) remoção de íons de hidrogênio
ou (3) adição de espécies radiculares (Figura 8).

Figura 8: Reações de carotenoides e radicais livres. ROO (radical peroxila) e CAR
(carotenoide) (YOUNG & LOWE, 2001).

29
2.5 Extração e diferenciação de carotenoides
A eficiência de extração dos carotenoides varia com o solvente utilizado e o tipo de
amostra. MERCADANTE (1999), conclui que a acetona é eficiente na extração de
carotenoides em alimentos in natura, o acetato de etila em alimentos liofilizados ou
secos, sendo que alimentos desidratados requerem inicialmente a reidratação.
A separação dos carotenoides pode ser realizada por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), utilizando colunas de sílica gel, C18 e C30; cromatografia de coluna
aberta (CCA), com matriz de sílica gel ou óxido de alumínio, de acordo com a
polaridade dos compostos presentes na mistura; cromatografia de camada delgada
(CDD), que tem como vantagem a capacidade de analisar várias amostras
simultaneamente, mas devido a maior superfície de contato dos carotenoides, aumentam
as perdas por oxidação e isomerização (MERCADANTE et al., 1997; SANDER et al.,
1994).
2.6 Bixina
A bixina é o principal carotenoide encontrado nas sementes do urucum. Trata-se de um
éster monometílico de um ácido dicarboxílico com cadeia isopropênica de 24 carbonos,
que possui nove ligações duplas conjugadas, sendo uma delas na configuraçãocis
(Figura 9) (LUNDE & ZECHMEISTER, 1955). A bixina pode sofrer saponificação
formando a norbixina, um corante hidrossolúvel (COSTA & CHAVES, 2005).

Figura 9. Estrutura química da bixina.
A bixina foi isolada inicialmente por BOUSSINGAULT (1825). Cristalizada por ETTI
(1878), sua estrutura elementar foi descrita por HEIDUSCHKA & PANZER (1917) e
sua fórmula estrutural foi proposta por KUNH e colaboradores (1933), sendo
confirmada pela síntese total da per-hidronorbixina (KARRER & JUCKER, 1950).
30
Historicamente, a bixina foi o primeiro carotenoide em que o isomerismo geométrico
foi encontrado, uma vez que a bixina (e também a norbixina) podem existir nas
configurações cis e trans (JONDIKO & PATTEENDEN, 1989; PIMENTEL, 1995).
É solúvel em clorofórmio, acetona, éter etílico e etanol, possui máximos de absorbância
a 439nm, 470nm e 501nm em clorofórmio; e a 526nm, 431nm e 457nm em dissulfeto
de carbono, tendo como coeficiente de extinção à 470nm o valor de 2826 (solução de
bixina pura 10mg/mL em CHCL3). Seu ponto de fusão é de 198ºC, possui coloração
amarela em extrato diluído e vermelha escura em extrato concentrado. É instável a luz e
a temperatura acima de 125ºC. A bixina é indexada no Color Index como CI nº 75120 e
pela Comunidade Europeia como EEC nº E160b e CI Natural Color 4 (MARMION,
1991).
2.6.1 Capacidade antioxidante da bixina
Antioxidantes são substâncias que, em concentrações inferiores aos substratos
oxidáveis, retardam ou previnem a oxidação destes substratos (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 1999). Avaliações experimentais têm demonstrado a capacidade dos
carotenoides do urucum de atuarem também como antioxidante (GARCIA et al., 2012).
A extensa cadeia de duplas ligações presente na molécula dos carotenoides induz
variações de distribuição eletrônica que permitem a adição de radicais livres aos
carbonos adjacentes às insaturações, conferindo uma maior reatividade dessas
moléculas frente a agentes oxidantes, sobretudo derivados oxigenados. Em condições de
baixa pressão parcial de oxigênio, o radical carotenoide que foi formado reage
preferencialmente com radicais peroxilas gerando produtos inativos (BURTON, 1989;
KIOKIAS & GORDON, 2003).
A capacidade antioxidante da bixina, luteína, licopeno, β-caroteno e γ-tocoferol foram
avaliadas por HAILA et al., (1996), que mostrou que a bixina possui destacado efeito
antioxidante, reduzindo a formação de hidroperóxidos em triacilglicerídeos oxidados
pela luz. KIOKIAS & OREOPOULOU (2006) também avaliaram individualmente o
extrato de urucum, β-caroteno, luteína e licopeno quanto a suas capacidades de inibir a
formação de hidroperóxidos em uma emulsão aquosa, cuja oxidação foi estimulada pelo
uso do 2,2'-azobis-amidinopropano (AAPH). Nesse experimento, o extrato de urucum
superou as demais substâncias naturais, apresentando a maior atividade antioxidante.
