dissertacao----baccharis-trimera-less-dc-estudo-fitoquimico-e-avaliacao-da-citotoxicidade

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" 
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
CÂMPUS DE ARARAQUARA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Baccharis trimera (Less) DC.: estudo 
fitoquímico e avaliação da citotoxicidade 
 
 
 
 
 
 
 
JOSIANE CLARICE CLAUDINO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ARARAQUARA - SP 
2013 
 
2 
 
 
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" 
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
CÂMPUS DE ARARAQUARA 
 
 
 
 
 
Baccharis trimera (Less) DC.: estudo 
fitoquímico e avaliação da citotoxicidade 
 
 
 
 
JOSIANE CLARICE CLAUDINO 
 
 
 
 
 
 
Orientador: Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos 
Co-orientador: Prof. Dr. Luís Vítor Silva do Sacramento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ARARAQUARA - SP 
2013 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa 
de Pós-graduação em Ciências 
Farmacêuticas, da Faculdade de 
Ciências Farmacêuticas, UNESP, como 
parte dos requisitos para obtenção do 
Título de Mestre em Ciências 
Farmacêuticas. 
 
 
 
 
3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
 
Dedicatória 
 
 
Dedico este trabalho aos meus queridos pais, Josias e Clarice, por 
terem sempre me apoiado e me proporcionado tudo nessa vida, 
alem de serem os meus exemplos de amor, dedicação e coragem 
para enfrentar os desafios que a vida nos proporciona. 
 
Aos meus irmãos Elias e Adilson que sempre me incentivaram 
e estiveram do meu lado. 
 
Dedico, ainda, ao meu companheiro de todas as horas Márcio 
Leme “TE AMO”. 
 
A vocês, a minha eterna gratidão! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
 
Agradecimentos 
 
 
A Deus pelo seu amor, pela oportunidade desta existência, pela saúde, sua 
presença e proteção em todos os momentos; 
 
Ao Professor Doutor André Gonzaga dos Santos, pela sua dedicação, paciência 
em ensinar e amizade; 
 
A0 grupo Lapdesf e farmacognosia pela harmoniosa convivência; 
 
 Aos técnicos Eduardo, Mateus e Caio pela prontidão com que sempre me 
ajudavam; 
 
Ao laboratório de Citologia, especialmente a Professora Doutora Christiane 
Pienna Soares por abrir a porta do seu laboratório para que eu 
pudesse realizar os meus experimentos e aos amigos Mauro, Felipe, 
Francieli, Flávio e Juliana; 
 
Aos grandes amigos do Laboratório de Farmacognosia Elaíse, Ana, 
Isabela, Alexandre, Natália, Gabrielle e tantos outros que por aqui 
passaram; 
 
As minhas amigas e parceiras Lígia e Mariana; 
 
As minhas adoráveis amigas da República das “Crôs” Andreza, 
Meri, Adriana e Josiane muito obrigado por me ouvirem horas 
afim; 
 
À pós-graduação em Ciências farmacêuticas da Universidade 
Estadual Paulista – Araraquara; 
 
À Capes pela bolsa concedida; 
 
 
 
 
6 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Ame muitas coisas, porque em amar está a verdadeira força. 
Quem ama muito conquistará muito, e o que for feito com amor estará bem feito.” 
Vincent Van Gogh 
 
7 
 
SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................................... 16 
2. REVISÃO DA LITERATURA.............................................................................................................. 17 
 2.1 Baccharis trimera (Less) DC...................................................................................................... 17 
 2.2 Principais classes de metabólitos secundários que ocorrem em B. trimera (Less) DC.... 29 
 2.2.1 Terpenos ............................................................................................................................ 29 
 2.2.1.1 Biossíntese de terpenos............................................................................................... 30 
 2.2.1.2 Via do mevalonato........................................................................................................ 31 
 2.2.1.3 Via triose-piruvato......................................................................................................... 31 
 2.2.2 Flavonoides........................................................................................................................ 31 
 2.2.3 Derivados do ácido quínico e ácido cafeico....................................................................... 34 
 2.3 Considerações gerais sobre o câncer...................................................................................... 35 
 2.3.1 Ensaio de citotoxicidade..................................................................................................... 37 
3. OBJETIVOS........................................................................................................................................ 38 
 3.1 Objetivo geral.............................................................................................................................. 38 
 3.2 Objetivos específicos................................................................................................................. 38 
4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................. 39 
 4.1 Especificações dos materiais e equipamentos....................................................................... 39 
 4.1.1 Fitoquímica......................................................................................................................... 39 
 4.1.2 Ensaio de citotoxicidade..................................................................................................... 41 
 4.2 Material vegetal........................................................................................................................... 41 
 4.3 Extração....................................................................................................................................... 42 
 4.3.1 Extrato acetato de etila....................................................................................................... 42 
 4.3.2 Extrato etanólico 95%......................................................................................................... 42 
 4.3.3 Extração do óleo essencial................................................................................................. 42 
 4.3.4 Extração em fase sólida...................................................................................................... 43 
 4.4 Cromatografia em coluna........................................................................................................... 43 
 4.5 Cromatografia em camada delgada.......................................................................................... 44 
 4.6 Análise do extrato e frações por CLAE-DAD e purificação de substância........................... 45 
 4.7 Técnicas espectrométricas utilizadas na determinação de substância purificada.............. 45 
 4.8 Identificação de substâncias no óleo essencial das partes aéreas de B. trimera (Less) 
DC. por CG-EM.................................................................................................................................. 
45 
 4.9 Determinação espectrofotométrica do teor de fenólicos totais............................................. 46 
 4.10 Ensaio de citotoxicidade.......................................................................................................... 47 
 4.10.1 Manutenção das linhagens............................................................................................... 47 
 4.10.2 Preparo da suspensão de células e das amostras........................................................... 48 
5. RESULTADOS...................................................................................................................................51 
 5.1 Extração....................................................................................................................................... 51 
 5.2 Extração em fase sólida............................................................................................................. 51 
 5.2.1 Extração em fase sólida 1.................................................................................................... 52 
 
 
 
8 
 
5.2.2 Extração em fase sólida 2......................................................................................................... 53 
 5.2.3 Extração em fase sólida em maior escala........................................................................... 54 
 5.3 Cromatografia em coluna........................................................................................................... 55 
 5.3.1 Cromatografia em coluna 1.................................................................................................. 56 
 5.3.2 Cromatografia em coluna 2.................................................................................................. 56 
 5.4 Análise do extrato e frações por CLAE-DAD e isolamento e purificação de substâncias a 
partir da subfração 148..................................................................................................................... 
59 
 5.5 Identificação da substância purificada a partir da subfração 148.......................................... 63 
 5.6 Identificação e quantificação de substâncias do óleo essencial das partes aéreas de B. 
trimera (Less) DC. por CG-EM.......................................................................................................... 
65 
 5.7 Determinação espectrofotométrica do teor de fenólicos totais............................................. 69 
 5.8 Ensaio de citotoxicidade............................................................................................................ 69 
6. DISCUSSÃO....................................................................................................................................... 77 
7. CONCLUSAO.................................................................................................................................... 81 
 REFERÊNCIAS................................................................................................................................... 82 
 ANEXOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura Página 
 
1 Estrutura química das flavonas............................................................... 24 
 
2 Estrutura química dos flavonois.............................................................. 24 
 
3 Estrutura química da Flavanona............................................................. 24 
 
4 Estrutura química dos diterpenos clerodânicos dilactônicos 4a, 4b e 
4c............................................................................................................. 
 
25 
 
5 Estrutura química de 7α-hidróxi-3,13-clerodadieno-16,15:18,19-
diolídeo................................................................................................... 
 
25 
 
6 Estrutura química do diterpeno 6 (tetranorditerpeno) ......................... 25 
 
7 Estrutura química do ácido hautriwaico (diterpeno clerodânico).......... 26 
 
8 Estrutura química da lactona do ácido hautriwaico (a), 1 
desoxibacrispina (b) e bacrispina (c) (diterpenos clerodânicos) ....... 
 
26 
 
9 Estrutura química de (a) 15,16-epóxi-18-hidróxi-15-metóxi-ent-
cleroda-3-eno e (b) 15,16-epóxi-7α,18-diidróxi-15-metóxi-ent-
cleroda-3-eno (diterpeno clerodânico).................................................... 
 
 
26 
 
10 Estrutura química de 15,16-epóxi-7α,18-diidróxi-15-oxo-ent-cleroda-
3-eno (diterpeno clerodânico) .................................................. 
 
27 
 
11 Estrutura química de 7α,15,18-triidróxi-ent-cleroda-3-eno (diterpeno 
clerodânico) ........................................................................................... 
 
27 
 
12 Estrutura química dos diterpenos clerodânicos 12a e 12b...................... 27 
 
13 Estrutura química do diterpeno 13 (diterpeno clerodânico).................... 28 
 
14 Estrutura química do ácido equinocístico (sapogenina triterpênica)... 28 
 
15 Estrutura química da unidade [E]-cafeoila – caf (a) e dos ésteres do 
ácido quínico/ácido cafeico .................................................................... 
 
28 
 
16 Estrutura química da substância 16 (éster aromático ou derivado do 
ácido benzóico)........................................................................................ 
 
 
29 
 
17 Biossíntese de terpenos ........................................................................ 30 
 
18 Núcleo fundamental dos flavonoides e sua numeração ........................ 32 
 
19 Biossíntese de flavonoides .................................................................... 32 
 
20 Classe de flavonoides mais abundantes ............................................... 
 
 
33 
 
 
 
 
10 
 
21 Derivados do ácido cinâmico ................................................................. 34 
 
22 Estrutura do ácido clorogênico .............................................................. 34 
 
23 Estrutura química da sulforrodamina...................................................... 38 
 
24 Esquema da placa de 96 poços contendo a disposição dos controles, 
células e amostras. Sendo: Controle negativo, apenas células na 
ausência de qualquer composto contendo apenas solvente usado para 
dissolver as amostras; Branco, somente meio de cultura; Controle 
positivo, doxorrubicina............................................................................. 
 
 
 
 
 
49 
25 Esquema da placa de 96 poços contendo a disposição dos controles, 
células e amostras teste......................................................................... 
 
