Combinação de sincronização de células mitóticas e microscopia confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas do ciclo celular multifuncional durante a mitose

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Combinação de sincronização de células mitóticas e microscopia confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas do ciclo celular multifuncional durante a mitose
INTRODUÇAO
No ciclo celular, as células passam por uma série de eventos altamente regulados e temporariamente controlados para a duplicação precisa de seu genoma e proliferação. Em mamíferos, o ciclo celular consiste em interfase e fase M. Na interfase, que consiste em três estágios - G1, S e G2, a célula duplica seu genoma e sofre o crescimento que é necessário para a progressão normal do ciclo celular1,2 . Na fase M, que consiste em mitose (prófase, prometáfase, metáfase, anáfase e telófase) e citocinese, uma célula parental produz dois geneticamente idênticos células-filhas. Na mitose, as cromátides irmãs do genoma duplicado são condensadas (prófase) e são capturadas em seus cinetóforos por microtúbulos do fuso mitótico montado (prometáfase), que conduz seu alinhamento na placa metafásica (metáfase), seguido por seu segregação igual quando as cromátides irmãs são divididas e transportadas para pólos opostos do fuso (anáfase). As duas células filhas são fisicamente separados pela atividade de um anel contrátil à base de actina (telófase e citocinese). O cinetocoro é uma proteína especializada estrutura que se monta na região centromérica das cromátides e serve como locais de fixação para os microtúbulos fusiformes. Sua principal função é para conduzir a captura de cromossomos, alinhamento e auxiliar na correção da fixação inadequada do microtúbulo do fuso, enquanto medeia o conjunto do fuso ponto de verificação para manter a fidelidade da segregação cromossômica3,4.
A técnica de sincronização celular serve como uma ferramenta ideal para a compreensão dos eventos moleculares e estruturais envolvidos no ciclo celular. progressão. Esta abordagem tem sido usada para enriquecer as populações de células em fases específicas para vários tipos de análises, incluindo o perfil de expressão gênica, análises de processos bioquímicos celulares e detecção de localização subcelular de proteínas. Mamífero sincronizado as células podem ser usadas não apenas para o estudo de produtos gênicos individuais, mas também para abordagens envolvendo a análise de genomas inteiros, incluindo análise de microarray da expressão gênica 5 , padrões de expressão de miRNA 6, regulamento translacional 7, e análise proteômica de modificações de proteínas .A sincronização também pode ser usada para estudar os efeitos da expressão gênica ou knock-down ou knock-out de proteínas, ou de produtos químicos no ciclo celular progressão.
As células podem ser sincronizadas nas diferentes fases do ciclo celular. Os métodos físicos e químicos são amplamente usados ​​para sincronização de células. Os critérios mais importantes para a sincronização de células são que a sincronização deve ser não citotóxica e reversível. Por causa do potencial consequências celulares adversas da sincronização de células por agentes farmacológicos, métodos dependentes de produtos químicos podem ser vantajosos para estudar os principais eventos do ciclo celular. Por exemplo, hidroxiureia, anfidicolina, mimosina e lovastatina podem ser usados ​​para sincronização de células em Fase G1 / S, mas, devido ao seu efeito nas vias bioquímicas que inibem, ativam os mecanismos de checkpoint do ciclo celular e matam um fração importante das células9,10. Por outro lado, a inibição por feedback da replicação do DNA pela adição de timidina ao meio de crescimento, conhecido como “bloqueio de timidina”, pode interromper o ciclo celular em determinados pontos11,12,13. As células também podem ser sincronizadas na fase G2 / M por tratamento com nocodazol e RO-33069,14 .Nocodazol, que impede a montagem de microtúbulos, tem uma citotoxicidade relativamente alta. Além disso, as células interrompidas por nocodazol podem retornar à interfase precocemente por deslizamento mitótico. A timidina dupla bloqueia as células na fase G1 / S e, após a liberação do bloco, as células são encontrados para prosseguir sincronicamente através de G2 e na mitose. A progressão normal do ciclo celular para células liberadas do bloqueio de timidina podem ser observados em microscopia confocal de alta resolução por fixação de células ou imagem ao vivo. O efeito da perturbação das proteínas mitóticas pode ser estudado especificamente quando as células entram e prosseguem através da mitose após a liberação do bloco duplo de timidina. Cdt1, uma proteína multifuncional, está envolvido no licenciamento de origem de replicação de DNA na fase G1 e também é necessário para ligações de microtúbulos de cinetocore durante a mitose . Para estudar a função do Cdt1 durante a mitose, é necessário adotar um método que evite o efeito de seu esgotamento no licenciamento de replicação durante o G1 fase, enquanto ao mesmo tempo efetua seu esgotamento especificamente durante a fase G2 / M apenas. Aqui, apresentamos protocolos detalhados com base no bloco duplo de timidina para estudar o papel mitótico de proteínas que desempenham funções múltiplas durante diferentes estágios do ciclo celular, tanto por células fixas quanto imagem de células vivas.