31
O corante hidrossolúvel do urucum (composto principalmente por norbixina) foi
descrito como tendo maior capacidade antioxidante do que o butilhidroxianisol (BHA)
ou butilhidroxitolueno (BHT) na prevenção da modificação da desoxirribose por
radicais hidroxilas (MARTINEZ-TOMÉ et al., 2001). O corante exibiu uma menor
atividade antioxidante do que o propilgalato em solução aquosa, mas foi mais efetivo do
que BHA ou BHT na eliminação de radicais livres (MARTINEZ-TOMÉ et al., 2001).
A bixina é capaz de eliminar radicais hidroxilas gerados por íons ferrosos (Fe2
+
) e
peróxido de hidrogênio (H2O2). Entretanto, o mecanismo pelo qual a reação se processa
ainda é desconhecido (ZHAO et al., 1998). A atividade antioxidante da norbixina sobre
a proteção in vitro a plasmídeo de DNA contra os danos induzidos por espécies reativas
de oxigênio geradas por Fe2
+
, Sn2
+
na presença de H2O2 foi atribuída, em parte, à
capacidade dos dois grupamentos carboxílicos da molécula formar complexo com os
metais (KOVARY et al., 2001). A norbixina apresentou maior afinidade por Sn2
+
do
que Fe2
+
, mas ambos os metais foram deslocados do complexo com a norbixina por
EDTA.
O tratamento com cisplatina produz sérios efeitos colaterais. Em ratos Wistar, uma
única dose de cisplatina (5,0 mg x kg
−1
de massa corporal) aumentou a formação de
peróxidos de lipídeos em 29% e diminuiu em 29% os níveis de glutationas renal após 24
horas da administração intraperitoneal desta droga. O pré-tratamento com bixina (5,0
mg x kg
−1
de massa corporal) reduziu o número total de aberrações cromossômicas,
inibiu o aumento da peroxidação lipídica e a redução da glutationas renal induzida pela
cisplatina (SILVA et al., 2001).
A bixina possui ação hipolipidêmica, demonstrada em ratos (PAULA et al., 2009), e atua
na prevenção da aterosclerose, possivelmente por inibição da oxidação da lipoproteína
LDL (LIMA et al., 2003). A bixina, além de não ser tóxica, pode apresentar efeito
protetor contra dano cromossomal induzido por irradiação gama em ratos
(THERESIAMMA & GEORGE, 1998).
Estudos demonstraram moderado efeito inibidor contra as enzimas ciclooxigenases
(COX-1 e COX-2) e foi capaz de inibir o crescimento in vitro de células tumorais,
principalmente do câncer de pulmão (REDDY et al., 2005). O efeito anticâncer da
bixina foi confirmado em um estudo que mostrou que a administração de cis-bixina
32
induz o acúmulo de espécies reativas de oxigênio em células tumorais por meio da
inibição das enzimas tioredoxina (Trx) e tioredoxina redutase (TrxR1) em
concentrações comparáveis as que foram necessárias para induzir citotoxidade
(TIBODEAU et al., 2010)
2.6.2 Métodos para quantificação de bixina em sementes de urucum
O conteúdo de bixina das sementes de urucum está associado diretamente com as
condições ambientais e genéticas, podendo variar entre 1 e 6% (FRANCO et al., 2002).
O conteúdo de bixina pode ser determinado pelo método descrito por MCKEOWN &
MARK (1962), que envolve extrações repetidas das sementes com clorofórmio. O
volume total do extrato é medido e o conteúdo do pigmento calculado com base na
absorção de luz do extrato no comprimento de onda de 501nm. A conversão em teor de
bixina é realizada com o uso do coeficiente de absorção de uma solução de bixina a 1%
(2826). O método que utiliza a extração por KOH diluído (FRANCO et al., 2002)
representa um método de fácil operacionalização e baixo custo. Estes dois métodos
foram recomendados pelo Instituto Adolfo Lutz em São Paulo, para quantificação de
bixina em urucum, e enviados ao Ministério da Agricultura (MAPA), para apreciação e
validação. A recomendação ocorreu após um painel com especialistas que analisaram e
discutiram quatorze métodos distintos.