 
49 
 
26 Cromatoplaca EFSteste1. Fase estacionária: Sílica Gel; Fase móvel: 
Hex/AcOEt/ i-PrOH 70:28:02 Revelador: Anisaldeído sulfúrico; da 
esquerda para direita: Extrato acetato de etila, fração1, fração 2 fração 
3, fração 4, fração 5, fração 6, fração 7, fração 8, fração 9, fração 10, 
fração 11, fração 12, fração 13................................................................ 
 
 
 
 
 
52 
27 Cromatoplaca EFSteste 2. Fase estacionária: Sílica Gel; Fase móvel: 
Hex/AcOEt/i-PrOH 70:28:02 Revelador: Anisaldeído sulfúrico; da 
esquerda para direita: Extrato AcOEt, fração 2,1, fração 2,2, fração 
2,3, fração 2,4, fração 2,5, fração 2,6, fração 2,7, fração 2,8, fração 
2,9, fração 2,10, fração 2,11, fração 2,12, fração 2,13 e volume 
morto....................................................................................................... 
 
 
 
 
 
 
53 
 
28 Cromatoplaca da EFS em maior escala. Fase estacionária: Sílica Gel; 
Fase móvel: Hex/AcOEt/ i-PrOH 70:28:02 Revelador: Anisaldeído 
sulfúrico; da esquerda para direita Extrato AcOEt, fração1, fração 2, 
fração 3, fração 4, fração 5, fração 6, fração e fração 8......................... 
 
 
 
 
55 
 
29 Cromatoplacas das frações da CC2. Fase estacionária: Sílica Gel; 
Fase móvel: Hex/AcOEt 90:10 Revelador: Anisaldeído sulfúrico. 
Frações 1 até 149................................................................................... 
 
 
 
58 
 
30 Cromatoplacas das frações da CC2. Fase estacionária: Sílica Gel; 
Fase móvel: Hex/AcOEt 80:20 Revelador: Anisaldeído sulfúrico 
Frações 1 até 149................................................................................... 
 
 
 
58 
 
31 Cromatoplacas das frações da CC2. Fase estacionária: Sílica Gel; 
Fase móvel: Hex/AcOEt/ i-PrOH 70:28:02 Revelador: Anisaldeído 
sulfúrico;Frações: 1 até 149................................................................... 
 
 
58 
 
32 Cromatoplacas das frações da CC2. Fase estacionária: Sílica Gel; 
Fase móvel: Hex/AcOEt/ i-PrOH 60:35:5 Revelador: Anisaldeído 
sulfúrico; Frações: 1 até 149................................................................... 
 
 
59 
 
 
33 Cromatograma do extrato acetato de de Baccharis trimera e espectro 
no UV do pico principal. Condições de análise descrita no item 3.8 
(gradiente).............................................................................................. 
 
 
59 
 
 
 
 
11 
 
 
34 
 
Cromatograma da fração 148 em 350 nm da cromatografia em coluna 
2. Condições de análise descrita no item 3.8 
(gradiente).............................................................................................. 
 
 
 
60 
 
35 Cromatograma da fração 148 em 254 nm da cromatografia em coluna 
2 condições de análise descrita acima no item 3.8 (gradiente)............. 
 
 
61 
 
36 Cromatograma da fração 148 em 210 nm da cromatografia em coluna 
2 condições de análise descrita acima no item 3.8 (gradiente)............. 
 
 
61 
 
37 Cromatograma da fração 148 em 254 nm da cromatografia em coluna 
2 condições de análise descrita acima no item 3.8 (isocrático)............. 
 
 
62 
 
38 Cromatograma da substância purificada 3’,5-diidroxi-4’,6,7-
trimetoxiflavona (eupatorina), condições de análise descrita no item 
3.8............................................................................................................ 
 
 
 
63 
39 Principais correlações observadas no mapa de contornos HMBC para 
a eupatorina ou 3’,5-diidroxi-4’,6,7-trimetoxiflavona.......................... 
 
 
63 
40 Cromatograma do óleo essencial das partes aéreas de B. trimera 
(Less) DC. obtido em CG-EM.................................................................. 
 
 
66 
41 Espectros de massas das substâncias identificadas por CG-EM: α-
copaeno, ß-elemeno, E-cariofileno, aromadendreno e α-humuleno........ 
 
 
67 
42 Espectros de massas das substâncias identificadas por CG-EM: 
germacreno D, biciclogermacreno, delta cadineno, germacreno B, 
viridiflorol, espatulenol, torreiol e α-cadinol.............................................. 
 
 
 
68 
43 Determinação espectrofotométrica do teor de fenólicos totais no 
extrato acetato de etila seco de B. trimera.............................................. 
 
 
69 
44 Viabilidade celular (em porcentagem) em linhagem HepG2, a partir de 
3 experimentos independentes (média ± erro padrão-ep). Tratamento 
realizado com os extratos acetato de etila (EAcBt), etanólico 95% 
(EEtBt95) e fração EFSBt3 de B. trimera. DX: controle positivo 
(doxorrubicina). H2O2: controle positivo (peróxido de hidrogênio). DM: 
controle de veículo (DMSO). CN: controle negativo. Análise de 
variância One-way ANOVA com pós-teste de Tukey. (***) p<0,001; (**) 
p<0,01; (*) p<0,05................................................................................... 
 
 
 
 
 
 
 
 
70 
 
45 Viabilidade celular (em porcentagem) em linhagem HepG2, a partir de 
3 experimentos independentes (média ± erro padrão-ep). Tratamento 
realizado com óleo essencial, a sub-fração 148 e a substância isolada 
eupatorina de B. trimera. DX: controle positivo (doxorrubicina). H2O2: 
controle positivo (peróxido de hidrogênio). DM: controle de veículo 
(DMSO). CN: controle negativo. Análise de variância One-way ANOVA 
com pós-teste de Tukey. (***) p<0,001; (**) p<0,01;(*)p<0,05................. 
 
 
 
 
 
 
71 
 
 
 
 
 
 
12 
 
 
 
 
 
46 
 
 
 
 
Viabilidade celular (em porcentagem) em linhagem SiHa, a partir de 3 
experimentos independentes (média ± erro padrão-ep). Tratamento 
realizado com os extratos acetato de etila (EAcBt), etanólico 95% 
(EEtBt95) e fração EFSBt3 de B. trimera. DX: controle positivo 
(doxorrubicina). H2O2: controle positivo (peróxido de hidrogênio). DM: 
controle de veículo (DMSO). CN: controle negativo. Análise de 
variância One-way ANOVA com pós-teste de Tukey. (***) p<0,001; (**) 
p<0,01; (*) p<0,05................................................................................... 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
72 
 
47 Viabilidade celular (em porcentagem) em linhagem SiHa, a partir de 3 
experimentos independentes (média ± erro padrão-ep). Tratamento 
realizado com óleo essencial e a sub-fração 148 de B. trimera. DX: 
controle positivo (doxorrubicina). H2O2: controle positivo (peróxido de 
hidrogênio). DM: controle de veículo (DMSO). CN: controle negativo. 
Análise de variância One-way ANOVA com pós-teste de Tukey. (***) 
p<0,001; (**) p<0,01;(*)p<0,05................................................................ 
 
 
 
 
 
 
72 
 
48 
Viabilidade celular (em porcentagem) em linhagem MRC5, a partir de 
3 experimentos independentes (média ± erro padrão-ep). Tratamento 
realizado com os extratos acetato de etila (EAcBt), etanólico 95% 
(EEtBt95) e fração EFSBt3 e a substância isolada eupatorina de B. 
trimera. DX: controle positivo (doxorrubicina). H2O2: controle positivo 
(peróxido de hidrogênio). DM: controle de veículo (DMSO). CN: 
controle negativo. Análise de variância One-way ANOVA com pós-
teste de Tukey. (***) p<0,001; (**) p<0,01; (*) p<0,05.............................. 
 
 
 
 
 
 
 
 
73 
49 Viabilidade celular (em porcentagem) em linhagem C33A, a partir de 3 
experimentos independentes (média ± erro padrão-ep). Tratamento 
realizado com os extratos acetato de etila (EAcBt), etanólico 95% 
(EEtBt95) e fração EFSBt3 de B. trimera. DX: controle positivo 
(doxorrubicina). H2O2: controle positivo (peróxido de hidrogênio). DM: 
controle de veículo (DMSO). CN: controle negativo. Análise de 
variância One-way ANOVA com pós-teste de Tukey. (***) p<0,001; (**) 
p<0,01; (*) p<0,05.................................................................................... 
 
 
 
 
 
 
 
74 
 
50 Viabilidade celular (em porcentagem) em linhagem C33A, a partir de 3 
experimentos independentes (média ± erro padrão-ep). Tratamento 
realizado com o óleo essencial e a sub-fração 148 de B. trimera. DX: 
controle positivo (doxorrubicina). H2O2: controle positivo (peróxido de 
hidrogênio). DM: controle de veículo (DMSO). CN: controle negativo. 
Análise de variância One-way ANOVA com pós-teste de Tukey. (***) 
p<0,001; (**) p<0,01; (*) p<0,05.............................................................. 
 
 
 
 
 
 
 
74 
 
 
 
 
 
 
13 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela Página 
 
1 Informações sobre metabólitos secundários isolados e/ou 
identificados em partes aéreas de Baccharis trimera (Less.) DC 
Asteraceae; sinonímia botânica – Baccharis genistelloides var. 
trimera (Less.) Baker ............................................................................. 
 
 
 
20 
 
2 Extração em fase sólida 1: Eluente e massa (g) das frações................. 52 
 
3 Extração em fase sólida 2: Eluente e massa (g) das frações ................ 53 
 
4 Extração em fase sólida em maior escala: Eluente e massa (g) das 
frações.................................................................................................... 
 
54 
 
5 Cromatografia em coluna 1: Eluente e massa (g) reunião das 
subfrações em 19 frações....................................................................... 
 
56 
 
6 Cromatografia em coluna 2: Eluente e massa (g) reunião das sub-
frações da cromatografia em coluna 2.................................................... 
 
 
57 
 
7 Dados espectrométricos de RMN obtidos para a eupatorina a 300 
MHz para 1H e a 75 MHz para 13C, em CDCl3........................................ 
 
 
64 
8 Dados obtidos das análises por CG-EM do óleo essencial de 
Baccharis trimera(Less) DC....................................................................66 
9 Efeito citotóxico dos extratos e fração EFSBt3 de Baccharis trimera 
nas diferentes linhagens celulares. Concentração suficiente para 
inviabilizar 20% das células (CI20) expressa em μg/mL ± 𝑒𝑟𝑟𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜. 
 
