O Laboratório de Reprodução Humana Assistida

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O Laboratório de Reprodução Humana Assistida
Prof.ª Ana Clara Coelho Esteves
Descrição
Técnicas de preparo seminal, de fertilização in vitro e transferência embrionária.
Propósito
Compreender as técnicas empregadas na rotina dos laboratórios de andrologia e embriologia envolvidas
nos diversos tratamentos de reprodução assistida.
Objetivos
Módulo 1
Laboratório de andrologia e inseminação intrauterina (IIU).
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Descrever as técnicas empregadas no laboratório de andrologia e de inseminação intrauterina (IIU);
Módulo 2
Laboratório de embriologia e técnicas de fertilização in vitro
Descrever as técnicas de fertilização in vitro;
Módulo 3
Técnicas especiais empregadas no laboratório de embriologia.
Reconhecer as técnicas especiais empregadas no laboratório de embriologia clínica.
Muito do que está envolvido nos tratamentos de reprodução humana assistida acontece nos
bastidores da clínica nos laboratórios de andrologia e embriologia. Neles é onde acontece todo o
preparo dos gametas, prévio à sua utilização nos procedimentos.
No laboratório de andrologia realizamos análise diagnóstica e processamento terapêutico seminal.
Na análise diagnóstica ‒ o espermograma ‒ observamos todas as características macroscópicas e
microscópicas da amostra ejaculada, o que resulta em um parecer pontual sobre aquela amostra.
Já no processamento terapêutico, processamos e capacitamos a amostra para que seja utilizada
nos tratamentos de infertilidade ‒ sejam inseminação intrauterina, fertilização in vitro, ou mesmo
congelamento da amostra para preservação da fertilidade.
Vamos conhecer também o laboratório de embriologia, onde são realizadas as técnicas de alta
complexidade, e também saber mais sobre os procedimentos às quais estão relacionadas.
Nesse laboratório, manipulamos oócitos e embriões, desde a punção ovariana para aspiração do
líquido folicular, contendo os complexos cumulus-oócito, até o momento da transferência ou
Introdução
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criopreservação dos embriões formados.
Algumas das etapas compreendidas nesse processo são: identificação e denudação dos oócitos,
classificação da maturação oocitária, fecundação dos oócitos, verificação da fertilização, cultivo
embrionário, avaliação da morfologia e desenvolvimento dos embriões, criopreservação de oócitos e
embriões, e transferência embrionária.
Também veremos algumas técnicas especiais que figuram no dia-a-dia dos embriologistas, como
obtenção cirúrgica de espermatozoides, técnicas alternativas de seleção espermática (em casos
como alto índice de fragmentação de DNA e alteração da morfologia espermática) e eclosão
assistida, para auxiliar embriões a saírem da zona pelúcida em situações específicas, como
espessamento de zona e criopreservação prévia.
Orientação sobre unidade de medida
Em nosso material, unidades de medida e números são escritos juntos (ex.: 25km) por questões de
tecnologia e didáticas. No entanto, o Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o número
e a unidade (ex.: 25 km). Logo, os relatórios técnicos e demais materiais escritos por você devem
seguir o padrão internacional de separação dos números e das unidades.
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1 - Laboratório de andrologia e inseminação intrauterina
(IIU).
Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas empregadas no laboratório
de andrologia e de inseminação intrauterina (IIU).
Introdução à análise seminal
O sêmen é um fluido orgânico cuja principal função é transportar os espermatozoides desde os testículos
até o oócito, para que ocorra a fecundação e, consequentemente, a gravidez. Para que o espermatozoide
consiga ser ejaculado, são produzidas as secreções pelo aparelho genital masculino, que se misturam aos
espermatozoides produzidos nos testículos, formando o sêmen em si.
Cada secreção tem a sua função para que o espermatozoide consiga percorrer todo o caminho até o
encontro com o oócito. O líquido vesicular tem função na coagulação e na manutenção da alcalinidade do
pH; a secreção prostática possui enzimas proteolíticas que ajudam na liquefação seminal; e as glândulas
bulbouretrais realizam a lubrificação.
Espermograma
A análise seminal ou espermograma é um exame que fornece informações importantes sobre a produção
de espermatozoides e das funções secretoras das glândulas acessórias (próstata e vesícula seminal), e
consiste na avaliação macroscópica e microscópica do sêmen, como veremos a seguir.
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Para a realização do espermograma, é indicada a abstinência sexual entre 2 e 7 dias, já que sabemos que
um período menor ou maior pode alterar os resultados do exame.
Exemplo
Se o paciente tem ejaculações frequentes, o volume e a concentração diminuem, ficando predominantes os
espermatozoides mais jovens e móveis. Um período prolongado de abstinência ejaculatória, por sua vez,
influencia negativamente a motilidade e a vitalidade dos espermatozoides, uma vez que a concentração de
espermatozoides inativos aumenta.
É importante lembrar que um único espermograma não é diagnóstico definitivo da qualidade seminal, uma
vez que diferentes amostras de um mesmo paciente podem apresentar variações e sofrer alterações devido
à ação de fatores externos, como alguns medicamentos, por exemplo.
Assim, para um panorama mais fidedigno de avaliação da qualidade seminal, é aconselhável que o
espermograma seja repetido em um período de dois a três meses.
O método de coleta é, de preferência, a masturbação, realizada em uma sala isolada, próxima ao laboratório,
utilizando um frasco coletor estéril, atóxico (feito de polipropileno) e previamente identificado, com boca
larga, e sem o uso de lubrificante.
Após a coleta, o paciente preenche um questionário, informando se houve perda de amostra, já que a
primeira parte do ejaculado é a que possui a maior concentração de espermatozoides.
Para cada paciente é preenchido um prontuário no qual anotamos os horários de coleta e de início da
análise. A análise deve ser realizada em até uma hora após a ejaculação, e, além disso, a amostra não pode
sofrer bruscas alterações de temperatura, devendo ser mantida sempre entre 25°C e 37°C.
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Ao chegar no laboratório, a amostra passará por uma análise macroscópica, que consiste na verificação da
presença de coágulos, liquefação, viscosidade, aspecto, cor, pH, e volume seminal. Na avaliação
microscópica, por sua vez, observamos a concentração, motilidade dos espermatozoides e concentração de
células redondas.
Saiba mais
Os valores de referência, tanto para os parâmetros macro quanto para os microscópicos, são definidos pela
Organização Mundial de Saúde (OMS) e estabelecidos a partir da média de diversas análises seminais
provindas de homens de diferentes nacionalidades, que foram capazes de engravidar suas esposas por
método natural em até um ano.
Liquefação
Em condições fisiológicas, o sêmen fica em forma de coágulo logo após a ejaculação. Esse coágulo tem
como função proteger os espermatozoides do pH ácido da vagina. O coágulo se forma a partir de proteínas
secretadas pelas vesículas seminais.
O coágulo deve se desfazer naturalmente e assumir um aspecto líquido em até 30 minutos. Essa liquefação
é enzimática e acontece por causa das proteases prostáticas.Se o sêmen não se liquefizer em 60 minutos, essa amostra teve liquefação incompleta ou ausente
(condição relacionada a alterações prostáticas), podendo precisar de liquefação mecânica ‒ quando
aspiramos e soltamos o sêmen manualmente com auxílio de uma pipeta.
roteases
Enzimas que digerem proteínas.
Viscosidade
Após a completa liquefação, observamos a viscosidade da amostra: com o auxílio de uma pipeta sorológica
estéril, a amostra deve gotejar ou formar um filamento de até 2cm ‒ nesse caso, consideramos uma
viscosidade normal. Caso a amostra apresente um filamento maior do que 2cm, a viscosidade é aumentada.
Volume
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Para medir o volume da amostra pipetamos toda a amostra com o auxílio de uma pipeta graduada estéril.
De acordo com a OMS, o valor de referência para o volume é de 1,4mL (WHO, 2021).
Amostras com volume inferior são classificadas com hipospérmicas. Essa alteração pode estar relacionada
à obstrução do ducto ejaculatório, ausência congênita bilateral dos vasos deferentes ou inflamação crônica.
Um volume aumentado, por sua vez, pode ser causado por processos inflamatórios agudos nas glândulas
anexas.
Aspecto
O sêmen normal tem aspecto homogêneo e cor cinza/branco opalescente. A amostra pode apresentar
mudança de coloração devido às infecções ou doenças sistêmicas, ou uso de medicamento.