Protocolo
1. Duplo bloqueio e liberação de timidina: preparações de reagentes
1. Faça 500 mL de meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de FBS, penicilina e estreptomicina.
2. Faça um estoque 100 mM de timidina em água estéril e armazene em alíquotas a -80 ° C.
2. Protocolo para imagens de células fixas de progressão mitótica (Figura 1A)
1. No dia 1, semeie ~ 2 x 105 Células HeLa nos poços de uma placa de 6 poços com uma lamínula (esterilizada com etanol 70% e irradiação UV) e 2 Ml de meio DMEM. Faça crescer as células em uma incubadora umidificada por 24 h a 37 ° C e 5% de CO2.
2. 1 bloco de timidina st: No dia 2, misture completamente o volume necessário de timidina em meio DMEM fresco (estoque 100 mM, final 2 mM concentração).
3. Adicione 2 mL de meio contendo timidina às células em cada poço da placa de 6 poços e incube por 18 h.
4. No dia 3, aspire o meio e lave as células duas vezes com 2 mL de 1x PBS e uma vez com DMEM pré-aquecido fresco; crescer células em fresco meio DMEM pré-aquecido por 9 h para liberar as células do bloco. 
5, 2 nd bloco de timidina: adicione novamente 2 mL de meio contendo timidina (concentração final de 2 mM) às células em cada poço da placa de 6 poços.
6. Incube por mais 18 h.
7. No dia 4, aspire o meio e lave as células duas vezes com 2 mL de 1x PBS e uma vez com DMEM pré-aquecido fresco.
8. Diluir siRNAs (controle e Cdt1) e reagente de transfecção em meio de crescimento sem soro separadamente por 10 min. Misture-os e incubar por 20 min em temperatura ambiente. A concentração final de siRNA usada em cada transfecção foi de 100 nM. Adicione a mistura de reação às células que foram eliminados da timidina.
9. Incube as células a 37 ° C por 9-10 h para liberar do bloqueio e fixe as células nas lamínulas com PFA a 4% por 20 min em temperatura ambiente.
Cuidado: PFA é tóxico, use proteção adequada.
10. Células imunocoloradas, após permeabilização com 0,5% (v / v) de detergente por 10 min à temperatura ambiente e lavagem das células duas vezes com 1x PBS por 5 min cada.
1. Bloqueie as células com 1% de BSA (p / v) em 1x PBS por 1 h em RT seguido pelo tratamento das células com 50 µL de anticorpos primários (anti-α-tubulina de camundongo anticorpo diluído em 1: 1.000, anticorpo anti-Zwint1 de coelho diluído em 1: 400 e anti-fosfo-ɣ H2AX de camundongo diluído em 1: 300) em 1% (p / v) BSA em 1x PBS por 1 h a 37 oC.
2. Depois de lavar as células com 1x PBS três vezes, trate as células com 50 µL de anticorpos secundários para cada lamínula (Alexa 488 e Vermelho de rodamina em diluições de 1: 250 em 1% (p / v) BSA em 1x PBS) por 1 h em temperatura ambiente.