 
 
76 
 
10 Efeito citotóxico dos extratos de Baccharis trimera e fração 3 nas 
diferentes linhagens celulares. Concentração suficiente para 
inviabilizar 50% das células (CI50) expressa em μg/mL ± 𝑒𝑟𝑟𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜. 
 
 
 
76 
 
11 Efeito citotóxico da sub-fração 148 e do óleo essencial nas diferentes 
linhagens celulares. Concentração suficiente para inviabilizar 20% 
das células (CI20) expressa em μg/mL ± 𝑒𝑟𝑟𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 .......................... 
 
 
77 
 
12 Efeito citotóxico da sub-fração 148 e do óleo essencial nas diferentes 
linhagens celulares. Concentração suficiente para inviabilizar 50% 
das células (CI50) expressa em μg/mL ± 𝑒𝑟𝑟𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜........................... 
 
 
 
77 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
 
CPQBA – Centro de Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e 
Agrícolas 
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
CC – cromatografia em coluna 
CCD – cromatografia em camada delgada 
CG – cromatografia gasosa 
CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência 
CLAE-DAD – cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo 
de diodos 
CLAE-UV – cromatografia líquida de alta eficiência com detector no UV-Vis 
d - dubleto 
dd – duplodubleto 
DEPT – Distorlionless Enhancement Polarization Transfer 
DMSO – dimetilsulfóxido 
CDCl3 – clorofórmio deuterado 
s – singleto 
Rf – fator de retenção 
HMBC – Heteronuclear Multiple-Bond Correlation 
HMQC – Heteronuclear Multiple Quantum Coherence 
J – constante de acoplamento 
ppm – partes por milhão 
RMN – ressonância magnética nuclear 
tR – tempo de retenção 
Veluente – volume de eluente 
Vinj – volume de injeção 
UV – ultravioleta 
EFS – extração em fase sólida 
 
 
 
 
 
 
15 
 
Resumo 
Baccharis trimera (Less.) DC. (Asteraceae) é uma espécie vegetal nativa do Brasil com amplo uso 
na medicina tradicional, cujos extratos e metabólitos secundários purificados apresentaram 
atividades farmacológicas interessantes. O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil químico das 
partes aéreas de Baccharis trimera (Less.) DC, denominada “CPQBA-1”, através de análises 
cromatográficas, purificação, determinação estrutural de substâncias e avaliação da citotoxicidade 
em linhagens de células tumorais e normal usando ensaio colorimétrico com sulforrodamina B. 
Foram obtidos, a partir das partes aéreas por maceração, os extratos acetato de etila e etanólico 
95 %, além do óleo essencial por hidrodestilação. No processo de fracionamento do extrato 
acetato de etila foram utilizadas as técnicas de extração em fase sólida, cromatografia em coluna 
e cromatografia líquida de alta eficiência. As frações resultantes foram analisadas criteriosamente 
por cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência. Os perfis 
cromatográficos das frações demonstraram que ocorreu fracionamento adequado e foi possível 
isolar uma flavona, a eupatorina, e identificá-la por RMN de 13C e 1H. Através da cromatografia à 
gás acoplada à espectrometria de massas foram identificados 13 sesquiterpenos, dos quais 12 já 
tinham sido identificados no óleo essencial de B. trimera. A determinação espectrofotométrica foi 
importante para determinar a quantidade de fenólicos totais expressos em ácido gálico: 4,19% no 
extrato acetato de etila e 6,42 % (m/m) no extrato etanólico 95%. Avaliou-se neste trabalho a 
citotoxicidade em linhagens de células HEPG2, SiHa, C33A e MRC5 dos extratos, frações, 
subfrações, substância pura e óleo essencial através do ensaio de sulforrodamina B 
(Fracionamento Biomonitorado). Os extratos e a fração EFSBt3 de Baccharis trimera 
apresentaram atividade citotóxica tanto nas células tumorais quanto nas linhagens de células 
normais. Considerando os valores de CI20 e CI50, a fração EFSBt3 apresentou maior ação 
citotóxica sobre a linhagem HepG2 do que o extrato acetato de etila, do qual a fração foi obtida. 
Por outro lado, a fração EFSBt3 apresentou menor ação citotóxica do que o extrato sobre a 
linhagem normal MRC5. Já na linhagem C33A, pela análise dos gráficos dos extratos e frações, 
notou-se que o extrato acetato de etila apresentou citotoxicidade, tendo sido necessárias as 
menores concentrações para inviabilizar tanto 20 quanto 50 % das células. O óleo essencial 
apresentou citotoxicidade em todas as linhagens nas maiores concentrações testadas, sendo que 
as substâncias majoritárias presentes (biciclogermacreno - 24,47%; germacreno D -17,53%; E-
cariofileno -14,08%) podem ser os responsáveis pela ação citotóxica. A eupatorina não 
apresentou citotoxicidade nas linhagens testadas. 
 
Palavras-chave: Baccharis trimera, fitoquímica, citotoxicidade, eupatorina. 
 
 
 
 
16 
 
ABSTRACT 
Baccharis trimera (Less.) DC. (Asteraceae) is a Brazilian native species that is used in traditional 
and popular medicine. Its extracts and secondary metabolites showed interesting pharmacological 
activities. The objective of this work was to evaluate the chemical profile of aerial parts from 
Baccharis trimera (Less.) DC “CPQBA-1” and the citotoxicity of its extracts, fractions and purified 
metabolites in tumor and normal cell lines using sulforhodamine B assay. Both ethyl acetate and 
ethanol 95% extracts of aerial parts were obtained by maceration; the essential oil was obtained by 
hidrodestilation. The fractionation of ethyl acetate extract was realized using solid phase extraction, 
column chromatography and high performance liquid chromatography. The resulting fractions were 
analyzed by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. The 
chromatographic profile of the fractions demonstrated that the strategy adopted was adequate and 
eupatorin (flavones) was isolated and its structure was identified by NMR analysis. Sesquiterpenes 
(13) were identified in the essential oil by gas chromatography/ mass spectrometry and among 
these 12 sesquiterpenes were identified previously in the species. Spectrophotometric 
determination of total phenolic compounds expressed as gallic acid showed 4.19 % (m/m) of 
phenolics in ethyl acetate extract and 6.42 % in ethanolic 95% extract. Samples from B. trimera 
were tested in HEPG2, SiHa, C33A e MRC5 cell lines using the colorimetric method with 
sulforhodamine B (Bioguided Fractionation). Extracts and fraction EFSBt3 from ethyl acetate 
extract showed citotoxic activity in both normal and tumor cell lines. Considering IC20 e IC50 values, 
fraction EFSBt3 showed greater activity against tumor cell HEPG2 than against normal cell, 
compared with ethyl acetate extract. In C33A cell line the ethyl acetate extract showed citotoxicity 
in low concentrations. Essential oil showed citotoxic action in all cell lines and its major compounds 
(bicyclogermacrene – 24.47%; germacrene D -17.53%; E-cariophyllene - 14.08%) may be related with 
this action. Eupatorin did not presented citotoxicity in cell lines tested. 
Keywords: Baccharis trimera, phytochemistry, citotoxicity, eupatorin. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Substâncias de origem vegetal e seus derivados sintéticos fazem parte da composição de 
grande parte dos medicamentos utilizados na terapêutica (LI; VEDERAS, 2009). O Reino Plantae 
fornece-nos grande diversidade de moléculas com estruturas químicas únicas, os metabólitos 
secundários ou especiais, sendo o Brasil um dos países considerados detentores de 
megadiversidade, possuindo a maior diversidade vegetal genética do mundo (NODARI; GUERRA, 
2004). Atualmente, matérias-primas vegetais são utilizadas na produção de medicamentos 
fitoterápicos padronizados segundo normas rigorosas estabelecidas pela Agência Nacional de 
Vigilância Sanitária(ANVISA, 2010a). São igualmente importantes no isolamento/purificação de 
fitofármacos (ex. pilocarpina, morfina, digoxina), precursores de fármacos (ex. esteroides vegetais) 
e, ainda, na obtenção de moléculas modelo para o desenvolvimento de novos fármacos. 
A espécie selecionada para o desenvolvimento desse estudo foi Baccharis trimera (Less.) 
DC (Asteraceae), conhecida popularmente como carqueja. Trata-se de uma planta nativa de 
nosso país, com amplo uso tradicional, cuja monografia está presente na Farmacopeia Brasileira 
5ª edição e cujo uso é recomendado pela ANVISA na forma de infusão para o tratamento de 
dispepsias (ANVISA, 2010b; ANVISA, 2010c). 
Baccharis trimera tem sido objeto de pesquisas em diversas áreas. Extratos obtidos a partir 
de suas partes aéreas apresentaram atividades farmacológicas interessantes, algumas das quais 
relacionadas ao uso popular; avaliações toxicológicas de alguns extratos sugerem sua baixa 
toxicidade. Diversos estudos fitoquímicos realizados com a espécie conduziram ao isolamento 
e/ou identificação de metabólitos secundários. 
Este trabalho procurou avaliar o perfil químico das partes aéreas de Baccharis trimera 
(Less.) DC denominada “CPQBA-1” obtida por melhoramento genético e cujo perfil químico não 
tinha sido estudado até o momento. A mesma esta registrada no Ministério da Agricultura, 
Pecuária e abastecimento pelo Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e 
Agrícolas da Universidade Estadual de Campinas. Avaliamos também a citotoxicidade de extratos, 
frações e uma substância purificada de B. trimera em linhagens de células tumorais e normal 
usando ensaio colorimétrico com sulforrodamina B. 
 A procura de novas substâncias eficazes para o combate ao câncer tem aumentando nos 
últimos anos através da prospecção racional de produtos naturais originados de algas, fungos, 
líquens, macrofungos e plantas superiores, que tem se mostrado importantes fontes para 
pesquisas de novas moléculas bioativas. Esses estudos têm norteado inúmeras pesquisas para 
obtenção de novos fármacos para o tratamento de câncer (MAGALHÃES, 2005). 
 