2.6.3 Estabilidade da bixina
A instabilidade dos carotenoides (isto é, a sua susceptibilidade em sofrer oxidação por
vários agentes, como oxigênio e peróxidos; reações de adição de eletrófilos, incluindo
H
+
e ácidos de Lewis; e isomerização cis/trans) pode ser atribuída, em grande parte, à
presença da cadeia poliênica e é influenciada por fatores como exposição ao ar, luz e
temperatura (SCOTTER, 2009). A bixina quando em solução em óleo vegetal e outros
solventes sofre uma série de reações de isomerização e de degradação em temperaturas
normais de extração (IVERSEN & LAM, 1983).
2.6.4 Oxidação da bixina: oxigênio e radicais livres
A bixina e norbixina são susceptíveis à oxidação tanto durante o armazenamento
(particularmente sob a forma de pós) quanto após a incorporação em alimentos.
Algumas matrizes alimentares apresentam enfeito estabilizante (SCOTTER, 2009), mas
33
já foi reportado que a norbixina seca pela técnica de spray-dry junto com goma acaia ou
maltodextrina apresenta sensibilidade aumentada à oxidação (HENRY, 1992).
A bixina armazenada a 30°C em embalagens com diferentes taxas de transferência de
oxigênio apresentou uma redução de aproximadamente 10% de seu teor após as três
primeiras semanas, se mantendo, daípor diante, estável por até um ano. A exceção
ocorreu com a bixina armazenada em embalagem de polietileno, que exibiu uma taxa de
degradação constante de 0,04% por dia, possivelmente devido a permeabilidade do
polietileno ao oxigênio (CARVALHO et al., 1993).
A atividade da água influencia na taxa de oxidação da bixina que seguiu uma cinética de
primeira ordem, com meia-vida aumentada em sistemas com média ou alta atividade de
água. Este efeito foi postulado como sendo devido à capacidade da água de excluir o
oxigênio de materiais lipossolúveis por adsorção à superfície, por formar pontes de
hidrogênio com hidroperóxidos, por inativar catalisadores metálicos e diminuir a
estabilidade do oxigênio singlete (GLORIA et al., 1995),
O corante lipossolúvel de urucum, extraído com óleo, foi mais estável do que a
formulação em pó durante o armazenamento por 1 ano em garrafas com headspace de 3
cm de ar. Uma maior perda (60%) foi observada com a formulação em pó estocada a
temperatura ambiente e exposta a luz do dia do que com a formulação mantida no
escuro (54%) ou com a que foi mantida a 5-8°C no escuro (23%) (NAJAR et al., 1988).
Estudos sobre a isomerização fotoinduzida da cis-bixina mostraram que a bixina no
estado fundamental é estável à isomerização térmica. Entretanto, a transferência de
energia por fotossensibiliação dá origem ao estado triplete de alta energia (
3
BIX*),
precursor que prontamente isomeriza para formar trans-bixina (Montenegro et al.,
2004). A taxa de isomerização é dependente de diversos fatores que competem pela
desativação de
3
BIX*. Produtos primários de degradação só são observados na presença
de ar e iluminação prolongada, devido à formação de produtos de oxidação com o
oxigênio singleto (
1
O2).
2.6.5 Efeito da temperatura sobre a estabilidade da bixina
A bixina e a norbixina possuem boa estabilidade térmica durante o processamento de
alimentos, comparado com outros carotenoides. Entretanto, a 9'-cis-bixina sofre uma
34
série de reações de degradação complexas em condições de extração comerciais que
levam a produção de uma série de compostos coloridos (LEVY & RIVADENEIRA,
2000). Por cromatografia em papel, os pigmentos presentes na preparação de corante de
urucum comerciais foram separados em uma série de bandas coloridas, que incluíam
certo número de compostos de coloração amarela, compreendendo aproximadamente
40% dos pigmentos totais, e um composto com alta fluorescência no amarelo
(MCKEOWN, 1961).