Exemplo
Quando a amostra tem presença de hemácias (hematospermia), fica avermelhada; amostras amarelas
podem ser indicativas de infecção ou icterícia; já amostras translúcidas, em geral, possuem baixa
concentração de espermatozoides.
pH
O pH é o balanço de secreções alcalinas das vesículas seminais e da secreção ácida prostática. Em
condições normais, o sêmen é um pouco alcalino ‒ apresentando valor entre 7,2 e 7,8. Para medir o pH, é
utilizado o papel indicador de pH.
Concentração espermática
A concentração espermática está associada à produção espermática pelos testículos. Para a avaliação da
concentração, pode ser utilizado um dispositivo específico, chamado câmara de Makler, ou um dispositivo
utilizado para contagem de células em geral (câmara de Neubauer, por exemplo).
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No caso da câmara de Makler, dispositivo mais comumente utilizado nos laboratórios de Reprodução
Assistida, são colocados 10µL de sêmen liquefeito e homogeneizado no centro do dispositivo, que são
cobertos com uma lamínula especial.
Essa câmara possui um quadrante com 100 quadrados ‒ medindo 0,1mm X 0,1mm cada um ‒ e
profundidade de 0,01mm, o que permite que os espermatozoides nadem livremente mesmo com a lamínula.
Para determinar a concentração de espermatozoides por mL, conta-se a quantidade de espermatozoides
presentes em 10 quadrados (uma fileira ou coluna) e multiplica-se por 106.
Câmera de Makler sendo carregada com amostra para análise.
Vamos a um exemplo prático ?
Fotografia de visão microscópica de amostra seminal analisada na câmara de Makler.
Contando 42 espermatozoides em uma fileira de 10 quadrados, a amostra tem 42 x 106/mL (42 milhões de
espermatozoides por mililitro). Essa avaliação é feita em microscópio óptico com aumento de 200x.
Para saber o número total de espermatozoides na amostra, multiplica-se o resultado da concentração por
mililitro pelo volume total da amostra ejaculada. Por exemplo, uma amostra com 3mL de volume com uma
concentração de 42 x 106/mL tem 126 x 106 (126 milhões) de espermatozoides.
De acordo com a OMS, o valor de referência para a concentração seminal é de 16 x 106/mL (16 milhões de
espermatozoides por mililitro)(WHO, 2021). Para amostras que apresentem concentração espermática
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inferior a esse valor, utilizamos a nomenclatura de oligozoospermia. Falamos em azoospermia quando há
ausência de espermatozoides na amostra.
Concentração espermática normal.
Oligozoospermia.
Azoospermia.
Motilidade
A motilidade espermática é definida como o movimento espontâneo do espermatozoide, e sua avaliação
deve ser feita logo após a liquefação do sêmen. A contagem é realizada na câmara de Makler, em
microscópio óptico com aumento de 200x.
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De acordo com a OMS, os espermatozoides são classificados em quatro grupos:
Geralmente, contamos em duplicata 100 espermatozoides (totalizando 200 espermatozoides ao final das
duas contagens) com auxílio de um contador de células. Após as duas contagens, é feita a média aritmética
e calculada a porcentagem dos tipos de motilidade encontradas, de acordo com a OMS.
Moveis rápidos progressivos (A):
Espermatozoides que apresentam uma velocidade rápida, tanto de forma linear quanto
realizando curvas durante o trajeto;
Lentos progressivos (B):
Espermatozoides que nadam de forma lenta, linear ou realizando curvas durante o trajeto;
Não progressivos (C):
Espermatozoides que têm movimento sem progressão, ou seja, não saem do lugar;
Imóveis (D):
Espermatozoides que não apresentam movimento algum.
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Também segundo a OMS, a motilidade progressiva (A+B) deve ser maior do que 30%, e a motilidade total
(A+B+C) maior do que 42% (WHO, 2021). Utilizamos a nomenclatura astenozoospermia para amostras com
motilidade espermática inferior a esses valores.
Morfologia
A morfologia espermática caracteriza-se pela forma do espermatozoide, porém não deve ser considerada
como indicador absoluto de infertilidade. Para avaliação desse parâmetro, a OMS recomenda o critério de
Tygerberg, descrito em 1986 por Kruger et al. (WHO, 2021). Avaliamos todas as partes do espermatozoide
para determinar um padrão de normalidade.
Nessa classificação, dividimos a observação do espermatozoide em três partes: cabeça, peça intermediária
e cauda.
Estrutura do espermatozoide.
Ao realizar leitura da morfologia espermática, começamos observando a cauda, depois a peça intermediária
e, por último, a cabeça. Abaixo, descrevemos estas estruturas:
Deve possuir formato oval e superfície lisa, com cerca de 5-6µm de comprimento e 2,5-3,5µm de
largura. Deve, ainda, apresentar uma porção mais clara, o acrossoma — que ocupa de 40 a 70% da
área da cabeça —, e uma região posterior mais escura, que corresponde ao núcleo.
É a parte que une a cauda do espermatozoide à cabeça, apresenta 1,5x o comprimento da cabeça, e
Cabeça 
Peça intermediária 
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largura superior à da cauda.
Deve ter aproximadamente 45µm de comprimento, ser mais fina do que a peça intermediária e se
apresentar uniforme, reta e desenrolada.
A figura a seguir representa as alterações dos espermatozoides com suas respectivas nomenclaturas.
Representação das alterações morfológicas dos espermatozoides e respectivas nomenclaturas, de acordo com a classificação de Kruger.
E como podemos fazer a leitura da morfologia seminal?
Para a realização da leitura da morfologia seminal, realiza-se um esfregaço com 10µL de sêmen liquefeito.
Após seca, a lâmina é corada pelo método panótico rápido e a leitura é realizada em um microscópio óptico,
sob imersão em óleo, com aumento de 1000x.
sfregaço
Também chamado de “lâmina de extensão”, é a lâmina preparada com uma fina camada de sêmen para
posterior coloração e análise.
étodo panótico
Método de coloração baseado no princípio de coloração hematológica, composto por três substâncias
diferentes (uma fixadora e outras duas corantes).Cauda 
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Lâmina contendo o esfregaço do sêmen mostrando os espermatozoides.
Contam-se 100 espermatozoides, classificando-os de acordo com as alterações. O valor de referência
indicado pela OMS para a morfologia espermática é de 4% (WHO, 2021).
A alteração da morfologia espermática em uma amostra é caracterizada como teratozoospermia.
Testes complementares
Além dessa análise seminal básica da infertilidade masculina, existem outras análises que nos dão mais
informações quanto à função espermática. Veja a seguir:
Leucospermia
A leucospermia é definida por uma quantidade maior que 1 milhão de células redondas por mililitro de
sêmen.
Para a realização dessa análise, durante a verificação da concentração espermática, quantificamos também
o número de células redondas na amostra. Quando encontramos mais de 1,0 x 106/mL de células redondas,
realizamos o teste de endtz, ou teste da peroxidase, com o qual vamos conseguir diferenciar e quantificar as
células germinativas imaturas dos leucócitos.
Na imagem ao lado, vemos a diferenciação das células redondas, utilizando o teste de endtz. A letra N
representa uma célula peroxidase negativa (células germinativas) e a letra P, uma célula peroxidade positiva
(leucócitos).
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Teste de endtz.
Saiba mais
O teste de Endtz nos dá informação para o tratamento de uma possível infecção. Pacientes com
leucospermia, geralmente, apresentam elevadas quantidades de espermatozoides imaturos e com alteração
de morfologia.
Vitalidade
Outro teste complementar é o de vitalidade, que realizamos quando a amostra tem menos de 30% de
motilidade progressiva. Esse teste nos ajuda a verificar se os espermatozoides estão imóveis por causa de
um defeito estrutural ou pela morte celular.
Para realização desse teste, fazemos uma lâmina de esfregaço seminal que, posteriormente, passa por um
processo especial de coloração. Os espermatozoides com a membrana intacta (vivos) são capazes de
excluir o corante; já os mortos, que não possuem membrana íntegra, são corados. Esse teste nos auxilia no
diagnóstico de necrozoospermia.
ecrozoospermia
Quantidade de espermatozoides vivos abaixo do valor de referência.
Teste de vitalidade.
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Na imagem ao lado, conseguimos observar o resultado de um teste de vitalidade. Os espermatozoides
corados com a cabeça em rosa são considerados mortos (D) e os não corados são considerados vivos (L).
Outro teste que avalia a vitalidade espermática é o teste hiposmótico (HOS), que consiste na adição de um
meio com baixa osmolaridade à amostra, o que causa um “inchaço" na cauda do espermatozoide cuja
membrana celular está íntegra.
smolaridade
Concentração total de todos os solutos na solução.