 
 
18 
 
2. REVISÃO DA LITERATURA 
 
2.1 Baccharis trimera (Less.) DC 
 
 O gênero Baccharis é um dos maiores em número de espécies na família Asteraceae, 
sendo representado por mais de 500 exclusivamente do continente americano, distribuídas desde 
o sul dos Estados Unidos da América até a Argentina e Chile (ABAD; BERMEJO, 2007; 
GIULIANO, 2001). Baccharis trimera (Less.) DC. é um subarbusto perene com caules alados 
(cladódios) com ramos verdes de expansões trialadas, com 50-80 cm de altura. É conhecida 
popularmente como carqueja, carqueja-amargosa, carqueja-do-mato, carquejinha, tiririca-de-
balaio e cacália, sendo nativa do sul e sudeste do Brasil (LORENZI; MATOS, 2002). 
O amplo uso medicinal popular de B. trimera pode ter origem em sua utilização há séculos 
por povos indígenas (LORENZI; MATOS, 2002). As indicações descritas na literatura incluem seu 
uso como digestivo, estomáquico, anti-helmíntico, depurativo do sangue, tônico, antitérmico, em 
gastrites e úlceras, doenças hepáticas (ex. dores no fígado e hepatite), doenças do intestino, 
diarréia, impotência sexual masculina, esterilidade feminina, inflamações, reumatismo, diabetes, 
doenças renais, anemias, gripe, tratamento de obesidade, lepra e cicatrização de feridas; a forma 
de preparo mais citada é a infusão (AGRA; FRANÇA; BARBOSA-FILHO, 2007; CAMINHOÁ, 
1877; CORREA, 1931; MACEDO et al., 2007; MORS; RIZZINI; PEREIRA, 2000; NUNES et al., 
2003; PEREIRA; OLIVEIRA; LEMOS, 2004; RITTER et al., 2002). 
 Estudos fitoquímicos das partes aéreas da planta resultaram no isolamento e/ou na 
identificação de diversos metabólitos secundários: a) flavonoides, especialmente flavonas do tipo 
aglicona, além de flavonois (glicosilados ou agliconas) e de uma flavanona (BORELLA et al., 
2006; GIANELLO et al., 2000; HERZ et al., 1977; KUROYANAGI et al., 1985; NAKASUGI; KOMAI, 
1998; SILVA et al., 2006a; SIMÕES-PIRES et al., 2005a; SOICKE; LENG-PESCHLOW, 1987; 
SUTTISRI et al., 1994); b) derivados do ácido quínico/ácido cafeico (SIMÕES-PIRES et al., 
2005b); c) mistura de saponinas, cuja principal genina identificada foi o ácido equinocístico (GENÉ 
et al., 1996); d) monoterpenos e sesquiterpenos componentes do óleo essencial das partes 
aéreas (LAGO et al., 2008a; LAGO et al., 2008b; PALÁCIO et al., 2007; SILVA et al., 2007; SILVA 
et al., 2006b; SIMÕES-PIRES et al., 2005a; VARGAS et al., 2006); e) diterpenos, sendo 15 do tipo 
clerodânico. 
 Foram desenvolvidos métodos de análise por cromatografia líquida de alta eficiência 
(CLAE) e cromatografia em camada delgada (CCD) para compostos fenólicos de B. trimera com 
aplicação na identificação da espécie (OLIVEIRA et al., 2006; SILVA et al., 2006a; SIMÕES-
PIRES et al., 2005b). Métodos por cromatografia gasosa foram utilizados para análise de 
componentes do óleo volátil da planta, ou seja, monoterpenos e sesquiterpenos (LAGO et al., 
2008a; LAGO et al., 2008b). 
19 
 
Diversos estudos farmacológicos foram realizados com extratos de partes aéreas de B. 
trimera. Os extratos etanólico 70% (v/v) e aquoso apresentaram atividade antiulcerogênica (DIAS 
et al., 2009; GONZALES et al., 2000). O extrato aquoso e a fração n-butanólica deste extrato 
demonstraram ação anti-inflamatória (GENÉ; MARIN; ADZET, 1992; GENÉ et al., 1996). 
O extrato aquoso e as frações etanólica e aquosa também apresentaram ação anti-
inflamatória, inibindo significativamente o edema de pata induzido por carragenina em 3h em 
diferentes doses testadas (NOGUEIRA et al., 2011). O mesmo extrato e frações inibiram a 
atividade de uma importante enzima de desintoxicação hepática a glutationa-S-transferase. Outras 
atividades exibidas por extratos, frações ou substâncias isoladas das partes aéreas de B. trimera 
incluem: inibição dos efeitos de venenos de cobras (JANUÁRIO et al., 2004; LEITE et al., 2007), 
ações antibacteriana em Staphylococcus aureus e Streptococcus uberis (AVANCINI; WIEST; 
MUNDSTOCK, 2000; AVANCINI et al., 2008; BETONI et al., 2006), antiprotozoária em Leishmania 
amazonensis e Trypanosoma cruzi (LUIZE et al., 2005), antioxidante (DIAS et al., 2009; SIMÕES-
PIRES et al., 2005b), antimutagênica (NAKASUGI; KOMAI, 1998) e hipoglicemiante (OLIVEIRA et 
al., 2005). 
Em ensaio de toxicidade aguda com camundongos não foram verificados sinais de 
alterações aparentes com a administração do extrato etanólico 70% (DIAS et al., 2009). O extrato 
etanólico 70% administrado a ratas grávidas não produziu alterações nos parâmetros 
hematológicos observados nem sinais de toxicidade clínica; foi observada toxicidade hepática e 
renal, reversível com a descontinuação do tratamento (GRANCE et al., 2008). O extrato aquoso 
não produziu efeito mutagênico ou citotóxico em células de medula óssea de ratos (PERON et al., 
2008). Porém, em outro estudo o extrato aquoso produziu efeitos genotóxicos (Ensaio Cometa) e 
mutagênicos (Ensaio de Micronúcleos), mas também foi eficaz na redução de genotoxicidade 
induzida por H2O2, provavelmente devido a sua ação antioxidante (RODRIGUES et al., 2009). 
O óleo essencial de Baccharis trimera apresentou atividade esquistossomicida in vitro, com 
efeitos sobre a capacidade reprodutiva e alteração do tegumento de vermes adultos (OLIVEIRA et 
al., 2012). 
O diterpeno clerodânico7-α-hidróxi-3,13-clerodadieno-16,15:18,19-diolideo (Figura 5) inibiu 
totalmente as ações hemorrágica e proteolítica provocadas por venenos de Bothrops e as 
atividades hemorrágica, fibrinogenolítica e caseinolítica de metaloproteases isoladas, além de 
inibir parcialmente o edema de pata induzido por outros venenos de cobras, metaloproteases e 
fosfolipase A2. O mesmo diterpeno apresentou atividade relaxante sobre a musculatura lisa 
vascular em ratos (JANUÁRIO et al., 2004; TORRES et al., 2000). Já outro diterpeno (e também o 
extratoaquoso do qual foi isolado) inibiu a secreção ácida gástrica atuando nas vias colinérgica e 
histaminérgica, corroborando o uso popular de B. trimera no tratamento de úlceras e gastrites 
(BIONDO et al., 2011). 
20 
 
A tabela 1 fornece informações sobre metabólitos secundários isolados e/ou identificados 
em partes aéreas de Baccharis trimera (Less.) DC Asteraceae; foi considerada como sinonímia 
botânica Baccharis genistelloides var. trimera (Less.) Baker. 
21 
 
 
Tabela 1: Informações sobre metabólitos secundários isolados e/ou identificados em partes aéreas de Baccharis trimera (Less.) DC Asteraceae; sinonímia 
botânica – Baccharis genistelloides var. trimera (Less.) Baker. 
Substância isolada (classe) Fig 
Informações sobre extração 
(droga vegetal/extrato seco; g/g) 
rendimento % 
Atividade Biológica 
Determinação estrutural/ 
identificação 
Ref. 
FLAVONOIDES 
eupatorina ou 3’,5-diidroxi-
4’,6,7-trimetoxiflavona (flavona) 
1a 
acetato de etila (6.500/240) 
3,69% 
extrato apresentou ação 
protetora contra infecção por 
cercárias de Schistossoma 
mansoni 
RMN, UV, PF 
1 
CHCl3: CH3OH 2:1 (30) -------- RMN 6 
CHCl3, Sohxlet, 1 L, 24h 
(50/1,6) 3,2% 
-------- RMN, IV, EM, PF, an. elementar 
10 
acetato de etila
1
 moluscicida -------- 11 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- RMN, IV, EM, UV, PF 
12* 
-------- -------- -------- 13 
5-hidroxi-6,7,3’,4’-
tetrametoxiflavona (flavona) 
1b 
CHCl3:CH3OH 2:1 (30) -------- RMN 6 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- RMN, IV, EM, UV, PF 
12* 
eupatrina (flavona) 1c CH3OH quente (2.500) -------- IV, EM, PF 2* 
cirsimaritina ou 5,4’-diidroxi-
6,7-dimetoxiflavona (flavona) 
1d 
CH3OH quente (2.500) -------- IV, EM, PF 2* 
CH3OH sob fervura 2h (31,7 L 
em 2 etapas) (3.500/346) 
9,88% 
antimutagênica RMN, UV, IV, EM, PF 
8 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- RMN, UV, IV, EM, PF 
12* 
cirsiliol (flavona) 1e CH3OH quente (2.500) -------- IV, EM, PF 2* 
apigenina ou 5,7,4’-
triidroxiflavona (flavona) 
1f 
CH3OH quente (2.500) -------- IV, EM, PF 2* 
CH3OH sob fervura 2h (31,7 L 
em 2 etapas) (3.500/346) 
9,88% 
antimutagênica RMN, UV, IV, EM, PF 
8 
acetato de etila 
 
 
 
 
 
anti-hepatotóxica -------- 
7 
 
 
 