O principal produto de degradação térmica da 9'-cis-bixina foi isolado e identificado
usando cromatografia em papel e espectrometria UV/VIS como sendo o monometil
éster do ácido 4,8-dimetiltetradecahexaenodióico - C17 (MCKEOWN, 1965;
PRESTON & RICKARD, 1980). Estudos posteriores confirmaram que C17 se
apresenta predominantemente na forma isomérica trans, e que a isomerização da bixina
para a conformação cis é um pré-requisito para a sua formação (SCOTTER, 1995). Este
composto, entretanto, pode sofrer isomerização para formar em solução uma pequena
quantidade do isômero cis, que é susceptível a hidrólise para formar uma variedade de
compostos.
Para estudar a cinética e rendimento da reação de degradação do corante do urucum, a
estabilidade térmica da bixina foi estudada em solução alcoólica submetida à fervura
(SCOTTER et al., 2001). A taxa de desaparecimento de 9'-cis-bixina e a formação de
di-cis-bixina, trans-bixina e do produto de degradação C17 foi avaliado por CLAE
usando detector de arranjo de diodo. A perda de linearidade foi observada ao redor de 2
horas de reação, sugerindo que duas ou mais reações competitivas estavam ocorrendo
em diferentes velocidades.
Um estudo cinético mais detalhado da degradação térmica da bixina em um modelo
aquoso composto por água e etanol (8:2) foi realizado, com detecção do
desaparecimento da desaparecimento de 9'-cis-bixina e a formação de di-cis-bixina,
trans-bixina e do produto de degradação C17 foi avaliado por CLAE (RIOS et al.,
2005). As taxas de reações se ajustaram a um modelo biexponencial. Os isômeros da di-
cis- bixina foram formados imediatamente (energia de ativação de 63 kJ.mol
-1
). Os
isômeros da di-cis-bixina podem reverter prontamente a 9'-cis-bixina (13 kJ.mol
-1
) ou
formar o produto primário de degradação C17, com alto requerimento energético (27
35
kJ.mol
-1
). Entretanto, a isomerização de 9'-cis-bixina a trans-bixina requer cerca de 100
kJ.mol
-1
, explicando a sua lenta formação.
O efeito da luz (intensidade de 9000 lux) sobre a estabilidade da bixina
microencapsulada e da bixina purificada foi acompanhado por um period de 30 dias por
meio da perda da absorbância a 470nm (PRENTICE-HERNÁNDEZ & RUSIG, 1999).
A degradação da bixina microencapsulada foi de 0.05% por dia, comparada a taxa de
0.11% por dia do extrato purificado.
2.7 Corantes naturais e legislação
A cor natural dos alimentos pode sofrer alterações durante o processamento,
conservação e transporte. Aditivos geralmente são empregados para permitir que estes
alimentos tenham aparência desejável e sejam seguros para a comercialização
(DELGADO-VARGAS et al., 2000). O uso de corantes naturais nos alimentos está
ligado às suas características físico-químicas: solubilidade, resistência ao tratamento
térmico, estabilidade na presença da luz e ao meio ácido ou alcalino. Desta forma, é
importante a escolha entre pigmentos (corantes) hidrossolúvel ou lipossolúvel, e que
apresentem resistência durante e/ou após o tratamento térmico (GUIRALDINI, 1996;
MAIMON, 2000). As indústrias brasileiras se destacam na produção dos corantes
naturais. Os mais produzidos são o urucum, o carmim e a cúrcuma. Dentre os sintéticos
semelhantes aos naturais, destaca-se o beta caroteno (MASCARENHAS et al., 1999).
O primeiro decreto da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) sobre a
utilização de corantes foi o de 24 de janeiro de 1961, que dispôs sobre normas técnicas
especiais do emprego de aditivos químicos a alimentos, alterado pelo Decreto 691, de
13 de março de 1962 e modificado pelo Decreto 55871, de 26 de março de 1965. Desde
1988, portarias e resoluções vem sendo publicadas e periodicamente revisadas,
regulamentado, dentre outros aditivos alimentares, o uso de corante de urucum,
estabelecendo seus limites máximos para as diversas categorias de alimentos.
Em evento da FAO em 2006, foi determinado o ADI (Acceptable Daily Intake ou
Consumo Diário Aceitável, em português) de bixina (JECFA, 2006) de 0,12 mg/Kg de
massa corporal, aplicável aos seguintes extratos de urucum desde que esses extratos
satisfaçam as respectivas especificações, tais como: bixina extraída com solvente (≥
85% bixina, ≤ 2,5% norbixina) e bixina obtida por processo aquoso (≥ 25% bixina, ≤
36
7% norbixina). Este ADI não se aplica à bixina obtida por processo oleoso (≥ 10%
bixina).