3. Depois de lavar as células com 1x PBS duas vezes por 5 min cada, trate as células com DAPI (0,1 µg / mL em 1x PBS) por 5 min em temperatura ambiente.
4. Depois de lavar as células com 1x PBS duas vezes por 5 min cada,coloque a lamínula voltada para as células na mídia de montagem apropriada em um claro lâmina microscópica.
11. Imagem das células para as proteínas imunocoradas com 60X ou 100X 1.4 NA Plan-Apocromática DIC objetiva de imersão em óleo montada em um microscópio confocal invertido de alta resolução equipado com uma câmera apropriada conforme necessário para a qualidade das imagens exigidas.
12. Adquira imagens em temperatura ambiente como z-stacks de 0,2 µm de espessura usando software apropriado para o microscópio.
3. Protocolo para imagens de células vivas de progressão mitótica (Figura 3A)
1. No dia 1, semeie aproximadamente 0,5-1 x 105 Células HeLa expressando de forma estável mCherry-H2B e GFP-α-tubulina (ligeiramente variável com base no tipo de célula e as proteínas que expressam) em pratos de fundo de vidro de 35 mm com 1,5 mL de meio DMEM e cultivá-los em uma incubadora umidificada por 24h a 37 oC e 5% de CO2.
2. 1bloco de st timidina: No dia 2, adicionar 1,5 mL de meio contendo timidina às células no prato (timidina 100 mM, final 2 mM concentração,).
3. Incube por 18 h.
4. No dia 3, aspire o meio contendo timidina e lave as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1x PBS e uma vez com pré-aquecido fresco DMEM. 
5. Diluir siRNAs (controle e Hec1) e reagente de transfecção com meio de crescimento sem soro separadamente por 10 min. Misture-os e incubar por 20 min em temperatura ambiente. A concentração final de siRNA usada em cada transfecção foi de 100 nM. Adicione a mistura de reação às células que foram eliminados da timidina.
6. Cultive as células em 1,5 mL de meio DMEM pré-aquecido fresco por 8 h para liberar as células do bloco.
7. 2 Bloco de timidina nd: Adicionar 1,5 mL de meio contendo timidina (concentração final de 2 mM) às células no prato.
8. Incubar por mais 18 h.
9. No dia 4, aspire o meio e lave as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1x PBS e uma vez com DMEM pré-aquecido fresco. Em seguida, cresça as células em meio de Leibovitz (L-15) fresco pré-aquecido suplementado com 10% de FBS e 20 mM de HEPES em pH 7,0 por 8 h para liberar células do bloquear.
10. Coloque o prato na câmara de controle de temperatura definida no microscópio confocal de alta resolução que já ligou pelo menos 30 min antes de iniciar a imagem para estabilizar as temperaturas no palco e experimentais.
11. Foque em campo claro com objetiva 60x até que as células estejam visíveis e, em seguida, peneire manualmente no palco para a região de escolha.
12. Configure a luz e a potência / exposição do laser, os parâmetros de aquisição de imagem e a duração do experimento usando a imagem do microscópio software de aquisição de escolha. Use filtros para GFP (excitação 488; emissão de 385 nm) e mCherry (excitação de 561 nm e emissão de 385 nm) para adquirir imagens.
13. Realize o experimento de lapso de tempo adquirindo separadamente luz transmitida pulsada e imagens de fluorescência a cada 10 minutos por um período de até 16 h.
14. Adquira imagens como doze planos z separados de 1,0 µm 9 h após a liberação do bloco duplo de timidina usando software apropriado para o microscópio.
15. Analise as imagens de rastreamento de células individuais para progressão mitótica e, finalmente, monte o filme correspondente com o software de origem Fiji / ImageJ.