22 
 
 
genkwanina ou 5,4’-diidroxi-7-
metoxiflavona (flavona) 
1g 
CH3OH quente (2.500) -------- IV, EM, PF, CCD 2* 
CH3OH quente sob refluxo 2h -------- RMN, EM 5 
CH3OH sob fervura 2h (31,7 L 
em 2 etapas) (3.500/346) 
9,88% 
antimutagênica RMN, UV, IV, EM, PF 
8 
canferol (flavonol) 2a -------- -------- -------- 9* 
eriodictiol (flavanona) 3 CH3OH quente (2.000) -------- IV, EM, PF 2* 
quercetina (flavonol) 2b 
água fervente 30 min (50/4) 
8% 
-------- CLAE-DAD +padrão+ reagentes de 
deslocamento (UV)+EM 
4 
acetato de etila anti-hepatotóxica -------- 7 
-------- -------- -------- 9* 
isoquercetina (flavonol 
glicosilado) 
2c 
água fervente 30 min (50/4) 
8% 
-------- CLAE-DAD + padrão + reag. 
deslocamento no UV+EM 
4 
nepetina (flavona) 1h 
água fervente 30 min (50/4) 
8% 
-------- CLAE-DAD + reag. deslocamento 
no UV+EM 
4 
acetato de etila anti-hepatotóxica -------- 7 
7,4’-O-dimetilapigenina 
(flavona) 
1i 
CH3OH quente sob refluxo 2h -------- RMN, EM 5 
hispidulina ou 5,7,4’-triidroxi-6-
metoxiflavona (flavona) 
1j 
CH3OH sob fervura 2h (31,7 L 
em 2 etapas) (3.500/346) 
9,88% 
antimutagênica RMN, UV, IV, EM, PF 
8 
acetato de etila anti-hepatotóxica -------- 7 
-------- -------- -------- 9* 
luteolina (flavona) 1k acetato de etila anti-hepatotóxica -------- 7 
rutina (flavonol glicosilado) 2d H2O fervente, 12 L (400) anti-inflamatória e analgésica UV, EM, RMN, CCD 14 
5,6-diidroxi-7,3’,4’-
trimetoxiflavona 
1l 
CH3OH, US, 25 min (1.000) -------- RMN e UV 15 
DITERPENOS 
diterpeno 4a (dit. clerodânico) 4a 
acetato de etila (6.500/240) 
3,69% 
-------- RMN, UV, PF, CD, IV, EM 
1 
diterpeno 4b (dit. clerodânico) 4b 
acetato de etila (6.500/240) 
3,69% 
-------- RMN, UV, PF, CD, IV, EM, [α]D 1 
CHCl3 Sohxlet, 1L, 24h 
(50/1,6) 3,2% 
ação relaxante sobre a 
musculatura lisa vascular 
RMN, IV, EM, PF, análise 
elementar 
10 
CH3OH quente (2.500) -------- RMN, UV, PF, IV, EM, [α]D 2* 
acetato de etila moluscicida -------- 11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
 
 
diterpeno 4c (dit. clerodânico) 4c CH3OH quente (2.500) 
 
-------- RMN, UV, PF, IV, EM, [α]D 2* 
água 72º C, 30 min 12% antiulcerogênica RMN 17 
7α-hidroxi-3,13-clerodadieno-
16,15:18,19-diolídeo (dit. 
clerodânico) 
5 
acetato de etila (6.500/240) 
3,69% 
-------- RMN, UV, PF, CD, IV, EM, [α]D 1 
CH3OH quente (2.500) -------- RMN, UV, PF, IV, EM, [α]D 2* 
CHCl3:CH3OH 2:1 (500/99,2) 
19,84% 
inibição das atividades 
hemorrágica e proteolítica, 
edema e miotoxicidade 
induzidos por venenos e 
metaloproteases de Botrophs 
Raios X 
3 
diterpeno 6 (tetranorditerpeno) 6 CH3OH quente (2.500) -------- an. elem., EM, RMN, PF, IV, [α]D 2* 
ácido hautriwaico (dit. clerod.) 7 CH3OH quente, refluxo, 2h -------- RMN, EM 5 
lactona do ácido hautriwaico 
(dit. clerodânico) 
8a 
CH3OH quente, refluxo, 2h -------- RMN, EM 5 
1-desoxibacrispina (dit. 
clerodânico) 
8b 
CH3OH quente, refluxo, 2h -------- RMN, EM 5 
bacrispina (dit. clerodânico) 8c CH3OH quente, refluxo, 2h -------- RMN, EM 5 
15,16-epóxi-18-hidróxi-15-
metóxi-ent-cleroda-3-eno (dit. 
clerodânico) 
9a 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- EM, RMN, IV, [α]D 
12* 
15,16-epóxi-7α,18-diidróxi-15-
metóxi-ent-cleroda-3-eno (dit. 
clerodânico) 
9b 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- -------- 
12* 
15,16-epóxi-7α,18-diidróxi-15-
oxo-ent-cleroda-3-eno (dit. 
clerodânico) 
10 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- EM, RMN, IV, [α]D 
12* 
7α,15,18-triidróxi-ent-cleroda-3-
eno (dit. clerodânico) 
11 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- EM, RMN, IV, [α]D 12* 
15,16-diacetóxi-7α,18-diidróxi-
ent-cleroda-3-eno (dit. 
clerodânico) 
12a 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- EM, RMN, IV, [α]D 
12* 
15,16-diacetóxi-7α-hidróxi-18-
maloniloxi-ent-cleroda-3-eno 
(dit. clerodânico) 
12b 
-------- -------- EM, RMN, IV 
13 
diterpeno 14 (dit. clerodânico) 13 -------- -------- -------- 13 
trans-fitol (diterpeno acíclico) ---- 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- 
EM, RMN, IV 
12* 
24 
 
 
 
SAPONINAS 
Mistura de saponinas, com 
genina principal ác. 
equinocístico (ou enantiômero) 
14 
H2O fervente, 12 L (400) anti-inflamatória e analgésica UV, EM, RMN 
14 
DERIVADOS DO ÁCIDO QUÍNICO / ÁCIDO CAFEICO 
ácido 3-O-[E]-cafeoilquínico 15b água fervente 30 min antioxidante – CCD/DPPH CLAE-UV +padrões 4 
ácido 5-O-[E]-cafeoilquínico 15c água fervente 30 min antioxidante – CCD/DPPH CLAE-UV +padrões 4 
4-O[E]-cafeoilquinato de metila 
ácido 4-O-[E]-cafeoil-1-metilquínico (?) 
15d água fervente 30 min antioxidante – CCD/DPPH CLAE-UV +padrões 4 
ácido 4,5-O-[E]-dicafeoilquínico 15e água fervente 30 min antioxidante – CCD/DPPH CLAE-UV +padrões 4 
ácido 3,4-O-[E]-dicafeoilquínico 15f água fervente 30 min antioxidante – CCD/DPPH CLAE-UV +padrões 4 
ácido 3,5-O-[E]-dicafeoilquínico 15g água fervente 30 min antioxidante – CCD/DPPH CLAE-UV +padrões 4 
ácido tricafeoilquínico 15h etanol/água 1:1,maceração -------- CLAE-EM-DAD + padrão 16 
OUTROS 
éster 29 (éster aromático) 16 CH3OH quente -------- RMN, IV, EM, PE 2* 
Espatulenol ---- 
CH3OH 80%, percolação, 72 L 
(2.500) 
-------- RMN, IV, [α]D 12* 
*espécie identificada como Baccharis genistelloides. 
1
caules alados+flores+frutos 
Referências: 1. HERZ et al. 1977. 2. KUROYANAGI et al., 1985. 3. JANUÁRIO et al., 2004. 4. SIMÕES-PIRES et al., 2005b. 5. GIANELLO et al., 2000. 6. SILVA et al., 
2006a. 7. SOICKE; LENG-PESCHLOW, 1987. 8. NAKASUGI; KOMAI, 1998. 9. DAILY; WAGNER; SELIGMANN, 1984. 10. TORRES et al., 2000. 11. DOS SANTOS FILHO 
et al., 1980. 12. SUTTISRI et al., 1994. 13. ZDERO et al., 1989. 14. GENE et al., 1996. 15. BORELLA et al., 2006. 16. ABOYet al., 2012. 17. BIONDO et al., 2011. 
RMN: espectrometria de ressonância magnética nuclear; UV: espectrometria no ultravioleta; IV: espectrometria no infravermelho; EM: espectrometria de 
massas; PF: determinação do ponto (ou faixa) de fusão; CCD: cromatografia em camada delgada; CLAE: cromatografia líquida de alta eficiência.
25 
 
 
 
 
 
OR
R
1
R
2
R
3
R
4
O 
 
 
Figura 1: Estrutura química das flavonas. 
 
 
OOH
OH
R
OH
O
O R
1
 
 
Figura 2: Estrutura química dos flavonois. 
 
OOH
OH
OH
OH
O 
 
Figura 3: Estrutura química do eridioctiol (flavanona). 
Substância R R
1
 R
2
 R
3
 R
4
 
a OCH3 OCH3 OH OH OCH3 
b OCH3 OCH3 OH OCH3 OCH3 
c OCH3 OCH3 OH OCH3 OH 
d OCH3 OCH3 OH H OH 
e OCH3 OCH3 OH OH OH 
f OH H OH H OH 
g OCH3 H OH H OH 
h OH OCH3 OH OH OH 
I OCH3 ---- ---- ---- OCH3 
j OH OCH3 ---- ---- OH 
k OH ---- ---- OH OH 
l OCH3 OH ---- OCH3 OCH3 
Substância R R
1
 
a H H 
b OH H 
c OH glicose 
d OH α-L-ramnose-(1,6)-ß-D-glicose 
26 
 
 
 
O
O
H
R
H
O
O 
 
Figura 4: Estrutura química dos diterpenos clerodânicos dilactônicos 4a, 4b e 4c. 
 
O
O
H
OH
O
O 
 
Figura 5: Estrutura química de 7α-hidróxi-3,13-clerodadieno-16,15:18,19-diolídeo. 
 
H
OH
O
O
O
OH
 
 
Figura 6: Estrutura química do diterpeno 6 (tetranorditerpeno). 
 
 
substância R 
diterpeno 4a H 
diterpeno 4b OH 
diterpeno 4c =O 
27 
 
 
H
OH O
OH
O
 
 
Figura 7: Estrutura química do ácido hautriwaico (diterpeno clerodânico). 
 
H
O
O
O
R
1
R
2
 
 
Figura 8: Estrutura química da lactona do ácido hautriwaico (a), 1 desoxibacrispina (b) e bacrispina 
(c) (diterpenos clerodânicos). 
 