2.8 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
O uso da CLAE tem se mostrado bastante satisfatório para a identificação e
quantificação de pigmentos orgânicos, graças ao seu poder de separação e sua
capacidade de detectar limites muito baixos destes compostos (1 a 5 ppm), com valores
de recuperação na ordem de 95% (GOLDBER & CALVEV, 1982). Com um tempo de
análise muito curto, em comparação ao requerido pelas técnicas tradicionais (SINGH,
1982), a sua aplicação na separação e identificação dos corantes naturais e artificiais
tem aumentado nos últimos anos (SINGH, 1982; LOVE, 1984).
A CLAE é, atualmente, uma das principais técnicas para análise de corantes em
alimentos (PRADO et al., 2003). TOCCHINI & MERCADANTE (2001) determinaram
por CLAE os teores de bixina e norbixina em coloríficos. RIOS & MERCADANTE
(2002) quantificaram por CLAE corantes de urucum em salgadinhos extrusados.
BARETH et al., (2002) desenvolveram um método rápido e simples para detecção do
corante de urucum em queijos e outros produtos derivadosde leite, utilizando CLAE.
SCOTTER et al., (1998), ao analisarem formulações diversas de corantes de urucum,
utilizaram CLAE acoplada a detector de arranjo de diodos, tendo como fase móvel uma
mistura de acetonitrila: ácido acético 0,4% (65:35). SCOTTER (1995) e SCOTTER et
al., (2001) utilizaram as mesmas condições cromatográficas anteriores para caracterizar
os compostos de degradação térmica da bixina proveniente do urucum.
2.9 Concentração Mínima Inibitória (CMI) e os métodos para avaliação da
atividade antimicrobiana
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais pode ser avaliada através da
determinação de uma pequena quantidade da substância necessária para inibir o
crescimento do microrganismo-teste; cujo valor é conhecido como Concentração
Mínima Inibitória (CMI). Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade
antibacteriana e antifúngica dos extratos vegetais. Os mais conhecidos incluem método
de difusão em ágar, método de macro diluição e micro diluição.
37
O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um método físico,
no qual um microrganismo é desafiado contra uma substância biologicamente ativa em
meio de cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento do
microrganismo desafiado com a concentração da substância ensaiada. A aplicação do
método de difusão se limita a microrganismos de crescimento rápido, sendo eles
aeróbios ou aeróbios facultativos. A avaliação é comparativa frente a um padrão
biológico de referência (controle positivo) e a zona ou o halo de inibição de crescimento
é medida partindo-se da circunferência do disco ou poço, até a margem onde há
crescimento de microrganismos (BARRY & THORNSBERRY, 1991). De acordo com
a dimensão do halo os microrganismos podem ser classificados como: sensíveis, quando
o diâmetro da zona de inibição é maior ou não mais do que 3 mm menos que o controle
positivo; moderadamente sensíveis, halo maior que 2 mm, mas menor que o controle
positivo de mais de 3 mm; e resistentes, diâmetro igual ou menor que 2 mm. Como
controle positivo, emprega-se um quimioterápico padrão, e como controle negativo o
solvente utilizado para a dissolução dos extratos (KARAMAN et al., 2003;
SPRINGFIELD et al., 2003).
A macro diluição consiste em testes em tubos de ensaio, com volume de meio de cultura
variando de 1 e 10 mL. Por ser trabalhoso, consumir muito tempo, requerer muito
espaço na bancada do laboratório e gerar grande quantidade de resíduos, esta técnica
utiliza um pequeno número de réplicas (SAHM & WASHINGTON II, 1991; ZGODA
& PORTER, 2001).
A técnica de micro diluição utiliza microplacas com 96 poços, com volume de meio de
cultura entre 0,1 e 0,2 mL. ELOFF (1998) utilizou a técnica de diluição em microplacas
para verificar a atividade antimicrobiana em extratos vegetais e observou
inconvenientes na técnica, tais como células de alguns microrganismos que se aderiam à
base do poço, enquanto as de outros permaneciam em suspensão. Ainda, compostos
presentes em alguns extratos precipitavam, e a coloração verde da clorofila em
concentração muito alta interferia na análise. Entretanto, concluiu que o método de
microplacas possui um baixo custo, tem reprodutibilidade, é trinta vezes mais sensível
que outros métodos usados na literatura, requerem pequena quantidade de amostra, pode
ser usado para grande número de amostras e deixa um registro permanente.