Avaliação de aglutinação
Quando realizamos as contagens ‒ tanto de concentração quanto de motilidade seminal, observamos se os
espermatozoides estão aglutinados, ou seja, se estão “presos” um ao outro pela cauda ou pela cabeça.
Essa aglutinação é causada pela presença de anticorpos antiespermatozoides (AAE) em caso de
rompimento da barreira hematotesticular, podendo ser por trauma cirúrgico ou infecção.
Na imagem a seguir, conseguimos observar os tipos de aglutinação que podemos encontrar durante
avaliação da amostra seminal na câmara de Makler.
arreira hematotesticular
Barreira física entre os vasos sanguíneos e os túbulos seminíferos, formada pelas células de Sertoli.
Representação dos tipos de aglutinação.
Saiba mais
A presença de AAE prejudica a motilidade espermática, já que os anticorpos aglutinam ou imobilizam os
espermatozoides.
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Fragmentação de DNA
Outro exame importante na análise seminal é o de fragmentação do DNA espermático, no qual analisamos
se existem quebras de fita única ou dupla na cadeia de DNA. Essas quebras podem ser ocasionadas por
apoptose, durante a espermatogênese, problemas no empacotamento da cromatina na formação dos
espermatozoides e pela ação de espécies reativas de oxigênio.
A fragmentação do DNA espermático pode ser devida a varicocele, idade paterna avançada, infecção
genital, tabagismo e obesidade.
E como podemos analisar a fragmentação do DNA espermático?
Existem quatro técnicas para analisar a fragmentação do DNA espermático: TUNEL (Terminal
Deoxynucleotidyl Transferase Uracil Nick End Labeling), Teste do cometa (comet assay), Teste da dispersão
da cromatina (SCD- Sperm Chromatin Dispersion), SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay).
Vamos conhecer cada uma delas?
spécies reativas de oxigênio
Compostos químicos resultantes da ativação ou redução do oxigênio molecular ou derivados dos produtos da
redução.
Técnica TUNEL, mostrando espermatozoides com o DNA fragmentado corados em verde e com DNA íntegro em azul.
Técnica TUNEL
Esta técnica, avalia diretamente a fragmentação de DNA da amostra. É capaz de diferenciar, por meio de
diferentes colorações, o DNA fragmentado do não fragmentado.
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Teste do cometa, mostrando vários graus de fragmentação do DNA evidenciados pelo comprimento e intensidade da cauda.
Teste do cometa
É realizado por eletroforese. Para tal, adicionamos uma solução que remove as proteínas. Logo em
seguida, são adicionados géis de agarose em uma lâmina e submetidos à corrente elétrica. Como o DNA
do espermatozoide possui carga negativa, naqueles que apresentarem fragmentação ocorrerá uma
migração do DNA para fora do núcleo, formando, assim, uma aparência de cometa.
Técnica de dispersão da cromatina espermática.
Técnica de dispersão da cromatina espermática
Consiste na resposta diferenciada do espermatozoide quando entra em contato com a solução que
quebra proteínas. A desnaturação e a extração das proteínas nucleares formam um halo ao redor da
cabeça do espermatozoide quando o DNA está íntegro. Assim, ocorre ausência do halo em
espermatozoides com fragmentação de DNA.
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Esquema mostrando um resultado da fragmentação de DNA pela técnica de SCSA.
Técnica de SCSA
A técnica de SCSA é realizada por citometria de fluxo e permite a análise de grande número de células.
Para sua realização, são associados fluorocromos para a diferenciação de espermatozoides
fragmentados dos não fragmentados.
Preparo seminal
Como já vimos, o sêmen é composto pelo plasma seminal, que auxilia os espermatozoides a atravessarem
o muco cervical, que, por sua vez, tem como função natural selecionar os espermatozoides viáveis.
Para os tratamentos de reprodução assistida ‒ tanto a inseminação intrauterina (IIU) quanto a fertilização in
vitro clássica (FIV) e a injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) ‒, essa etapa de seleção natural
é driblada, pois removemos o plasma seminal com as técnicas de preparo seminal.
Assim, conseguimos preparar uma amostra com maior concentração de espermatozoides e com melhor
motilidade, e retiramos as células germinativas, debris, espermatozoides inviáveis. A técnica escolhida para
realizar o preparo seminal vai depender da qualidade seminal, ou seja, da concentração e motilidade
seminal.
ebris
Sujeiras, elementos que não fazem parte do sêmen propriamente dito.
Sperm wash
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Para amostrascom oligozoospermia severa é realizada a técnica de sperm wash, que consiste em
concentrar todos os elementos do sêmen, incluindo os espermatozoides móveis e imóveis ‒ aumentando a
concentração da amostra.
Para a realização dessa técnica, adicionamos, em um tubo cônico de 15mL, meio de cultivo tamponado à
amostra seminal liquefeita, homogeneizamos e centrifugamos. Após a centrifugação, removemos o
sobrenadante e ressuspendemos o pellet em uma pequena quantidade de meio tamponado;
homogeneizamos e realizamos uma nova análise da amostra para determinar as novas concentração e
motilidade espermática.
eio de cultivo tamponado
Meio de cultivo cujo pH não sofre grandes variações em condições ambiente (e, por isso, é usado quando
fazemos algum procedimento que vá manter os gametas fora da incubadora por um período maior do que dois
minutos).
ellet
Amostra concentrada ao fundo do tubo, que se distingue do sobrenadante.
Esquema mostrando a técnica de Sperm wash.
Swim-up
Para amostra com oligozoospermia grave, leucospermia e boa motilidade, ou seja, amostras com motilidade
acima de 30%, realizamos a técnica de swim-up, que consiste na migração dos espermatozoides contra a
gravidade, como o próprio nome da técnica diz (“nadar para cima”), resultando na seleção de
espermatozoides móveis na alíquota superior.
Para a realização dessa técnica colocamos 1mL de meio de cultivo tamponado em um tubo cônico de 15mL
e adicionamos 1mL da amostra seminal liquefeita no fundo dele. Deixamos a amostra em um bloco
aquecido com angulação de 45° por 60 minutos.
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Após esse período, retiramos uma alíquota de 0,5mL do sobrenadante e colocamos em outro tubo cônico.
Realizamos uma nova análise da amostra para determinar a concentração e a motilidade espermática.
Esquema ilustrando a técnica de Swim-up.
Gradiente descontínuo de densidade
Outra técnica utilizada nos tratamentos de reprodução assistida é o gradiente descontínuo de densidade.
Podemos realizar essa técnica em amostras normozoospermicas (que apresentam resultados ideais em
relação aos valores de referência) ou limítrofes.
Esse preparo tem como princípio a seleção dos espermatozoides por meio da passagem da amostra por
duas camadas de densidades distintas, a de 90% e a de 45%. A diferença de densidade do meio se dá a
partir da concentração de partículas de sílica recobertas por polivinilpirrolidona (PVP). Essa técnica
seleciona os espermatozoides com melhor motilidade e morfologia. A seguir, demonstraremos as etapas
que envolvem a realização deste processo:
olivinilpirrolidona (PVP)
É uma substância viscosa que faz com que os espermatozoides se movimentem mais lentamente.
Depositamos em um tubo cônico 1,0mL do meio com maior densidade (90%), para formar a camada
inferior. Depois, cuidadosamente, adicionamos o mesmo volume do meio de menor densidade (45%) para
formar a camada superior.
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Por último, adicionamos, cuidadosamente, no máximo 3,0mL da amostra de sêmen liquefeita, sobre as
camadas.
Caso a amostra tenha mais de 3,0mL, indica-se fazer dois gradientes.
Em seguida, centrifugamos a amostra durante 20 minutos e, ao final, retiramos o pellet.
Após retirar o pellet, este é depositado em um tubo limpo e, em seguida, adicionamos entre 2,0 e 3,0mL de
meio de cultivo tamponado, para, então, seguir as mesmas etapas do sperm wash.
Finalizada essa etapa, realizamos uma nova análise da amostra para determinar a concentração e a
motilidade espermática resultantes.
Em amostras com contagens limítrofes de concentração e motilidade, podemos realizar um mini
gradiente, para o qual usamos 0,5mL, em invés de 1,0mL, de volume das camadas do gradiente e
adicionamos, no máximo, 1,0mL de sêmen.
Saiba mais
Essas três técnicas ‒ sperm wash, swim-up e gradiente descontínuo de densidade ‒ são as principais.