 
H
OH
O
O
R
 
Figura 9: Estrutura química de (a) 15,16-epóxi-18-hidróxi-15-metóxi-ent-cleroda-3-eno e (b) 15,16-
epóxi-7α,18-diidróxi-15-metóxi-ent-cleroda-3-eno (diterpeno clerodânico). 
Substância R 
(a) H 
(b) OH 
substância R
1
 R
2
 
(a) H H 
(b) H OH 
(c) OH OH 
28 
 
 
H
OH
O
O
OH
 
 
Figura 10: Estrutura química de 15,16-epóxi-7α,18-diidróxi-15-oxo-ent-cleroda-3-eno (diterpeno 
clerodânico). 
 
H
OH
OH
OH
 
 
Figura 11: Estrutura química de 7α,15,18-triidróxi-ent-cleroda-3-eno (diterpeno clerodânico). 
 
H
R
1
OH
O
O
CH3
O
CH3
O
 
 
Figura 12: Estrutura química dos diterpenos clerodânicos 12a e 12b. 
 
 
 
 
 
Substâncias 
 
 
 
 
R
1
 
a OH 
b OCOCH2CO2H 
29 
 
 
H
O
O
OH
O
O
O
 
 
Figura 13: Estrutura química do diterpeno 13 (diterpeno clerodânico). 
 
OH
OH
O
OH
 
 
Figura 14: Estrutura química do ácido equinocístico (sapogenina triterpênica). 
 
OR
4
OR
5
R
3
O
COR
1
OH 
O
OH
OH
 
 
Figura 15: Estrutura química da unidade [E]-cafeoila – caf (a) e dos ésteres do ácido quínico/ácido 
cafeico: ácido 3-O-[E]-cafeoilquínico (b), ácido 5-O-[E]-cafeoilquínico (c), 4-O-[E]-cafeoilquinato de 
metila (ácido 4-O-[E]-cafeoil-1-metilquínico
1
) (d), ácido 4,5-O-[E]-dicafeoilquínico (e), ácido 3,4-O-[E]-
dicafeoilquínico (f), ácido 3,5-O-[E]-dicafeoilquínico (g), ácido tricafeoilquínico (h). 
1
nome fornecido pelos autores! 
 
 
 
(a) 
substância R
1
 R
3
 R
4
 R
5
 
b OH caf H H 
c OH H H caf 
d OCH3 H caf H 
e OH H caf caf 
f OH caf caf H 
g OH caf H caf 
h caf caf OOH caf 
 
30 
 
 
O
O
OCH3
H3CO
 
 
Figura 16: Estrutura química da substância 16 (éster aromático ou derivado do ácido benzóico). 
2.2 Principais classes de metabólitos secundários que ocorrem em B. trimera 
(Less) DC. 
 
Dentre os metabólitos identificados e isolados de Baccharis trimera destacam-se os 
terpenos, flavonoides e derivados do ácido quínico e cafeico. 
 
2.2.1 Terpenos 
 
 A origem de todos os metabólitos secundários pode ser resumida a partir do 
metabolismo da glicose, via dois intermediários principais, o ácido chiquímico e o acetato 
(SIMÕES et al., 2007) e dividem-se em três grandes grupos: terpenos, compostos fenólicos e 
alcaloides. Os terpenos são formados a partir do ácido mevalônico, no citoplasma, ou do 
piruvato e 3-fosfoglicerato, no cloroplasto (PERES, 2004). 
O mais simples dos terpenoides é o hidrocarboneto isopreno (C5H8) (RAVEN et al., 
2001), sendo que em 1887 Wallach propôs que os monoterpenos, triterpenos bem como outros 
terpenos eram formados por unidades isoprênicas, um conceito que se tornou conhecido como 
regra do isopreno (SEIGLER, 1995). Cada grupo de terpenos é o resultado da condensação 
cabeça-cauda e/ou cauda-cauda de um número variado de unidades isoprênicas (BRUNETON, 
2001) e são classificados em monoterpenos, que consistem em duas unidades isoprênicas, 
sesquiterpenos (três unidades isoprênicas), diterpenos (quatro unidades isoprênicas), 
sesquiterpenos (cinco unidades isoprênicas), triterpenos (seis unidades isoprênicas) e 
tetraterpenos (oito unidades isoprênicas). 
Uma única planta pode sintetizar muitos terpenoides diferentes, em distintas partes da 
planta, para uma grande variedade de propósitos e em épocas diferentes, ao longo do seu 
desenvolvimento (SIMÕES et al., 2007). 
31 
 
 
2.2.1.1 Biossíntese de terpenos 
 Os terpenos podem ser biossintetizados a partir de metabólitos primários através de 
duas rotas diferentes (TAIZ et al., 2004), via do acetato (via do mevalonato) ou via da triose-
piruvato (via da deoxixilulose), conforme mostra a figura 17. 
 
 
Figura 17. Biossíntese de terpenos (adaptado de TAIZ et al., 2004). 
 
V
ia
 d
a
 t
ri
o
s
e
-p
ir
u
v
a
to
 o
u
 
d
e
o
x
ix
il
u
lo
s
e
 
32 
 
 
2.2.1.2 Via do mevalonato 
 
O mevalonato é formado da condensação aldólica de uma unidade da acetoacetil-CoA 
com uma molécula da acetil-CoA, originando a 3-hidroxi-3 metilglutaril-CoA (HMG-CoA) que é 
reduzida a mevalonato, numa reação irreversível (SIMÕES et al., 2007). Esse importante 
intermediário de seis carbonos é então pirofosforilado, descarboxilado e desidratado para 
produzir o isopentenil difosfato (IPP), que é a unidade básica na formação dos terpenos (TAIZ 
et al., 2004). 
 
2.2.1.3 Via triose-piruvato 
 
O IPP também pode ser formado a partir de intermediários da glicose ou do ciclo de 
redução fotossintética do carbono, através de um conjunto de reações denominada de via do 
metileritritol fosfato (MEP), via da triose-piruvato ou via da deoxixilulose, que ocorre nos 
cloroplastos e outros plastídeos. O gliceraldeído-3-fosfato e dois átomos de carbono derivados 
do piruvato combinam-se para formar intermediários (1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato e 2-metil-D-
eritritol-4-fosfato) que são convertidos em IPP (DEWICK, 2002; TAIZ et al., 2004). 
 O IPP e seu isômero, o dimetilalil difosfato (DMAPP), são as unidades pentacarbonadas 
ativas na biossíntese dos terpenos que se unem para formar moléculas maiores (TAIZ et al., 
2004), como monoterpenos (C10) e os sesquiterpenos (C15) que são os principais 
constituintes de aromas de plantas, os diterpenos (C20) que são conhecidos pelas suas 
propriedades antitumorais, os triterpenos (C30) e os carotenóides (C40) que são considerados 
agentes estabilizantes de membrana, antioxidantes e fotorreceptores (YUNES et al., 2007). 
 
2.2.2 Flavonoides 
 
Flavonoides (Figura 18) são metabólitos secundários fenólicos que constituem uma 
importante classe de polifenois, presentes em relativa abundância entre os metabólitos 
secundários vegetais. Possui esqueleto básico do tipo C6C3C6 contendo 15 átomos de carbono 
com substituintes hidroxilados e/ou seus derivados funcionais (ésteres, éteres, glicosídeos e 
outros). Tem rota biossintética mista – vias do chiquimato e acetato (malonil-CoA e acetil-CoA) 
(SIMÕES et al., 2007; LOPES et al.; 2000). 
 
33 
 
 
 
 
Figura 18. Núcleo fundamental dos flavonoides e sua numeração (SIMÕES et al., 2007). 
 
A rota biossíntetica resumida ocorre quando a fenilalanina étransformada pela PAL 
(fenilalanina liase) em cinamato que sofre hidroxilação formando cumarato que se une a três 
moléculas de malonato, que servirá de substrato a ação da enzima chalcona sintase, 
originando os flavonoides a partir da chalcona (Figura 19). 
 
 
 
Figura 19. Biossíntese de flavonoides (adaptado de SIMÕES et al., 2007). 
 
A diversidade estrutural dos flavonoides pode ser atribuída ao nível de oxidação e às 
variações no esqueleto carbônico básico, promovidas por reações de alquilação, glicosilação 
34 
 
 
ou oligomerização. Modificações no anel central dessas substâncias levam à diferenciação em 
subclasses distintas, tais como: chalconas, flavanonas, flavonas, flavonois, isoflavonas e 
antocianidinas dentre outras (Figura 20) (TAHARA, 2007; VEITCH; GRAYER, 2008). 
 
 
 
Figura 20. Classe de flavonoides mais abundantes (SIMÕES et al., 2007) 
 
Dentre as atividades biológicas dos flavonoides destacam-se ações contra doenças 
cardiovasculares, antitumoral e ação antioxidante. A quercetina em particular é um poderoso 
antioxidante, quelante de metais, ajuda na eliminação de radicais livres e impede a oxidação de 
lipoproteínas (SIMÕES et al., 2007; DEWICK, 2002). 
 
 
 
35 
 
 
2.2.3 Derivados do ácido quínico e ácido cafeico 
 
 Um grande grupo de compostos fenólicos (fenóis simples com apenas um grupo fenólico 
em sua estrutura molecular) é formado pelo ácido cinâmico e seus derivados. As estruturas 
destes grupos podem ser encontradas com diferentes níveis de hidroxilação e existem 
principalmente numa forma esterificada com ácidos orgânicos. Os derivados de ácidos 
cinâmicos são representados pelos ácidos cafeicos, p-cumáricos dentre outros conhecidos 
como hidroxicinâmicos (Figura 21), que são importantes constituintes naturais e prováveis 
progenitores para a formação de outras substâncias contendo esqueleto C6C3. A maioria 
desses derivados é formada a partir de processos oxidativos e/ou de reações de metilação 
(DEWICK, 2002; LAY e YAMAGUGUI, 2006). 
 
 
 
Figura 21. Derivados do ácido cinâmico (adaptado de LAY E YAMAGUGUI, 2006). 
 
O ácido cafeico é largamente distribuído nas plantas superiores na forma de seu éster 
com o ácido quínico, mais conhecido como ácido clorogênico (ácido 3-O-cafeoilquínico). O 
ácido clorogênico engloba um conjunto de substâncias, sendo um éster formado a partir da 
reação de esterificação entre o ácido trans-cinâmico ou p-cumárico, ferúlico e/ou cafeico com o 
ácido quínico, caracterizados como uma família de ésteres (CLIFFORD, 1999). 
 