38
ZGODA & PORTER (2001) utilizaram extratos orgânicos das plantas Lemna
minor e Ilex cornuta para desenvolver uma técnica de microdiluição para a pesquisa de
novos compostos com atividade antimicrobiana contra bactérias e fungos. Para cada
microplaca foi usado um controle negativo (água, meio de cultura e 2,5% DMSO),
controle de crescimento (água, meio de cultura, 2,5% DMSO e inóculo), controle
positivo (água, meio de cultura, inóculo, 2,5% DMSO e antibiótico). A inoculação
sugerida foi a utilização de 95 µL de água estéril, 5 µL de extrato dissolvido em DMSO,
80 µL do meio apropriado e 20 µL de inóculo. Em teste prévio observou-se que
concentrações maiores que 2,5% DMSO nos poços inibia o crescimento
de Cryptococcus albidus. As leituras foram feitas a 750 nm em um espectrofotômetro
com leitor de microplacas, após a agitação dos poços para ressuspender as células
aderidas no fundo com uma pipeta multicanal.
Atualmente, para determinar a CMI ou a Concentração Mínima Bactericida (CMB) de
extratos ativos de plantas, tem-se utilizado a técnica de microdiluição desenvolvido por
ELOFF (1998).
2.10 Determinação da capacidade antioxidante da bixina pelo método DPPH
O teste usando o composto DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) é um dos mais antigos
métodos indiretos usados para determinar a atividade antioxidante, descrito
originalmente em 1950 para se identificar doadores de hidrogênio em produtos naturais.
Mais tarde, foi usado para determinar o potencial antioxidante de compostos fenólicos
isolados de alimentos e de amostras biologicamente relevantes (ROGINSKY & LISSI,
2005). Uma característica desse método é que ele não envolve condições drásticas de
temperatura e oxigenação (SILVA et al, 1999). O DPPH pode reagir com compostos
fenólicos, bem como com ácidos aromáticos contendo apenas um grupamento
(SANTOS et al, 2007).
39

Figura 10. Estabilidade do radical livre DPPH.
Atualmente, o método do DPPH é muito utilizado para investigar a atividade
antioxidante de diversos tipos de substratos, como compostos fenólicos (SOUSA et al,
2007), fenilpropanóides, fenólicos totais e flavonóis (LEJA et al, 2007), cumarinas
(VOGEL et al, 2004), quitosana com diferentes pesos moleculares (KIM &THOMAS,
2006), antocianinas e antocianidinas (LEJA et al, 2007; DE LIMA et al, 2007),
carotenóides (AJILA et al, 2007), rutina e kaempferol (SILVA et al, 2005).
Esse método avalia a capacidade antioxidante pela atividade sequestradora do radical
livre DPPH. O radical DPPH possui coloração púrpura, com absorção máxima em 515-
517nm (Figura 10). Por ação de um antioxidante (AH) ou uma espécie radical (R), o
DPPH é reduzido, formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com
consequente perda da absorção na região de 515-517nm. O DPPH apresenta-se como
um método simples podendo também ser usado para avaliar atividade antioxidante de
formas sintéticas (ex: nimesulida, dapsona e ácido acetilsalicílico), algas, quitosanas, e
outras substâncias. (CHANDRASEKAR et al, 2006; KIM & THOMAS, 2006;
RAYMUNDO et al., 2004).

40
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Determinar os teores de bixina presentes no extrato bruto das sementes de urucum (Bixa
orellana L.), armazenadas por até 90 dias em diferentes temperaturas (4° ± 1°C e 25° ±
1°C) e de luminosidade, por técnicas de espectrofometria e cromatografia liquida de alta
eficiência, e determinar a atividade antioxidante e antimicrobiana, dos extratos obtidos.
3.1.1Objetivos específicos
Determinar o teor de bixina em sementes de urucum dos cultivares Peruana Paulista e
Embrapa 37 por avaliação espectrofotométrica do extrato bruto;
Purificar a bixina presente em extratos de sementes de urucum por cromatografia
preparativa para ser usada como padrão de referência;
Determinar a estabilidade da bixina em diferentes condições de estocagem (tempo e
temperatura) e verificar a taxa de degradação da bixina por cromatografia liquida de alta
eficiência (CLAE);
Avaliar a atividade antimicrobiana da bixina e dos extratos de urucum frente a agentes
bacterianos definidos por padrões internacionais como de interesse em alimentos;
Avaliar a atividade antioxidante da bixina e do extrato bruto das sementes de urucum.