Entretanto, existem as variações, como, por exemplo, realizar um sperm wash na amostra e, com o pellet,
realizar o swim-up. Outra variação é realizar a técnica de gradiente descontínuo de densidade e, após a
segunda centrifugação, realizar o swim-up.
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Preparo seminal para casais sorodiscordantes
Em casais sorodiscordantes, nos quais pode ocorrer de apenas um cônjuge ser afetado, ou ambos, por uma
doença viral infecciosa sexualmente transmissível, e que necessitam realizar algum tratamento de
fertilização in vitro, realizamos a lavagem do sêmen com o intuito de retirar totalmente o plasma seminal da
amostra, pois é nele que se encontram as partículas virais.
Assim, diminuímos o risco de contaminação. As principais infecções que podem se beneficiar desse
preparo são HIV, hepatite B e hepatite C.
Nessas amostras de pacientes com carga viral positiva, realiza-se um gradiente descontínuo de densidade,
com dupla lavagem do pellet em meio de cultura tamponado, que podem ser seguidas por um swim-up,
dependendo da qualidade seminal.
Uma parte da amostra é congelada e a outra é enviada para a realização do exame de carga viral, o PCR
(Reação em Cadeia da Polimerase). Se o resultado desse exame for negativo, podemos utilizar a amostra
congelada em um tratamento de fertilização in vitro. Caso o resultado seja positivo, encaminhamos o
paciente para um infectologista.
Preparo seminal
Neste vídeo, a especialista fala sobre os objetivos do preparo seminal e apresenta as principais técnicas
utilizadas neste processo.
Ejaculação retrógrada
Alguns pacientes podem apresentar ejaculação retrógrada, na qual o volume do ejaculado não passa pelo
ducto deferente e acaba refluindo para a bexiga, sendo liberado na urina.

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Nesses casos, o paciente precisa realizar um preparo pré-coleta, com a ingestão de bicarbonato de sódio
em doses previamente recomendadas pelo médico, para manter o pH da urina neutro, e esvaziar a bexiga
duas horas antes da coleta. A coleta é feita por masturbação e, logo após, o paciente realiza a coleta de
urina em um frasco estéril.
Logo quando a urina chega ao laboratório, realizamos a leitura do pH, para verificar se ele não está ácido, o
que seria prejudicial aos espermatozoides. Depois, separamos a urina em tubos cônicos de 15mL e
centrifugamos. Todos os pellets são, então, colocados juntos em um novo tubo cônico, e a eles
adicionamos 5,0mL meio de cultivo tamponado para lavagem (sperm wash).
Retiramos o sobrenadante e realizamos uma nova lavagem. Após esse processamento, realizamos uma
análise da amostra para determinar a concentração e a motilidade dos espermatozoides.
Inseminação intrauterina (IIU)
A inseminação intrauterina é um tratamento de baixa complexidade para o qual manipulamos apenas o
sêmen, a fim de capacitá-lo. Esse processo é realizado no laboratório de andrologia e visa processar e
preparar o sêmen de forma que a amostra inseminada contenha os melhores espermatozoides. A IIU, em
geral, é um procedimento rápido e indolor, que não necessita de sedação.
Para esta técnica, elegemos o preparo seminal adequado de acordo com a qualidade da amostra seminal.
Uma vez terminada a etapa de preparo, a amostra capacitada resultante é carregada em uma seringa de
1mL e inseminada no útero da paciente por meio de um cateter previamente posicionado pelo médico.
Processo de inseminação intrauterina.
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Recomendação
A paciente deve estar com a bexiga cheia (para melhor posicionamento do útero) e em posição
ginecológica.08/02/2023 06:32 O Laboratório de Reprodução Humana Assistida
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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
O espermograma é um exame que fornece informações importantes sobre a produção de
espermatozoides e das funções secretoras das glândulas acessórias. Sobre esse exame, é correto
afirmar:
Parabéns! A alternativa B está correta.
Um único espermograma não é diagnóstico definitivo da qualidade seminal, uma vez que diferentes
amostras de um mesmo paciente podem apresentar variações e sofrer alterações devido à ação de
fatores externos. O período de abstinência indicado é de 2 a 7 dias.
A amostra passará por uma análise macroscópica, que consiste na verificação da presença de
coágulos, liquefação, viscosidade, aspecto, cor, pH, e volume seminal. Já na avaliação microscópica,
A Um único espermograma fornece diagnóstico definitivo da qualidade seminal.
B Consiste na avaliação de parâmetros macro e microscópicos.
C Avalia somente motilidade dos espermatozoides.
D Não avalia a morfologia dos espermatozoides.
E É indicada abstinência de 10 dias.
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observamos a concentração, motilidade dos espermatozoides e concentração de células redondas.
Questão 2
As técnicas de preparo seminal nos permitem preparar uma amostra com maior concentração de
espermatozoides e com melhor motilidade, e retirar as células germinativas, debris e espermatozoides
inviáveis.
Qual processamento realizamos em uma amostra com volume de 3,0mL, viscosidade normal, pH 7,2,
liquefação completa de 30 minutos, com concentração de 120 milhões /mL, 74% de motilidade
progressiva, sendo que o paciente possui sorologia de HIV reagente?
Parabéns! A alternativa E está correta.
Como o paciente possui HIV, realizamos o processamento para casais sorodiscordantes, no qual a
principal preocupação é a retirada de todo o plasma seminal, para que não haja carga viral na amostra.
Outro detalhe importante é que se trata de uma amostra com boa qualidade, ou seja, conseguimos
realizar todos os processamentos.
A Gradiente de densidade
B Swim-up +Lavagem
C Lavagem
D Swim-up + Gradiente
E Gradiente + lavagem + lavagem + Swim-up
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Assim para pacientes com carga viral positiva, realiza-se um gradiente descontínuo de densidade, com
dupla lavagem do pellet em meio de cultura tamponado, que podem ser seguidas por um swim-up,
dependendo da qualidade seminal.
2 - Laboratório de embriologia e técnicas de fertilização
in vitro
Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas de fertilização in vitro
Punção ovariana
Sabemos que as técnicas de alta complexidade são definidas pela necessidade de manipulação de oócitos
e embriões em laboratório, mas você sabe como são obtidos os oócitos?
Após a estimulação ovariana controlada, ocorre a punção ovariana com aspiração folicular para obtenção
dos oócitos. Com a paciente sedada e em posição ginecológica, o médico utiliza um transdutor de
ultrassom transvaginal com um guia acoplado.
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O ultrassom permite localizar os ovários e visualizar os folículos em seu interior, enquanto o guia permite o
movimento controlado de uma longa agulha, com a qual o médico puncionará cada folículo para aspirar
todo o líquido nele contido, tendo em mente que, teoricamente, cada folículo contém um oócito.
Saiba mais
É possível não encontrarmos oócito em alguns folículos, seja porque ele não se soltou da parede folicular e,
por isso, não foi aspirado ou porque o folículo realmente não continha oócito. Em alguns casos, pode
ocorrer o que chamamos de Síndrome do Folículo Vazio, quando nenhum ou a maioria dos folículos não
fornece oócito algum. Essa síndrome pode ter várias causas, sendo a maioria ligada à medicação da
estimulação ovariana controlada.
Ilustração 3D do processo de aspiração folicular.
Existem sistemas diferentes de aspiração folicular: com seringas (manualmente) ou com bombas de
aspiração automática. Independentemente da técnica utilizada, uma vez aspirado, o líquido folicular é
encaminhado ao laboratório de embriologia para ser analisado pelo embriologista.
Quando analisamos o líquido folicular (em uma placa, como na figura a seguir), buscamos o complexo
cumulus-oophorus (CCO), que, a olho nu, se apresenta como pequenas estruturas com aspecto semelhante
à clara de ovo.
A análise é feita com auxílio de um estereomicroscópio (ou “lupa”) e, com ele, conseguimos visualizar o
oócito no interior do CCO.
Uma vez verificada a presença de oócito, com uma pipeta Pasteur de vidro, transferimos esse CCO para
outra placa contendo meio de cultivo tamponado, na qual ficarão todos os CCOs identificados até o término
da análise de todo o líquido folicular aspirado pelo médico.
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Punção ovariana com esteroscoópio.
Uma vez finalizada a análise dos líquidos foliculares, os CCOs são trocados de placa, sendo, agora,
colocados em uma com meio de cultivo não tamponado, para serem incubados até a hora da denudação
enzimática/ mecânica ou da FIV convencional.