Resultados Representativos
Estudo da progressão mitótica e estabilidade dos microtúbulos em células fixadas após a liberação do bloqueio duplo de timidina Cdt1 está envolvido no licenciamento de origens de replicação de DNA na fase G1. É degradado durante a fase S, mas se acumula novamente na fase G2 / M. Para estudar seu papel na mitose, o Cdt1 endógeno precisa ser esgotado especificamente na fase G / M usando a sincronização celular mais adequada técnica, o bloqueio duplo de timidina15. As células foram transfectadas com siRNAs imediatamente após a liberação do segundo bloco de timidina, quando as células estão na fase S e nessa época o licenciamento das origens de replicação em G1, que também requer a função Cdt1, já foi concluído há muito tempo. a depleção de Cdt1 após 9 h de transfecção com siCdt1 e liberação de bloqueio duplo de timidina foi validada por Western blotting (Figura 1B). Fixação de células 9 h após a liberação do bloco duplo de timidina mostra que a maioria das células está no estágio de metáfase tanto no controle quanto no siRNA de Cdt1 células transfectadas. Mas a fixação das células 10 h após a liberação do bloco duplo de timidina mostra que a maioria das células tratadas com siRNA de Cdt1 ainda estão preso no estágio de prometáfase tardia, enquanto as células de controle entram na anáfase e normalmente segregam seus cromossomos conforme o esperado (Figura 1C). Para compreender o efeito da depleção de Cdt1 na estabilidade do cinetocoro-microtúbulo (kMT), as células foram fixadas 9 h após a liberação da timidina dupla bloqueio seguido de tratamento a frio, que retém apenas os microtúbulos cinetocóricos (kMTs) estáveis. Os kMTs de células depletadas de Cdt1 são relativamente menores robusta após tratamento a frio em comparação com as células de controle (Figura 1D). Assim, usando esta abordagem, a progressão das células mitóticas normais após a perturbação da função da (s) proteína (s) mitótica (s) de interesse pode ser estudada de forma eficaz, mesmo sem o uso de imagens de células vivas.
A Figura 2 mostra que o licenciamento da origem de replicação de DNA não é perturbado quando as células são esgotadas de Cdt1 durante a fase G2 / M usando nosso protocolo, o que também foi observado em células controle. Células depletadas de Cdt1 durante a fase G2 / M não induziram o acúmulo de ɣH2AX fosforilado, um marcador para dano ao DNA, durante a fase G2 subsequente; enquanto a transfecção de siRNA de culturas assíncronas para esgotar Cdt1 induzida acumulação de focos fosfo-ɣH2AX-positivos, possivelmente devido a danos no DNA induzidos por licenciamento de replicação de DNA impróprio.
Estudo da progressão mitótica em células após a liberação do bloqueio duplo de timidina por imagem de células vivas Após a quebra do envelope nuclear (NEB), as células normais (na ausência de perturbação por uma proteína mitótica funcional) entram na mitose e sofrem o início da anáfase para sair da mitose dentro de cerca de 30-60 min (Figura 3B). Mas o knockdown de Hec1 mediado por RNAi, um cinetocoro chave proteína que é necessária para a formação de ligação kMT robusta, é encontrada para atrasar a progressão mitótica normal. Neste cenário, a maioria das células entra mitose após o NEB, mas não sofrem o início da anáfase ou a saída da mitose, mesmo após várias horas de atraso na mitose (Figura 3C). Da mesma forma, o efeito do knockdown mediado por RNAi de qualquer outra proteína que se localiza em cinetocoros ou tendo uma função durante a mitose pode assim, ser observado de forma eficaz usando imagens de células vivas após a liberação de blocos duplos de timidina. Além de estudar a natureza da mitose progressão, atraso e parada, alguns dos outros fenômenos mitóticos chave que podem ser ensaiados usando este método incluem alinhamento de cromossomos, formação do fuso mitótico e posicionamento da ativação e silenciamento do ponto de verificação do conjunto do fuso.