41
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção das amostras
Sementes de urucum da cultivar Embrapa 37 e Peruana Paulista foram obtidas do pomar
que compõe o banco de germoplasma da Universidade Estadualdo Sudoeste da Bahia
(UESB), em Vitória da Conquista/BA, Brasil, nos meses de Março/2012 e Junho/2012,
respectivamente.
4.2 Preparo das amostras
Após a chegada ao Laboratório de Análises Avançadas em Bioquímica e Biologia
Molecular do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, as
sementes tiveram sua umidade ajustadas para 10%, por secagem em estufa a 105°C,
durante 24 hs, de acordo com as normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. As sementes
foram transferidas para embalagens plásticas de polietileno, seladas à vácuo e
conservadas na geladeira (4° ± 1°C) ou a temperatura ambiente (25° ± 1°C) por 90 dias.
4.3 Extração da bixina
A bixina foi extraída das sementes de urucum como descrito por YABIKU &
TAKAHASHI (1991). Resumidamente, 25g de sementes foram misturadas com 150 mL
de solução aquosa de KOH 0,5% (p/v) fervente. A mistura foi mantida em banho-maria a
100°C por cerca de 1 minuto, até entrar em ebulição. Após o resfriamento em água
corrente, a solução foi filtrada em lã de vidro e o resíduo foi lavado sete vezes com 100
mL de água destilada à temperatura ambiente. O extrato original e os lavados foram
unidos e o volume final foi completado para 1L com água destilada (Figura 11). Os
extratos foram armazenados a 4°± 1ºC ou 25°± 1ºC. Cada amostra foi extraída em
triplicata.
42

Figura 11: Representação esquemática do processo de extração das sementes

4.4 Determinação do teor de bixina
Os extratos obtidos na seção 4.3 foram diluídos duzentas vezes com KOH 0,5% e o teor
de bixina foi estimado por leitura da usando solução de KOH 0,5% como
referência. Para conversão da absorbância em teor de bixina, foi usado o coeficiente de
extinção = 2870 para uma solução de 25g/1L (YABIKU & TAKAHASHI, 1991).
4.5 Caracterização da bixina por espectrometria de infravermelho (FTIR)
Para obtenção dos espectros no infravermelho, extratos brutos contendo bixina foram
preparados a partir de 10g de sementes de cada cultivar, lavadas previamente com 50 mL
de éter de petróleo em agitador magnético por 20 minutos. As sementes, então, foram
transferidas para um copo Becker com 50 mL de metanol:diclorometano (1:1 v/v) e
agitadas com agitador magnético por 30 minutos. Os extratos foram concentrados em
evaporador rotatório a 50°C overnight. Um miligrama dos extratos secos foi macerado e
homogeneizado com 100 mg de KBr para a formação de pastilhas a serem usadas na
aquisição dos espectros. Os espectros no infravermelho da bixina foram adquiridos em
espectrofotômetro IR Prestige-21 (SHIMADZU) no modo de transmitância, com
43
acúmulo de 20 varreduras e resolução de 2 cm
-1
.
4.6 Purificação da bixina para utilização como padrão
A bixina foi extraída de 25g de sementes de urucum previamente lavadas com 50 mL de
éter de petróleo em agitador magnético por 20 minutos. As sementes, então, foram
transferidas para um copo Becker com 50 mL de uma mistura de metanol e
diclorometano (1:1 v/v) e agitadas com agitador magnético por 30 minutos. O extrato
obtido foi purificado por cromatografia em camada fina de sílica-gel (SIGMA) usando
acetato de etila/éter de petróleo (3:2 v/v) como fase móvel. Sob estas condições, duas
bandas distintas foram visíveis, sendo que a banda que permaneceu na origem foi raspada
e eluída com metanol/diclorometano (1:1 v/v). A solução foi aplicada em placas de sílica
e os componentes da solução foram separados por nova cromatografia, utilizando os
mesmos solventes. Novamente, duas bandas foram visíveis, sendo que a principal, com
Rf = 0,73, foi raspada, eluída e quantificada.