Fertilização in vitro (FIV) convencional
A FIV convencional é feita duas horas (h) após a punção oocitária e consiste em colocar os CCOs em
contato com os espermatozoides recuperados após processamento seminal, em placa e meio de cultivo
específicos.
Não existe consenso sobre uma concentração ideal de espermatozoides na amostra capacitada a ser
utilizada na FIV convencional, mas os profissionais costumam trabalhar com valores entre 50 e 500 mil
espermatozoides/mL, a depender da quantidade de CCOs a serem inseminados.
Por necessitar de uma quantidade mínima razoável de espermatozoides pós-capacitação, com boa
motilidade, não é um procedimento indicado em casos de fator masculino severo.
E como ocorre a fecundação nesta técnica?
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Denudação oocitária
A denudação do oócito nada mais é do que a retirada das células do cumulus e da corona radiata, o que
permite a verificação do estágio de maturação oocitária. É feita em duas etapas: química e mecânica.
A etapa química da denudação simula o que aconteceria na fecundação natural: lavamos os CCOs em uma
solução de hialuronidase, que, naturalmente, seria liberada pelo acrossomo do espermatozoide.
orona radiata
Células da corona radiada são aquelas células mais internas do cumulus, imediatas à zona pelúcida.
Denudação oocitária com pipetador stripper.
A fecundação ocorre
similarmente à natural, com
as células da granulosa (que
fazem parte do CCO)
desempenhando papel
fundamental na seleção do
espermatozoide que
conseguirá fertilizar o oócito
— motivo pelo qual elas não
são retiradas.
No dia seguinte à
coincubação dos gametas,
procedemos com a
denudação dos óvulos para
verificar se a fertilização
ocorreu. Um zigoto
corretamente fertilizado,
como já vimos, deve
apresentar dois pró-núcleos e
dois corpúsculos polares
entre 16 e 18h após a
fecundação.
Aqueles que apresentarem
fertilização incorreta são
descartados, enquanto os
outros são mantidos em
cultivo para que possamos
acompanhar seu
desenvolvimento até o
momento da criopreservação
ou transferência.
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Como consequência dessa lavagem, as interações celulares sãoenfraquecidas e as células do cumulus se
dissolvem. Dessa forma, as poucas células restantes do cumulus e as da corona radiata são retiradas de
forma mecânica.
Para isso, utiliza-se um pipetador, chamado stripper, ao qual acoplamos capilares com pontas bem finas
(135 - 170µm de diâmetro) e, com eles, fazemos rápidos movimentos de sugar e soltar os oócitos,
passando-os por diversas gotas de meio de cultivo tamponado, até vermos com clareza a zona pelúcida, o
espaço perivitelínico (que, nos oócitos maduros, contém o corpúsculo polar) e o citoplasma oocitário.
Após a etapa de denudação, os oócitos imaturos são descartados e os maduros podem ser criopreservados
ou submetidos à ICSI.
Fertilização in vitro com ICSI
A FIV com ICSI é realizada aproximadamente 4h após a punção ovariana, podendo haver variação nesse
tempo de acordo com o protocolo de cada clínica.
Para tal procedimento, preparamos uma placa específica com pequenas gotas de meio tamponado, na qual
são colocados os oócitos maduros, e uma gota de PVP, na qual é colocada uma pequena alíquota da
amostra contendo os espermatozoides capacitados.
Essas gotas são cobertas com óleo mineral ou de parafina, de uso específico para laboratórios de
reprodução assistida, para evitar evaporação dos meios. Essa placa é, então, levada ao microscópio com
sistema micromanipulador, em cujos suportes acoplamos microagulhas que nos permitem manipular os
gametas com precisão.
VP
É uma substância viscosa que faz com que os espermatozoides se movimentem mais lentamente.
Micromanipulador.
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Esse microscópio nos permite um aumento de até 400x, o que nos auxilia na avaliação da morfologia dos
espermatozoides para sua seleção. Apesar disso, alguns profissionais preferem trabalhar com aumento de
200x, por oferecer um campo mais amplo de visão.
Mas qual é o jeito correto para fazermos esta avaliação?
Resposta
Não existe certo ou errado ‒ como estamos vendo, os protocolos podem variar entre as clínicas e o modo
de trabalho de cada profissional, em várias etapas ‒, o importante é que o método de escolha seja validado
para a aplicação na rotina.
O sistema de micromanipulação pode ter injetores pneumáticos (cuja regulação dos movimentos é à base
de ar) ou hidráulicos (que usam óleo para regular os movimentos). Os injetores regulam a pressão de
aspiração/ejeção das microagulhas.
O sistema de micromanipulação tem dois sistemas injetores, um de cada lado: de um lado, conectamos a
microagulha de holding; com diâmetro maior, vai estabilizar o oócito na posição correta para ser injetado; do
outro lado, conectamos a agulha de injeção, com diâmetro menor e um bisel na ponta, e que será usada
para quebrar a cauda dos espermatozoides, aspirá-los e injetá-los nos oócitos.
Detalhe com as agulhas do micromanipulador.
O oócito deve ser posicionado de forma que o corpúsculo polar fique para cima ou para baixo (na posição
de 12h ou 6h), porque, teoricamente, o fuso meiótico estaria na porção citoplasmática próxima ao local em
que o corpúsculo foi expulso. Qualquer perturbação no fuso meiótico poderia ser prejudicial à conclusão da
meiose e ao posterior desenvolvimento do zigoto.
Dessa forma, essas posições oferecem menos risco de interferência no fuso quando a agulha de injeção
entra no oócito. Após a ICSI, os óvulos são transferidos para uma placa com gotas de meio de cultivo não
tamponado com pH e temperatura previamente equilibrados, e voltam para a incubadora.
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Saiba mais
A ICSI possibilita a fertilização do oócito em casos de fator masculino grave, uma vez que só precisamos de
um espermatozoide para ser injetado no interior de cada oócito.
Cultivo embrionário
Após o procedimento de fertilização in vitro, os óvulos voltam à incubadora e ali permanecem até o dia da
transferência ou criopreservação embrionária. A função das incubadoras é mimetizar as condições das
trompas e cavidade uterinas, que seriam o local de fertilização e desenvolvimento embrionário em
condições naturais.
O gás que supre as incubadoras ‒ seja apenas gás carbônico ou uma mistura desse gás com oxigênio e
nitrogênio ‒ tem a função de regular o pH do meio de cultivo, proporcionando aos embriões um pH
semelhante ao do ambiente uterino. Para regular o pH do meio, regulamos a porcentagem de gás injetado
na incubadora.
Quando aumentamos a concentração de gás, ao reagir com os componentes do meio de cultivo, ele o torna
ácido, diminuindo seu pH; quando diminuímos a concentração de gás, o pH do meio aumenta.
Existem diferentes tipos de incubadoras: verticais, de bancada, secas, úmidas, monogás, trigás, com
sistema de monitoramento ou sem. Vamos, agora, conhecer as principais.
Incubadoras verticais
Incubadora vertical.
As incubadoras verticais são mais antigas, mas ainda utilizadas em muitos laboratórios. Apesar das
incubadoras verticais oferecerem mais espaço para acomodar placas, são mais instáveis, uma vez que
possuem apenas uma porta e, ao abri-la, o ambiente de todas as placas é influenciado.
Além disso, a limpeza das incubadoras verticais é demorada e requer que elas sejam desmontadas para que
todas as peças sejam lavadas individualmente.
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Incubadoras de bancada
Já as incubadoras de bancada ocupam menos espaço e sua manutenção é mais rápida e simples, motivo
pelo qual elas vêm sendo a opção mais escolhida atualmente. Além disso, a limpeza das incubadoras de
bancada não requer retirada de peças.
Incubadoras de bancada - trigás.
Essas incubadoras, ainda que possuam modelos diferentes, costumam ter nichos separados e se
estabilizam mais rapidamente após a abertura das tampas.
Incubadoras de bancada com time-lapse
As incubadoras com sistema de monitoramento (sistema de time-lapse) são as mais modernas (e mais
caras) e, apesar de seu uso ser bastante comum nas clínicas dos países de primeiro mundo, no Brasil, ainda
ocupam um tímido espaço no mercado.
Incubadora de bancada com time-lapse.
As incubadoras com time-lapse são incubadoras de bancada com câmeras internas acopladas que
registram o desenvolvimento dos embriões, fotografando-os a cada período determinado
(aproximadamente 10 minutos).
Assim, forma-se um vídeo do desenvolvimento embrionário que nos permite analisar cada etapa do
processo. Essas incubadoras têm placas especiais de cultivo, projetadas de forma que os embriões
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permaneçam dentro do campo de abrangência da câmera, permitindo que as fotos sempre compreendam a
totalidade do embrião, para que nenhum detalhe seja perdido.