Figura 1: Análise da progressão mitótica e da estabilidade dos microtúbulos cinetocore em células fixas após dupla timidina sincronização. (A) Uma representação esquemática da sincronização celular, fixação e imunofluorescência. (B) Western blot para knockdown de Cdt1 após 9 h de liberação do 2º bloco de timidina. (C) Micrografias de imunofluorescência para mostrar as células mitóticas fixadas 9 e 10 h após a liberação de bloqueio duplo de timidina e tratamento com controle (em cima) ou siRNA de Cdt1 (em baixo). A coloração da α-tubulina está em vermelho, o DNA está em verde conforme as células expressam GFP-Histona H2B. Barra de escala = 10 µm. As células de prometáfase e metáfase são indicadas com pontas de seta amarelas e brancas, respectivamente. (D) Células HeLa após o tratamento com siRNA de controle (painelsuperior) e após a depleção de Cdt1 (painel inferior) por 9 h após a liberação da timidina dupla bloqueio seguido de tratamento com meio de Leibovitz (L-15) gelado e fixação. As células foram imunocoradas para o fuso MT (verde) e um marcador cinetocoro, Zwint1 (vermelho) e DAPI para DNA em preto e branco. Barra de escala = 5 µm.
Figura 2: A depleção de Cdt1 durante a fase G2 / M não perturba o licenciamento de replicação. Células HeLa assíncronas tratadas com luciferase de controle (painel superior) ou siRNAs cdt1 (painel do meio) ou células HeLa sincronizadas com timidina dupla tratadas com siRNA cdt1 durante a segunda lavagem de timidina seguido por fixação 10 h após a liberação (painel inferior) foram corados com DAPI (verde pseudo-colorido) e anti -phospho-ɣH2AX anticorpo (vermelho). Barra de escala = 10 µm.
Figura 3: Análise da progressão mitótica por imagem de células vivas em células sincronizadas. (A) Uma representação esquemática da sincronização de células e imagens de células vivas. Células HeLa expressando estavelmente mCherry-Histona H2B e GFP-α-tubulina foram liberadas do bloco duplo de timidina por 8 h para deixá-los prosseguir para a fase G2 / M da parada da fase S. A imagem ao vivo foi realizada usando um microscópio confocal de alta resolução começando 8 h após a liberação das células do bloco de timidina e continuando por até 16 h a partir desse ponto. Aqui estão as imagens estáticas do vídeo capturado a cada 10 min para células de controle sem perturbação de qualquer proteína mitótica (B) ou para células depletadas da subunidade Hec1 do Ndc80 complexo (C). Barras de escala = 10 µm
Discussão
A vantagem mais crítica da sincronização dupla de timidina é que ela fornece um tamanho de amostra aumentado de células mitóticas em um curto período de tempo janela com muitas dessas células entrando na mitose em uníssono, permitindo, assim, análises de alinhamento de cromossomos, formação de fuso bipolar e segregação cromossômica com eficiência muito maior.
Muitos complexos de proteínas regulatórias e vias de sinalização são dedicados a garantir a progressão normal através da mitose e desregulação de este processo pode levar à tumorigênese. Imagens de células vivas de células HeLa expressando de forma estável mCherry-H2B e GFP-tubulina e liberadas do o bloqueio duplo de timidina mostra que a maioria das células de controle segregam seus cromossomos na anáfase dentro de aproximadamente 60 min após NEB (Figura 3B). Por outro lado, a imagem de células vivas de células HeLa perturbadas com a função Hec1 mostra que a maioria das células permanece na fase mitótica por um longo período com cromossomos desalinhados seguido pelo início da anáfase ou apoptose (Figura 3C).