4.7 Separação de bixina por CLAE
A quantificação da bixina por CLAE foi realizada em cromatógrafo SHIMADZU com
detector de arranjo de diodos, injetor automático com loop de 20µL, degaseificador on-
line e sistema de aquisição e processamento de dados LC Solution. A separação isocrática
foi realizada por cromatografia de fase reversa em coluna C18 (Kromasil
®
100-5C18, 150
mm x 4,6mm, tamanho de partícula 8µm), usando como fase móvel acetonitrila:ácido
acético 2% (65: 35 v/v) com fluxo de 1mL/ min, como descrito por SCOTTER et al.
(1994). Antes da injeção, as amostras eram filtradas em membrana estéril com porosidade
de 0,45µm,
Os picos correspondentes à bixina foram identificados pelo tempo de retenção
(BRITTON et al., 1995; DAVIES et al., 1976). A quantificação do bixina foi feita por
comparação da área do pico da amostra com a área do padrão injetado.
4.8 Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro dos extratos de B. orellana L.
Para avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos foi empregado dois métodos:
qualitativo (Difusão em Ágar), pois apenas permite uma informação quanto à
sensibilidade da estirpe bacteriana (sensível, intermédio ou resistente) e quantitativa
(Concentração Mínima Inibitória).
44
4.8.1 Preparo do material microbiológico
As cepas de referência utilizadas para realização dos testes foram: Staphylococcus aureus
(ATCC 29213), Enterococcus faecalis (ATCC 51299), Listeria monocytogenes (ATCC
19117), Bacillus cereus (ATCC 11778), Bacillus subtilis (ATCC 19659), Proteus
mirabilis (ATCC 15290); Gram-negativas: Escherichia coli (ATCC 25922),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 95442) e Salmonella T. (ATCC 13311) cedidas pelo
Laboratório de Micobactérias e de Microbiologia de Alimentos, do Instituto de
Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
A partir de culturas estoques, as bactérias foram repicadas em estrias em meio de cultura
Ágar Mueller-Hinton (MH) e incubadas a 35-37 °C por 24 hs. Em seguida, o inoculo foi
diluído convenientemente, cerca de 10
8
UFC/mL, compatível com a graduação de 0,5 da
escala nefelométrica de McFarland.
4.8.2 Avaliação preliminar – Método de difusão em ágar
Para avaliação preliminar, foram utilizadas as concentrações descritas na tabela 2 e a
sensibilidade e resistência das linhagens microbianas foi avaliada pelo método de difusão
em ágar, adaptado de BAUER e colaboradores (1966). Foi preparado meio ágar Mueller-
Hinton com 4 mm de espessura contendo três poços com capacidade 50 l, escavados
com ponteiras estéreis. O fundo dos poços foi recoberto com 5µL de ágar 0,6% e após
solidificação, os poços foram preenchidos com 45 l de bixina purificada (obtida na seção
3.6) e também dos extratos secos das cultivares Embrapa 37 e Peruana Paulista (obtidos
na seção 3.5). Finalmente a suspensão microbiana foi semeada com auxílio de um swab
estéril sobre a superfície da placa e incubada a 35-37°C por 24hs. Apos incubação das
placas foi realizada a leitura dos halos, no qual no qual a ausência era um indicativo de
resistência enquanto a presença do halo indicava sensibilidade. Neste caso, o teste de
difusão em ágar foi considerado um método qualitativo e não semi-quantitativo como o
teste disco-difusão em ágar descrito por BAUER et al., 1966.

45
Tabela II: Diferentes concentrações das amostras utilizadas no ensaio.
Cultivares e extratos Concentração inicial Concentração utilizada
Embrapa 37
Bixina purificada 80 mg/mL 16 mg/mL
Extrato Bruto seco 470 mg/mL 47 mg/mL
Peruana Paulista
Bixina purificada 50 mg/mL 10 mg/mL
Extrato Bruto seco 220 mg/mL 22 mg/mL

4.8.3 Determinação da CMI
A atividade antimicrobiana dos extratos foi determinada pelo método de microdiluição
em caldo, descrito pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards,
2003). Foram utilizadas microplacas de 96 poços com 100 μL de caldo Muller Hinton
(CMH). Nos primeiros poços foram adicionados 100 μL das soluções estoque de bixina
purificada ou do extrato bruto seco. Foram feitas, então, diluições seriadas desta solução
inicial nos nove poços consecutivos retirando-se 100 μL do poço de maior concentração
para o poço seguinte. A concentração de cada amostra foi: bixina cultivar Embrapa 37 (4;
2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625;