Saiba mais
As incubadoras com time-lapse, geralmente, possuem programas próprios que nos permitem marcar o
horário em que cada evento aconteceu ao analisar o vídeo: por exemplo, podemos registrar o momento de
aparecimento e desaparecimento dos pró-núcleos, da primeira divisão celular, de início e término da
compactação, de início da formação do blastocele, entre outros.
Como foi dito, a maioria das clínicas brasileiras possui incubadoras sem sistema de monitoramento. Dessa
forma, para acompanharmos o desenvolvimento embrionário, é necessário retirar a placa da incubadora e
levá-la ao microscópio. Assim, observamos e anotamos cada estágio pontualmente.
Lembrando que, nessas placas, os embriões se encontram em meio de cultivo não tamponado; por isso, o
procedimento de observação deve ser rápido (menos de dois minutos, idealmente) para não desestabilizar
as condições de pH e temperatura nas quais os embriões se encontram.
As observações estáticas não nospermitem saber o que aconteceu previamente ao que estamos
observando, por exemplo: se, ao avaliar a fertilização, o zigoto apresenta apenas um pró-núcleo, não temos
como saber se é apenas um caso de assincronia, de singamia, ou se, realmente, só houve aparição de um
pró-núcleo.
Essa é uma vantagem do sistema de monitoramento que nos permitiria esclarecer essa dúvida ao
analisarmos os registros feitos, que nos oferecem observação dinâmica.
Como nosso objetivo é tirar os embriões das incubadoras, o mínimo possível para não os expor às
condições ambientes, fazemos observações estáticas em momentos críticos do desenvolvimento:
bservações estáticas
Aquelas que fazemos apenas quando retiramos a placa da incubadora e observamos os embriões ao
microscópio.
ssincronia
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Assincronia da aparição dos pró-núcleos é quando os pró-núcleos feminino e masculino aparecem em tempos
diferentes.
ingamia
União dos pró-núcleos, formando um envoltório nuclear único.
bservação dinâmica
É aquela oferecida pelo sistema de monitoramento de time-lapse, em que vemos um vídeo do desenvolvimento,
e não apenas uma “foto" de um momento pontual.
No primeiro dia (D1)
Para verificar se a fertilização ocorreu corretamente
No terceiro (D3) e no quinto dia (D5)
Caso o cultivo seja até o estágio de blastocisto.
Situações especiais incluem observação no segundo dia (D2) ‒ geralmente se o cultivo for até D3, para
termos mais dados sobre a evolução do embrião ‒ e no sexto ou sétimo (D6/ D7), caso o embrião não tenha
alcançado o estágio de blastocisto no quinto dia.
Saiba mais
É incomum observarmos o quarto dia de desenvolvimento, a não ser que seja necessário obter mais
informações, a fim de tomar alguma decisão sobre transferência ou criopreservação. Não é incomum que
os embriões atrasem um pouco seu desenvolvimento e acabem alcançando o estágio de blastocisto
expandido no sexto ou ‒ apesar de menos frequente ‒ sétimo dia de cultivo.
Transferência embrionária

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A última etapa do tratamento de fertilização in vitro que envolve o laboratório é a transferência embrionária.
Para esse procedimento, os embriões a serem transferidos se encontram, inicialmente, em uma placa com
meio de cultivo, que permanece na incubadora até o momento da transferência.
O preparo da paciente para a transferência embrionária requer que ela esteja com a bexiga cheia para ajudar
no posicionamento e visualização do útero. Na anatomia feminina sem alterações, o útero é anterovertido e
localizado atrás da bexiga. Quando a bexiga enche, "empurra" o útero, deixando-o mais alinhado com o canal
vaginal, o que facilita a passagem do cateter contendo o(s) embrião(ões).
nterovertido
Flexionado para a “frente" do corpo, sobre a bexiga, formando um ângulo de aproximadamente 90º com o canal
vaginal.
Útero em posição normal (anterovertido).
A transferência embrionária não requer sedação, salvo alguma indicação médica específica. A paciente é
preparada em posição ginecológica e, com auxílio de ultrassonografia abdominal, o médico insere um fino
cateter guia pelo canal vaginal, atravessando o colo uterino e posicionando-o, por fim, a alguns centímetros
do fundo do útero.
Atenção!
Apesar de, em geral, ser um procedimento rápido e indolor, a paciente pode sentir uma leve cólica durante o
posicionamento do cateter-guia, especialmente durante a passagem pelo colo do útero e, principalmente, se
houver estenose. Também pode ser um procedimento incômodo e um pouco mais demorado se a anatomia
uterina for alterada.
stenose
Estreitamento do colo do útero, colo muito “fechado”. Em alguns casos, é necessário dilatar o colo com um
aparelho especial para permitir a passagem do cateter.
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Uma vez que o cateter-guia esteja devidamente posicionado, é o momento do embriologista trazer o cateter
interno contendo os embriões a serem transferidos. Esse cateter passa por dentro do cateter-guia
previamente posicionado e avança um pouco mais, ficando a aproximadamente 1cm de distância do fundo
uterino, local onde os embriões serão depositados.
Se os embriões forem depositados muito próximos ao fundo do útero, o risco de gravidez ectópica
aumenta; por isso, a distância de aproximadamente 1cm é recomendada.
ravidez ectópica
É definida pela implantação do embrião em local que não seja a cavidade uterina. O local mais comum de se
ocorrer gravidez ectópica é nas trompas de Falópio, mas também pode ocorrer no cérvix (colo), ovários e até
mesmo no abdômen, fora do útero. O feto não sobrevive à gravidez ectópica.
Embriologista carregando um cateter para transferência embrionária.
No laboratório, o embriologista lava o cateter com meio de cultivo, aspirando o meio com uma seringa de
1mL, acoplando-a ao cateter e pressionando seu êmbolo, para que o meio corra por dentro do cateter.
Uma vez terminada essa etapa de lavagem (que é opcional e pode variar de acordo com o protocolo local), a
seringa permanece acoplada no cateter e, para carregar os embriões, o embriologista deve pegar na
incubadora a placa na qual eles estão contidos e aspirá-los na extremidade do cateter oposta à qual a
seringa está acoplada. O cateter contendo os embriões é, então, levado até o médico.
Após o devido posicionamento do cateter trazido pelo embriologista, o médico (ou o embriologista, a
depender do protocolo local) pressiona a seringa delicadamente para depositar os embriões no local
desejado. Apesar de haver diferenças nos protocolos de carregamento do cateter, é costumeiro deixar uma
pequena bolha de ar antes e/ou depois dos embriões.
E você sabe por que isso é feito? 
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Isso é feito porque o ar, quando visualizado no ultrassom, fica branco, o que ajuda a referenciar a
posição dos embriões no útero após a transferência, uma vez que os embriões em si não podem ser
visualizados na imagem do ultrassom.
Terminada a transferência, o cateter é retirado e entregue ao embriologista, que o levará ao laboratório para
verificar se os embriões não ficaram grudados no cateter. Caso isso aconteça, o processo é refeito e os
embriões são transferidos novamente.
A transferência embrionária pode ser realizada no ciclo a fresco ou em um ciclo com embriões
descongelados e preparo endometrial específico. O estágio de desenvolvimento dos embriões a serem
transferidos varia de acordo com o caso. Essa é uma decisão conjunta da equipe médica e de
embriologistas, que vão sugerir a melhor conduta em cada caso, respeitando, claro, a decisão dos
pacientes.
Transferência embrionária
Neste vídeo, a especialista explica os detalhes da transferência embrionária.

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Os oócitos são obtidos por punção ovariana com aspiração do líquido folicular. Uma vez aspirado, o
líquido folicular é encaminhado ao laboratório de embriologia para ser analisado pelo embriologista. O
que o embriologista procura identificar no líquido folicular?
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Parabéns! A alternativa C está correta.
No líquido folicular, o embriologista identifica o oócito envolto pelas células da granulosa, CCO
(complexo cumulus-oophorus), que se apresenta como pequenas estruturas com aspecto semelhante à
clara de ovo.As células da granulosa (que fazem parte do CCO) desempenham papel fundamental na seleção do
espermatozoide que conseguirá fertilizar o oócito.
Questão 2
Os tratamentos de reprodução assistida podem ser de alta ou baixa complexidade. Um dos tratamentos
de alta complexidade é caracterizado por injetar um único espermatozoide no interior de cada oócito
maduro, sendo este previamente denudado. Sobre esse procedimento, considere as afirmativas a
seguir:
I- Trata-se do procedimento de FIV com ICSI.