O excesso de timidina inibe a síntese de DNA durante a fase S, bloqueando as células na fase G1 / S11. Embora bloqueio duplo de timidina sincronização é o método mais comumente usado no estudo do ciclo celular e progressão mitótica, é preciso ser crítico de alguns dos limitações deste método. É importante ter certeza de que o produto químico foi completamente lavado (por 7-8 h) para que o efeito seja completamente reversível e as células podem prosseguir normalmente durante o resto do ciclo celular. As células podem não entrar no segundo ciclo, causando progressão imprópria através da mitose. A proporção de células sincronizadas pode não ser suficientemente alta com um único bloco de timidina e um duplo o bloqueio de timidina pode ser necessário para aumentar o número de células sincronizadas, especialmente se alguém estiver interessado em estudar um estágio específico de mitose. A duração do tratamento com timidina deve ser otimizada devido à sensibilidade diferente entre os tipos de células, dependendo da geração Tempo. Por exemplo, células de hamster têm 16 horas de geração e são tratadas com timidina por 11 horas para sincronização ideal17 . Neste estudo, tratamos células HeLa por 16-18 h com timidina. Além disso, o excesso de timidina não só impede a síntese de DNA, mas também pode matar importantes frações das células11,12,18 e muita atenção deve ser dada para monitorar essa perda. A solução estoque de timidina usada neste estudo deve ser preparada em água destilada estéril e deve ser bem misturada no meio de cultura de células para evitar sua precipitação após adição à mídia de células transfectadas com siRNA e também para garantir a sua distribuição homogénea em torno das células cultivadas.
Para estudar a função de uma proteína mitótica alvo durante a progressão mitótica, as células seriam idealmente tratadas com siRNA para derrubar o níveis da proteína de interesse durante o primeiro bloco de timidina ou durante a liberação do primeiro bloco de timidina, dependendo do tempo necessário para obter um knockdown eficiente de proteína 19,20,21. Por outro lado, para estudar o papel de proteínas multifuncionais como Cdt1 durante mitose, é necessário tratar as células com siCdt1 durante a liberação do 2º bloco de timidina para obter depleção específica de G2 / M. Cdt1 é um jogador crítico no licenciamento de origens de replicação de DNA 15 . Para entender seu papel especializado durante a mitose, sem interferir em seu papel na licenciamento, Cdt1 precisa ser esgotado especificamente na fase G2 / M, o que pode ser alcançado de forma eficiente por dupla sincronização de timidina, assim evitando a necessidade de recorrer a outras abordagens de perturbação específicas da mitose que são difíceis de executar. Esgotamento de Cdt1 em assíncrono culturas induzem resposta a danos de DNA devido à interrupção do licenciamento das origens de replicação de DNA, o que por sua vez teria confundido o análise de uma possível função desta proteína durante a mitose. Assim, a técnica de sincronização dupla timidina oferece um único experimento abordagem para gerar células que passaram por uma fase G1 e S normal, mas não tinham a função Cdt1 durante as fases G2 e M. O significado especial do nosso protocolo de sincronização reside na sua inibição de proteínas multifuncionais na fase específica (G2 / M) para estudar suas novas funções durante mitose. Assim, este método será útil não apenas para estudar o papel de proteínas que têm múltiplas funções durante diferentes estágios do ciclo celular, mas também de qualquer proteína mitótica no processo de alinhamento de cromossomos, ligações kMT e segregação cromossômica.
Para imagens de células vivas, após a liberação do bloco duplo de timidina, as células devem ser incubadas em meio de Leibovitz (L-15) pré-aquecido suplementado com 10-20% de FBS até o início da imagem. As células entram na mitose em pontos de tempo variáveis ​​após a liberação do bloco de timidina dependendo do tipo de célula. A hora de início da captura ou fixação da imagem precisa ser otimizada dependendo do tipo de célula. Para imagens de células vivas, a utilização de microscopia confocal convencional pode causar fotodegradação durante imagens de longo prazo. Por outro lado, a alta resolução a microcopia confocal fornece uma imagem nítida e de alta resolução com o mínimo de efeitos de fotodegradação.
As etapas críticas neste protocolo são a duração do tratamento com timidina, lavagem adequada da timidina, o momento da transfecção de siRNA e o momento de início da geração de imagens.
Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Reconhecimentos
Somos gratos ao Dr. Kozo Tanaka da Tohoku University, Japão, por compartilhar células HeLa que expressam de forma estável mCherry-Histona H2B e GFP-αtubulina. Este trabalho foi financiado por uma bolsa do NCI para DV (R00CA178188) e por fundos iniciais da Northwestern University.