BIOTECNOLOGIA E BIOINFORMÁTICA ROTEIRO 6 DESENHO DE INICIADORES (PRIMERS) PARA PCR UTILIZANDO SOFTWARES ONLINE DE BIOINFORMÁTICA

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Roteiro de Aula Prática 
Código e nome da disciplina 
 
 
 
 
Título da Prática: 
 
 
 
 
Objetivos da aula (2 a 4) (apresentar as expectativas de aprendizagem do aluno ao final 
da atividade): 
 
1) Relembrar a função e a importância da amplificação gênica através do protocolo 
de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), a fim de enxergar o papel dos primers 
nesse processo. 
2) Entender a razão pela qual a construção de primers de qualidade é necessária 
para protocolos de detecção, clonagem e sequenciamento genômico. 
3) Aplicar os conhecimentos teóricos adquiridos em sala de aula sobre 
biotecnologia em ferramentas de bioinformática específicas para o desenho de 
primers, objetivando a aquisição de competência nessa área tão essencial para 
o profissional moderno. 
4) Verificar o aprendizado dos discentes através da desenvoltura ao utilizar as 
ferramentas em bioinformática aplicadas durante esta aula, sanado eventuais 
dúvidas e dificuldades do processo. 
 
Material necessário para a aula (equipamentos e insumos): 
 
- Laboratório de informática com um computador disponível por aluno; 
- Internet de qualidade disponível para a utilização das ferramentas em 
bioinformática. 
 
Procedimentos (apresentar com clareza e objetividade a atividade a ser realizada): 
 
O professor poderá iniciar essa aula explanando brevemente sobre a importância e 
de se construir bons primers em biotecnologia/bioinformática, para, em seguida, 
orientar os comandos que os alunos devem seguir utilizando essa base de dados. 
Segue, abaixo, uma sugestão de introdução, seguido dos comandos: 
ARA0484 - BIOTECNOLOGIA E BIOINFORMÁTICA (PRESENCIAL - 100% PRESENCIAL) 
Desenho de Iniciadores (Primers) para PCR Utilizando Softwares Online de 
Bioinformática 
 
 
O desenho ou projeto de primers tem por função permitir a detecção, clonagem ou 
sequenciamento de fragmentos específicos de DNA. 
Para esta aula, faremos uso do software Oligo Perfect Designer, da 
Thermofisher®, para projetar primers: 
1. Acessar o site https://apps.thermofisher.com/apps/oligoperfect/#!/design 
2. Colar a sequência de DNA para a qual se deseja projetar primers na caixa 
adequada (Target sequence, Formato FASTA). 
3. Selecionar a aplicação desejada para o primer (PCR: Cloning para clonagem; PCR: 
Detection para detecção; e Sequencing para sequenciamento). Preencher as caixas 
opcionais, informando o nome da sequência e o nome do pesquisador, caso 
necessário. 
Clicar em “Design Primers”. 
Dica: a seleção de uma aplicação não necessariamente restringe o uso do primer 
projetado àquela aplicação. A seleção é importante somente para que o programa 
permita ao usuário informar as características típicas para cada tipo de PCR. Por 
exemplo: caso a aplicação selecionada seja PCR: Cloning, a próxima página do 
programa exigirá que o usuário informe o fragmento exato a ser amplificado, 
indicando o nucleotídeo de início e de término. Já em PCR: Detection, o programa 
pede apenas o tamanho do fragmento a ser detectado e qual região da sequência 
deve ser considerada, permitindo ao programa a busca pelos melhores pares de 
primers dentro dessa região. 
4. Para primers visando à clonagem (opção PCR: Cloning), definir a região a ser 
clonada. Lembrar que, neste caso, os primers começarão e terminarão exatamente 
nos nucleotídeos definidos. Para primers visando a detecção (opção PCR: 
Detection), definir tanto a região a ser analisada em busca de primers quanto o 
tamanho do fragmento a ser amplificado. Lembrar que, neste caso, o programa 
buscará primers que estejam dentro dos parâmetros definidos, podendo haver 
variação do nucleotídeo de início e de término. 
Para primers para sequenciamento (opção Sequencing), definir a região a ser 
sequenciada (Sequencing Region), a sequência inicial para anelamento do primeiro 
primer (Primer Position: Lead) e o número de nucleotídeos de intervalo entre cada 
primer (Spacing). Lembrar que, neste caso, serão gerados primers em intervalos 
regulares. 
Clicar em “Submit”. 
Dica: inicialmente, não alterar os outros parâmetros. Caso o programa não 
encontre primers dentro dos parâmetros iniciais (mensagem “No primers could be 
found within your specified parameters. Please loosen your parameters and try 
again”), tente aumentar a Tm (Primer Tm (°C)) máxima e diminuir a mínima (por 
 
 
exemplo, para 65 e 55, respectivamente). Também pode ser necessário indicar 
outra região da sequência para ser analisada. 
5. Analisar os resultados. O programa indica a porcentagem de GC (%GC), se o 
primer é direto ou reverso (Strand), tamanho (Size) e Tm (Tm oC). Clicar em 
“Highlight Target Sequence” para ver onde os primers anelam na sequência-alvo. 
Dica: primers ideais tem em torno de 50% de GC, tamanho de 20 pares de bases e 
Tm em torno de 60 ºC. 
 
 
Observações (colocar, caso necessário, os pontos de atenção referentes à atividade 
prática desenvolvida): 
 
É importante mencionar nessa aula que para a construção de um primer, é 
necessário se conhecer a sequência de nucleotídeos do organismo que se deseja 
amplificar, clonar, sequenciar... Para tanto o professor pode utilizar o aprendizado 
adquirido na aula prática anterior (Explorando a Plataforma NCBI) para solicitar aos 
alunos que escolham sozinhos, através da plataforma em bioinformática NCBI, a 
sequência de nucleotídeos de algum organismo do interesse deles, os quais podem 
ser de plantas, animais, espécie humana, vírus (novo coronavírus), dentre outras 
possibilidades. Assim cada aluno poderá construir, de forma independente, os 
primers do seu interesse.