II- Para esse procedimento, costuma-se posicionar o oócito com o corpúsculo polar na posição de 3h
ou 9h, para que o espermatozoide não seja injetado de uma forma que perturbe o fuso meiótico.
III- Para esse procedimento, não é necessário nenhum equipamento específico além da lupa
(estereomicroscópio).
IV- Qualquer perturbação no fuso meiótico poderia ser prejudicial à conclusão da meiose e ao posterior
desenvolvimento do zigoto.
A Oócitos sem células à sua volta
B Óvulos
C Complexo cumulus-oophorus
D Embriões
E Apenas células da granulosa oocitária
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Estão corretas as afirmativas:
Parabéns! A alternativa B está correta.
Para a FIV com ICSI, o oócito deve ser posicionado com o corpúsculo polar para cima ou para baixo
(posição das 12h ou 6h), sendo necessário um sistema de micromanipulação e microscópio com
aumento de 200-400x. Portanto, as afirmativas I e IV estão corretas.
A I, II e III
B I e IV
C II e III
D I, II e IV
E II e IV
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3 - Técnicas especiais empregadas no laboratório de
embriologia
Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer as técnicas especiais empregadas no
laboratório de embriologia clínica.
Técnicas alternativas de obtenção de espermatozoides
Até agora falamos sobre pacientes que possuem espermatozoides no ejaculado; porém, existem os
pacientes azoospermicos, ou seja, que apresentam ausência de espermatozoides no ejaculado.
Os casos de azoospermia podem ser classificadas como azoospermia não obstrutiva ou azoospermia
obstrutiva.
Azoospermia obstrutiva
Nestes casos, a espermatogênese e os níveis hormonais de FSH, LH e testosterona são normais. O que
ocorre é a obstrução no sistema de dutos de transporte dos espermatozoides, impedindo a passagem
desses gametas. Pode ser causada por vasectomia, traumas, epididimites, cirurgias inguinais, entre
outras causas.
Azoospermia não obstrutiva
Nestes casos não ocorre a espermatogênese.
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É indicativo de que, em algum momento, houve uma agressão ao testículo — como a varicocele,
orquite, criptorquidia, quimioterapia, entre outras causas.
asectomia
Cirurgia de esterilização masculina, na qual o médico corta os ductos deferentes, responsáveis por levar os
espermatozoides dos testículos ao pênis.
pididimites
Inflamações no epidídimo.
Nesses casos de azoospermia no ejaculado, uma alternativa é tentar a obtenção de espermatozoides por
métodos cirúrgicos. Dentre os métodos de recuperação cirúrgica de espermatozoides, encontram-se:
Neste método, também conhecido como PESA (na abreviação do termo em inglês), o epidídimo é
puncionado com uma pequena agulha e seringa para retirada dos espermatozoides.
Esquema mostrando a aspiração de espermatozoides pela técnica de PESA.
É no epidídimo que os espermatozoides completam sua maturação; por isso, é a técnica mais
utilizada em casos de azoospermia obstrutiva ou vasectomia.
Aspiração Percutânea de Espermatozoides do Epidídimo 
Aspiração Microcirúrgica de Espermatozoides do Epidídimo 
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A técnica conhecida como MESA (na abreviação em inglês) segue o mesmo princípio da PESA,
porém com um grau maior de complexidade, uma vez que o urologista utiliza um microscópio para
localizar os espermatozoides no epidídimo. Essa técnica é utilizada em casos especiais, como
epidídimos de volume reduzido.
A figura ilustra a ampliação do epidídimo, local em que os espermatozoides são coletados por aspiração.
Esta técnica, conhecida como TESA (na abreviação em inglês), é indicada em casos de azoospermia
obstrutiva e não obstrutiva, impossibilidade de ejaculação e ausência de espermatozoides em
amostras do epidídimo, esta técnica consiste em aspirar parênquima testicular.
Esquema mostrando a aspiração de espermatozoides pela técnica de TESA.
A amostra aspirada segue para o laboratório, onde é feita a dissecção dos túbulos seminíferos para
confirmar a presença de espermatozoides. Também está indicada nos casos de suspeita de defeito
de maturação dos espermatozoides (que ocorre no epidídimo).
Aspiração de Espermatozoides do Testículo 
Extração de Espermatozoides do Testículo 
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Esta técnica, conhecida como TESE (na abreviação em inglês), também é utilizada para obtenção de
parênquima testicular (como na TESA). Nesse método é feita a biópsia de um pequeno fragmento de
parênquima testicular, retirado com pinça ou tesoura, após pequenas incisões.
Esquema mostrando a biopsia do tecido - extração de um pequeno fragmento de parênquima testicular durante a TESE.
O fragmento retirado segue o mesmo processamento laboratorial que a TESA, ou seja, é dissecado
até que permita a visualização dos túbulos seminíferos.
A técnica conhecida como micro-TESE (na abreviação em inglês), é semelhante à TESE. Seu
diferencial é que esta técnica utiliza um microscópio cirúrgico que permite melhor visualização dos
túbulos seminíferos e identificação das áreas com maior probabilidade de produção ativa de
espermatozoides (espermatogênese).
Microdissecção do testicular realizada na Micro-TESE. A espermatogênese provavelmente é mais ativa na imagem superior.
zoospermia obstrutiva
Causada por alguma obstrução nos canais do sistema reprodutor masculino, que impediria a passagem e
ejaculação dos gametas.
Extração de Espermatozoides do Testículo por Microdissecção 
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Nos casos de PESA ou MESA, podemos realizar a técnica de sperm wash na amostra, a fim de concentrar os
espermatozoides. Nessas técnicas geralmente são encontrados poucos espermatozoides, e com baixa
motilidade. Quando há necessidade de realizar essas técnicas para a obtenção dos espermatozoides,
realiza-se obrigatoriamente a ICSI.
Nessas amostras, também podemos realizar o teste hiposmótico (HOS). Nesse caso, com o auxílio da
agulha de ICSI, colocamos somente a cauda do espermatozoide na solução e verificamos se ocorre o
inchaço seguido de uma curvatura na cauda, indicando viabilidade celular.
Outro teste que podemos realizar nessas amostras é o teste de flexibilização da cauda. Com o auxílio de
uma agulha de ICSI, manipulamos a cauda do espermatozoide para cima e para baixo: os espermatozoides
que obtiverem um movimento da cauda independente da cabeça podem ser utilizados.
Quando há movimento de toda a estrutura do espermatozoide, considera-se o espermatozoide inviável para
o procedimento.
Técnicas alternativas de seleção espermática
Existem algumas técnicas para seleção de espermatozoides que se baseiam em características específicas.
Vamos conhecê-las?
PICSI
Abreviação do termo em inglês que designa Injeção Intracitoplasmática Fisiológica de Espermatozoide,
essa técnica tem por objetivo selecionar espermatozoides teoricamente livres de fragmentação de DNA. Um
alto índice de fragmentaçãodo DNA espermático pode reduzir as chances de gravidez, causar abortos ou
síndromes genéticas.
Para sua realização, os espermatozoides são colocados em uma placa específica contendo ácido
hialurônico. O princípio é que espermatozoides maduros se ligariam ao ácido. Entretanto, não existem
estudos comprovando que espermatozoides maduros apresentam menores índices de fragmentação em
seu DNA.
Dessa forma, é necessário que mais estudos sobre essa relação sejam realizados, uma vez que até o
momento eles não mostram diferenças significativas nas taxas de nascidos vivos com espermatozoides
selecionados por PICSI ou por ICSI.
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Super ICSI/ IMSI
Seleciona espermatozoides baseando-se em sua morfologia, eles são analisados e escolhidos pelo
embriologista com ajuda de uma magnificação de 6000 vezes — aproximadamente 10 vezes mais do que
em uma ICSI comum.
Apesar dessa alta magnificação proporcionada, essa tecnologia não garante que o espermatozoide
selecionado será geneticamente saudável, uma vez que não é possível verificar sua carga genética, apenas
sua morfologia.
Micro�uídica
Atualmente com uso crescente no mercado, essa técnica é baseada na capacidade dos espermatozoides
de nadarem através de microcanais. Dessa forma, seleciona espermatozoides baseando-se em sua
morfologia e motilidade, sem os efeitos negativos causados pela centrifugação. Também tem se mostrado
eficiente em selecionar espermatozoides com DNA íntegro.
Saiba mais
A centrifugação — necessária em técnicas como gradiente de densidade e sperm wash — tem efeito
prejudicial na integridade espermática, especialmente por aumentar os índices de fragmentação de DNA.
Técnicas alternativas de seleção espermática
Neste vídeo, a especialista apresenta as principais alternativas de seleção espermática, demonstrando seu
passo a passo, aplicação e vantagens e desvantagens.

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Assisted Hatching (Eclosão Assistida)
Já comentamos sobre esse termo em momentos anteriores, mas agora vamos retomá-lo e explicá-lo com
mais detalhes.
Na fecundação natural, o oócito é fertilizado nas trompas, vai se dividindo e multiplicando suas células
enquanto se desloca em direção ao útero. Quando chega na cavidade uterina, por volta do quinto dia de
desenvolvimento, rompe a zona pelúcida e o trofoblasto começa a invadir o endométrio, no processo
chamado de nidação, que define o início da implantação do embrião.
O rompimento da zona pelúcida (eclosão) ocorre porque, quando o embrião atinge o estágio de blastocisto,
ele continua multiplicando suas células e aumentando o tamanho da blastocele. Esse aumento do tamanho
do embrião, como um todo, vai pressionando a zona pelúcida por dentro, que vai afinando até o momento da
eclosão.
Também é comum que o embrião passe por algumas contrações e reexpansões para auxiliar o processo de
eclosão. É assim que o trofoblasto fica livre para iniciar o processo de implantação.
Contudo, em alguns casos, a zona pelúcida pode apresentar condições que dificultam seu afinamento e
eclosão do embrião. Isso acontece, por exemplo, em embriões desvitrificados, uma vez que o processo de
criopreservação “endurece" a zona pelúcida, de modo que ela perde sua “elasticidade" e, portanto, o embrião
tem mais dificuldade para eclodir.
Nesse caso, pode ser que ele precise de um número maior de contrações e reexpansões do que precisaria
naturalmente — gastando mais energia celular, o que pode ser prejudicial no momento da implantação
(outro processo que requer energia) — e, às vezes, pode nem conseguir eclodir, o que resultaria em
impossibilidade de implantação, uma vez que o trofoblasto precisa estar exposto para iniciar a nidação no
endométrio.
Zonas pelúcidas mais espessas, escuras ou densas que o ideal, também prejudicam a eclosão embrionária.
Assim sendo, nos casos em que a zona pelúcida do embrião apresente características que possam ser
prejudiciais à eclosão, realizamos um procedimento chamado de assisted hatching (AH), com o intuito de
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facilitar a saída do embrião e, consequentemente, sua implantação. Esse procedimento pode ser feito de
três formas: química, mecânica e com laser.
Ilustração demonstrando o procedimento de AH.
Após o procedimento de AH, o embrião é transferido ao útero da paciente, e agora conseguirá sair da zona
pelúcida e se implantar no endométrio mais facilmente.
AH químico
Uma pequena abertura é feita na zona pelúcida, com ácido de Tyrode.
AH mecânico
Também conhecido como dissecção parcial da zona (PZD), esse método consiste em fazer
uma pequena incisão na zona pelúcida, com auxílio de microagulhas. Foi o primeiro método
de AH utilizado.
AH com laser
Método mais utilizado atualmente, consiste em abrir um orifício na zona pelúcida do embrião
com auxílio de pulsos de laser. Para isso, é necessário um equipamento especial acoplado ao
micromanipulador.
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Falta pouco para atingir seus objetivos.
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Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Vimos que existem algumas técnicas para seleção de espermatozoides que se baseiam em
características específicas. Em relação a elas, assinale as afirmativas a seguir:
I. A PICSI tem por objetivo selecionar espermatozoides teoricamente livres de fragmentação de DNA.
II. A super ICSI/ IMSI seleciona espermatozoides baseando-se em sua morfologia, com um aumento de
6000 vezes.
III. A super ICSI é capaz de selecionar espermatozoides geneticamente saudáveis.
É correto o que se afirma em:
Parabéns! A alternativa D está correta.
A super ICSI não garante que o espermatozoide selecionado será geneticamente saudável, pois, mesmo
com a alta magnificação proporcionada, essa tecnologia não consegue verificar sua carga genética,
apenas sua morfologia. Portanto, as afirmativas I e II estão corretas.
A I
B II
C III
D I e II
E I e III
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Questão 2
Nos casos em que a zona pelúcida do embrião apresente características que possam ser prejudiciais à
sua eclosão, realizamos um procedimento chamado de assisted hatching (AH). Sobre essa técnica, é
correto afirmar que:
Parabéns! A alternativa A está correta.
AH químico é feito por uma pequena abertura na zona pelúcida, com ácido de Tyrode. Já o AH
mecânico, também conhecido como dissecção parcial da zona (PZD), consiste em fazer uma pequena
incisão na zona pelúcida, com auxílio de microagulhas. Foi o primeiro método de AH utilizado.
AH com laser: Método mais utilizado atualmente, consiste em abrir um orifício na zona pelúcida do
embrião com auxílio de pulsos de laser. Para isso, é necessário um equipamento especial acoplado ao
micromanipulador.
A Pode ser feita de três formas: química, mecânica e com laser.
B O método mais utilizado de AH hoje em dia é o químico.
C O AH com laser também é conhecido como PZD.
D
O AH mecânico consiste em abrir um orifício na zona pelúcida do embrião e, para sua
realização, é necessário um equipamento especial acoplado ao micromanipulador.
E
O AH químico consiste em fazer uma pequena incisão na zona pelúcida e requer o
auxílio de microagulhas para ser realizado.
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Considerações �nais
Vimos que, nolaboratório de andrologia, podem ser realizados diversos métodos de análise e preparo
seminal, tanto diagnósticos quanto terapêuticos. A escolha do processamento seminal depende do
procedimento que será realizado e da qualidade da amostra.
Já no laboratório de embriologia, acontecem todas as técnicas em que há manipulação de oócitos e
embriões, como fertilização in vitro e as etapas que a antecedem, cultivo embrionário e preparo do cateter
para transferência dos embriões.
Além disso, existem técnicas especiais que têm o objetivo de auxiliar no sucesso do tratamento de
reprodução assistida, como a obtenção cirúrgica de espermatozoides, as técnicas alternativas de seleção
espermática e a técnica de eclosão assistida. Todas essas técnicas são realizadas pelos embriologistas.
O laboratório de reprodução assistida é o coração da clínica, onde acontecem os eventos mais importantes.
Por isso, deve ser um ambiente com rigoroso controle de qualidade e com profissionais capacitados.
Podcast
Antes de finalizarmos, a biomédica Beatriz Campos bate um papo com a biomédica Ana Clara Esteves sobre
a sua experiência no laboratório de Andrologia e embriologia.
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Referências
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ESTEVES, S.C. et al. An update on sperm retrieval techniques for azoospermic Clinics Review. 68(S1), pp.
99-110.
ESTEVES, S.C.; ROQUE, M. Extended indications for sperm retrieval: summary of current literature. F1000
Research, 2019, pp. 1-12.
GOSPODINOVA, M. et al. Developing a method for sperm selection trough Cumulus Ligands. Annual of Sofia
University “St. Kliment Ohridski” Faculty of Biology Book 4 — Scientific Sessions of the Faculty of Biology
2019, volume 104, pp. 335-347.
KEEL, B.A.; MAY,J.V.; JONGE, C.J. Handbook of the assisted reproduction laboratory. Florida: CRC press LLC,
2000.
PAREKATTIL, S. J. et al. Male infertily. Sperm Processing and Selection, 2020.
SIMON, L. et al. Sperm DNA fragmentation: consequences for reproduction. Advances in Experimental
Medicine and Biology. 2019.
The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Sperm retrieval for obstructive
azoospermia. American Society for Reproductive Medicine. 2006; 86(Suppl 4):S115–120.
OMS. Laboratory manual for the examination and processing of human semen. 6. ed. Geneva: World Health
Organization, 2021.
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Para aprofundar seus conhecimentos sobre o tema:
Leia o manual de laboratório da OMS para exame e processamento do sêmen humano. Disponível no site do
PNCQ.
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Leia Sperm Preparation and Selection Techniques, de Beydola e colaboradores, e Sperm processing and
selection, de Sharma e Agarwal (2020), para aprofundar seus conhecimentos em técnicas de separação e
seleção espermática.
Leia o artigo Sperm Retrieval Techniques for Assisted Reproduction, de Esteves e colaboradores (2011), para
mais detalhes sobre as técnicas especiais de coleta de espermatozoides.