 
 
Figura 22. Estrutura do ácido clorogênico (adaptado de LAY E YAMAGUGUI, 2006). 
36 
 
 
 De forma geral os ácidos clorogênicos podem ser subdivididos em grupos de 
monoésteres, di-ésteres e tri-ésteres do ácido caféico, ácido p-cumárico e ácido ferúlico. Para 
cada grupo destes compostos existe certo número de isômeros já identificados (CLIFFORD, 
1999; CLIFFORD, 2000). 
 Estudos in vivo e in vitro têm apontado que os derivados do ácido quínico e cafeico 
apresentam ações terapêuticas no combate a inúmeras doenças de grande incidência como 
doenças coronárias e vários tipos de carcinomas. Normalmente, tais compostos previnem ou 
inibem a formação de substâncias carcinogênicas e mutagênicas (KIKUGAWA et al., 1983; 
FILIP et al., 2000). 
 
2.3 Considerações gerais sobre o câncer 
 
 Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o 
crescimento desordenado (maligno) de células que invadem os tecidos e órgãos, podendo 
espalhar-se (metástase) para outras regiões do corpo (INCA, 2012). 
 Nas últimas décadas ocorreu, em todo mundo, um expressivo aumento da incidência de 
câncer, isso se deve principalmente ao fato do aumento da expectativa de vida da população, 
pois se trata de uma doença associada às últimas décadas de vida. Dados da organização 
mundial da saúde mostram que no ano de 2030 podemos esperar 27 milhões de casos 
incidentes, 17 milhões de mortes e 75 milhões de pessoas vivas, anualmente com algum tipo 
de câncer (INCA, 2012). No Brasil, a estimativa para o ano de 2012 é de mais de 257 mil novos 
casos, sendo o câncer de próstata mais comum entre os homens, e o câncer de mama mais 
frequente em mulheres (BRASIL, 2011). 
 O câncer surge da violação das regras básicas do comportamento celular, (JOHNSON; 
WALTER, 2011). A qual se dá pela alteração de seu DNA com a participação de vírus, como 
exemplo certos tipos do HPV, que desempenham um papel central na formação do câncer 
aonde a interação entre o vírus e a célula hospedeira vem sendo bem estudada. Outros 
fatores de risco estão envolvidos no desenvolvimento do câncer como substâncias químicas do 
ambiente ou da alimentação e agentes físicos como certos tipos de radiação (LEWIS; 
WALTER, 2010; JUNQUEIRA, 2000), fazendo com que o câncer seja a terceira maior causa de 
morte no mundo. Os fatores de risco podem ser encontrados no meio ambiente ou podem ser 
hereditários. A maioria dos casos (cerca de 80%) está relacionada ao meio ambiente. Entende-
se por ambiente, o meio em geral (água, terra e ar), o ambiente ocupacional (quando insalubre) 
37 
 
 
o ambiente social e cultural (estilo e hábitos de vida) e o ambiente de consumo (alimentos e 
medicamentos) (ALMEIDA; 2005). 
 Esses fatores de risco apresentam capacidade de provocar lesões e induzir 
transformações neoplásicas das células, aonde pode ocorrer profunda alteração no sistema de 
regulação da proliferação e da diferenciação celular. Essas células alteradas passam então a 
se comportar de forma anormal, multiplicando-se de maneira descontrolada sendo que essas 
mutações ocorrem em determinados genes nucleares. Uma mutação em um gene que modula 
a proliferação ou a diferenciação da célula pode fazer com que seu produto seja hiperativo ou 
produzido em excesso formando células malignas. Essas células malignas secretam moléculas 
que estimulam o crescimento dos vasos sanguíneos para que ocorra a nutrição das mesmas 
em um processo denominado de angiogênese. Essas células se tornam invasivas e são 
transportadas pela corrente sanguínea migrando-se a órgãos distantes do local onde o tumor 
se iniciou, formando as metástases (LEWIS; WALTER, 2010; JUNQUEIRA, 2000; INCA, 2012). 
 Todo esse processo de formação é conhecido como carcinogênese e em geral dá-se 
lentamente, podendo levar vários anos para que uma célula cancerosa origine um tumor 
detectável. O processo se divide em 3 etapas: 
 Estágio de iniciação: É o primeiro estágio da carcinogênese. Nele as células sofrem o 
efeito dos agentes cancerígenos ou carcinógenos (ex: tabaco, vírus-HPV) que provocam 
modificações em alguns de seus genes. Nesta fase as células se encontram geneticamente 
alteradas, porém ainda não é possível detectar um tumor clinicamente. 
 Estágio de promoção: Nele, a célula iniciada é transformada em célula maligna, de 
forma lenta e gradual. É necessário um longo e continuado contato com o agente cancerígeno 
promotor para que ocorra essa transformação. 
 Estágio de progressão: É o terceiro e último estágio e se caracteriza pela 
multiplicação descontrolada e irreversível das células alteradas surgindo às primeiras 
manifestações clínicas da doença. (NERURKAR; RAY, 2010; INCA 2012). 
 A carcinogênese pode ser evitada através da quimioprevenção, que intervém em todas 
as fases do seu processo (MAITI et al., 2009). Como exemplo de agente antineoplásico 
podemos citar os alcaloides vegetais (produtos naturais nitrogenados derivados 
biossinteticamente de aminoácidos) como os alcaloides da vinca (vimblastina e vincristina). 
 Entretanto, a maioria dos agentes quimioterápicos atua de forma não-específica 
lesando tanto células malignas como normais. Como exemplos têm os antibióticos 
antitumorais, antraciclinas e os agentes alquilantes (ALMEIDA 2005). 
38 
 
 
 A procura de novos fármacos eficazes para o combate ao câncer tem aumentando nos 
últimos anosatravés de substâncias promissoras por meio de screening racional de produtos 
naturais com algas, fungos, líquens, macrofungos e plantas superiores que tem se mostrado 
importantes fontes para pesquisas de novas moléculas bioativas. Esses estudos têm norteado 
inúmeras pesquisas para obtenção de novos fármacos para o tratamento de câncer 
(MAGALHÃES, 2005). 
 No desenvolvimento de novos fármacos anticâncer, tem-se avaliado a citotoxicidade 
dos compostos in vitro em linhagens celulares neoplásicas (FRESHNEY, 1994), e para verificar 
a seletividade dessas drogas utilizam-se linhagens de células normais (HOUGHTON et al., 
2007). Estes estudos, durante a fase de screening, têm reduzido o número de ensaios in vivo 
(CINGI et al., 1991; HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991). 
 
2.3.1 Ensaio de citotoxicidade 
 
 A utilização de produtos naturais como fonte de agentes anticancerígenos foi 
reconhecida em 1950 pelo Instituto Nacional do Câncer ao longo dos últimos 30 anos, sendo 
que hoje a principal abordagem na busca de potentes agentes para o tratamento do câncer tem 
sido baseada em ensaios de citotoxicidade (HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991; 
HOUGHTON et al., 2007). 
 As potenciais atividades antitumorais são avaliadas in vitro em linhagens celulares 
tumorais, sendo tais efeitos avaliados por parâmetros que incluem desde a morte celular até a 
alteração de seu metabolismo (FRESHNEY, 1994). 
 Através dos ensaios de citotoxicidade a taxa de crescimento e multiplicação é medida 
indiretamente por algum indicador de crescimento através da formação de coloração, sendo a 
intensidade da cor diretamente proporcional ao número de células presentes (HOUGHTON et 
al., 2007). Estes ensaios são conhecidos como ensaios colorimétricos, dentre os quais 
podemos citar o ensaio colorimétrico com sulforrodamina B (SRB). Este ensaio é utilizado 
para determinação da densidade de células, a partir da medição do teor de proteína celular. A 
SRB (figura 23) é um corante de proteína com fórmula molecular C27H30N2O7S2 (558,66 Da) 
que se liga à resíduos de aminoácidos sob condições acídicas e que se dissociam em 
condições básicas. Foi desenvolvido em 1990 e continua a ser um dos métodos mais 
amplamente utilizados para screening de citotoxicidade in vitro (VICHAI, 2006; BLUMENTHAL, 
2005). 
39 
 
 
ON
CH3
CH3
N
+
CH3
CH3
S
O
OO
-
S
+
O
OH
OH
 
 
Figura 23: Estrutura química da sulforrodamina B. 
 
 Para este estudo foi realizado uma prospecção com o extrato, frações e sub-frações 
semipurificadas e substância pura de Baccharis trimera, avaliando-se a citotoxicidade através 
do ensaio de SRB. Este ensaio constitui em um método que não requer reagentes de alto custo 
e nem equipamentos mais sofisticados e permite que um número maior de substâncias seja 
testado em poucos dias (HENRIKSSON, 2006; VICHAI, 2006). 
 
3. OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo geral 
 
O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil químico das partes aéreas de Baccharis 
trimera (Less.) DC. denominada “CPQBA-1” através de análises cromatográficas, purificação e 
determinação estrutural de substâncias, bem como avaliar a citotoxicidade do extrato, frações e 
substâncias purificadas em linhagens de células tumorais e normal usando ensaio colorimétrico 
com sulforrodamina B. 
 
3.2 Objetivos específicos 
 
a) Realizar o fracionamento do extrato das partes aéreas de Baccharis trimera (Less.) 
DC. através de técnicas cromatográficas como extração em fase sólida (EFS), cromatografia 
em coluna (CC), cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta 
eficiência (CLAE). 
40 
 
 
b) Obter os perfis cromatográficos do extrato e frações através de CCD e CLAE-UV e do 
óleo essencial das partes aéreas por cromatografia à gás (CG-EM). 
c) Determinar o teor de fenólicos totais dos extratos através de análises 
espectrofotométricas 
d) Avaliar a citotoxicidade do extrato, frações, sub-frações, substâncias purificadas e do 
óleo essencial de partes aéreas de Baccharis trimera através do ensaio colorimétrico com 
sulforrodamina B, utilizando a estratégia de Fracionamento Biomonitorado. 
e) Determinar a estrutura química de substâncias purificadas utilizando técnicas 
espectrométricas. 
 
4. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
4.1 Especificações dos materiais e equipamentos 
 
4.1.1 Fitoquímica 
 
Balança semi-analítica: GEHAKA® modelo BG 200 (máx 200g; min 0,025g; d = 0,001g). 
Balança analítica: MARTE® modelo AY220 (Max 220g; min 0,01; d=0,001). 
Aparelho tipo Clevenger para hidrodestilação. 
Colunas cromatográficas de bancada: 
 coluna de vidro com 1,2 cm de diâmetro interno com adaptador para entrada para ar 
comprimido; 
 coluna de vidro com 10,5 cm de diâmetro interno adaptado a sistema de sucção 
("vácuo"); 
 coluna de vidro com 3 cm de diâmetro interno com adaptador para entrada para ar 
comprimido; 
 coluna de vidro com 5 cm de diâmetro interno com adaptador para entrada para ar 
 comprimido; 
Coluna cromatográfica CLAE: Hypersil Gold® C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm). 
Coluna cromatográfica CG: DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). 
Cartucho para clean-up: Phenomenex® modelo StrataTM C18 - E (15 x 10 mm; 55 μm). 
41 
 
 
Cromatografia em camada delgada comparativa: Sílica Gel 60G aplicada em placas de vidro 
de 20 X 20 cm obtendo-se 0,25 mm de espessura. Após preparo, as placas foram ativadas por 
1h em estufa a 110º C. 
Cromatografia em camada delgada preparativa: Sílica Gel 60G aplicada em placa de vidro 
de 20 X 20 cm obtendo-se 1 mm de espessura. Após preparo, as placas foram ativadas por 1h 
em estufa a 110º C. 
Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (Shimadzu® Prominence®, modo analítico), 
constituído dos seguintes módulos: bomba modelo LC-20AT, injetor automático modelo SIL-
20, forno de coluna modelo CTO-20A, detector de arranjo de diodos modelo SPD-M20A, 
módulo de comunicação modelo CBM-20A, desgaseificador modelo DGU-20A5. Software para 
controle do sistema e aquisição e tratamento de dados LCSolution®. 
Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (Shimadzu®, modo analítico), constituído dos 
seguintes módulos: bomba modelo LC-10AD, detector UV-VIS modelo SPD-10A, módulo de 
comunicação modelo SCL-10A, desgaseificador modelo DGU-14A. Software para controle do 
sistema e aquisição e tratamento de dados ClassVP®. 
Cromatógrafo à Gás: Shimadzu® modelo QP2010. 
Estufa de secagem e esterilização: FANEM® modelo 320-SE. 
Lâmpada UV: MineraLight® modelo UVSL-25. 
UV/Vis: Beckman DV 530, Life Science. 
Fases estacionárias para cromatografia em coluna e extração em fase sólida: 
Sílica gel: 0,074-0,250 mm J. T. Baker®; 0,040-0,063 mm MERCK®; 
Sílica C18: 0,040-0,060 mm LiChroprep®; 
Rota evaporador: IKA-DEST® modelo KV 05S3, com banho de aquecimento QUIMIS®, banho 
ultratermostatizado (refrigeração) QUIMIS® modelo Q214M3; 
Solventes: 
CCD, CC, EFS: Qhemis® P.A; 
CLAE (incluindo pré-tratamento das amostras): Solventes grau cromatográfico J.T. 
Baker®; 
 Água ultrapura: obtida a partir de purificador Milli Q modelo Synergy®; 
Ultrassom: UNIQUE®, modelo USC-2800; frequência: 40KHz . 
Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear: Espectrômetro Varian® INOVA 7,0 T 
operando a 300 MHz para 
1
H e a 75 MHz para 
13
C. 
Folin-ciocalteau – Reagente analítico IMBRALAB®. 
 
 
42 
 
 
4.1.2 Ensaio de citotoxicidade 
 
Peagâmetro: MARCONI® modelo MAPA200, série 081390709. 
Balança analítica: SARTORIUS® modelo TE2145 (Max 210g; min 0,01g) 
Capela: QUIMIS® modelo Q-216-11. 
Estufa bacteriológica: MARCONI® MA 032 
Solventes: grau PA Qhemis®. 
Microscópio óptico: Olympus® modelo CKX41SF. 
Bancada de fluxo laminar vertical: PACHANE® nº 03505 modelo 050. 
Incubadora de CO2: TECNAL
® modelo TE-399. 
 
4.2 Material vegetal 
 
 Partes aéreas de Baccharis trimera foram coletadas no Horto de Plantas Medicinas e 
Tóxicas "Profa. Dra. Célia Cebrian de Araujo Reis" da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da 
UNESP-Araraquara.O espécime de Baccharis trimera cultivado no Horto pertence a uma 
variedade desenvolvida e fornecida pelo CPQBA-UNICAMP denominada “CPQBA-1” registrada 
no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento pelo Centro Pluridisciplinar de 
Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da Universidade Estadual de Campinas tendo sido 
identificada pelo Prof. Dr. Luis Vitor Silva do Sacramento do Laboratório de Farmacobotânica 
da FCF-UNESP. A exsicata da mesma, esta depositada no Herbário CPQBA sob número 1286. 
 Primeira coleta: 
 Dados da coleta: 07/01/2011, 07:30 h; latitude: S 21.81453º; longitude: O 48.20170º; 
altitude: 662 m. 
 O material vegetal foi seco em estufa com circulação de ar à 40 ºC por sete dias e 
moído em moinho de facas. 
 Segunda coleta: 
 Foi realizada uma segunda coleta de B. trimera para extrair óleo essencial das partes 
aéreas frescas. 
 Dados da coleta para extração do óleo essencial: 10/10/2012, 07:30 h; latitude: S 
21.81453º; longitude: O 48.20170º; altitude: 662 m. 
43 
 
 
4.3 Extração 
 
4.3.1 Extrato acetato de etila 
 
O método de extração utilizado foi maceração com aquecimento a 35º C, com agitação 
ocasional e renovação do líquido extrator (remaceração). Para isso, foram pesados em balança 
semi-analítica 500g de droga vegetal, a qual foi intumescida com 1000 mL de acetato de etila. 
Posteriormente, adicionou-se mais 1000 mL de acetato de etila dando início ao processo de 
extração. No total, foram realizadas três etapas (1000 mL cada) com duração de 8, 24 e 72 h. 
Este procedimento foi realizado três vezes e os extratos líquidos obtidos foram reunidos. 
A solução extrativa foi filtrada em papel de filtro e concentrada em rota-evaporador sob 
pressão reduzida (530-540 atm) à 45º C. 
 
4.3.2 Extrato etanólico 95% 
 
A extração foi realizada através do método de maceração com etanol 95% à temperatura 
ambiente e sob agitação ocasional, em 3 etapas de 72 h cada. A massa de droga vegetal 
utilizada para cada extração foi de 100,0 g e o volume total de solvente (dividido nas 3 etapas 
de extração) foi de 1.500 mL; portanto, a relação droga vegetal/solvente utilizada foi de 1:15 
(g/mL). Após cada etapa, as soluções extrativas foram separadas do material vegetal por 
filtração simples (papel de filtro) e reunidas. 
 
4.3.3 Extração do óleo essencial 
 
O óleo essencial foi obtido através da técnica de extração por arraste à vapor de água 
com utilização de um aparelho do tipo Clevenger. Foram utilizadas 100 g de partes aéreas 
frescas de Baccharis trimera em 500 mL de água deionizada e o tempo de destilação foi de 4 
h. O óleo essencial foi retirado do Clevenger com auxílio de uma pipeta de Pasteur e o 
aparelho foi lavado com hexano para obter o óleo essencial residual. Posteriormente, foi 
adicionado Na2SO4 anidro para retirar a água residual da solução hexânica do óleo essencial 
que foi filtrada para separação do Na2SO4 hidratado. Após evaporação do hexano sob fluxo de 
ar em capela o óleo essencial foi armazenado em frasco de vidro fechado sob refrigeração. 
 
44 
 
 
4.3.4 Extração em fase sólida 
 
Extração em fase sólida teste 1: Foi realizada uma extração em fase sólida com 403 
mg do extrato acetato de etila seco utilizando-se uma coluna de vidro de 1,2 cm de diâmetro 
interno, preenchida com 12 cm de sílica gel (0,074-0,250 mm). A eluição (Veluente: 30 mL) foi 
realizada como segue: 1. hexano/ acetato de etila 95:5 (frações 1, 2 e 3) 2. hexano/acetato de 
etila 1:1 (frações 4, 5 e 6) 3. acetato de etila (frações 7, 8 e 9) 4. acetato de etila/metanol 1:1 
(frações10, 11 e 12) e 5. metanol (fração 13). 
Extração em fase sólida teste 2: Foi realizada a segunda extração em fase sólida nas 
mesmas condições do teste 1, diferenciando apenas a fase móvel. A eluição (Veluente: 30 mL) foi 
realizada como segue: 1. hexano/acetato de etila 92:8 (frações 2,1; 2,2; 2,3) 2.hexano/acetato 
de etila 40:60 (frações 2,4; 2,5; 2,6) 3. acetato de etila (frações 2,7; 2,8; 2,9) 4. metanol 
(frações 2,10; 2,11; 2,12; 2,13). 
Extração em fase sólida em maior escala: A partir da otimização das condições de 
separação das EFSteste1 e 2 foi realizada uma extração em fase sólida em maior escala, 
utilizando uma coluna de vidro de 10,5 cm de diâmetro, preenchida com 12 cm de sílica gel. 
Foram adicionados na coluna 30 g de extrato seco. A eluição (Veluente: 1800 mL) foi realizada 
como segue: 1. hexano/acetato de etila 95:5 (frações 1 e 2) 2. acetato de etila (frações 3 e 4) 3. 
acetato de etila/metanol 1:1 (frações 5 e 6) 4. metanol (fração 7 e 8). 
 
4.4 Cromatografia em coluna 
 
As condições de análise para cromatografia em coluna foram estabelecidas a partir das 
análises em cromatografia em camada delgada e segundo metodologia para transferência de 
separações adaptada de Still, Kahn e Mitra (1978). 
Cromatografia em coluna 1: Foi realizada cromatografia em coluna com a fração 4 da 
extração em fase sólida em maior escala. Foi utilizada uma coluna de vidro de 3 cm de 
diâmetro, preenchida com 20 cm de sílica gel (0,040-0,063 mm). Foi adicionado na coluna 1 g 
da fração 4. A eluição em gradiente (Veluente: 400 mL) foi realizada como segue, coletando-se 20 
mL por fração para os eluentes 1 a 6, 40 mL para o eluente 7, 50 mL para o eluente 8 e 400 mL 
para o eluente 9: 1. hexano/acetato de etila/ isopropanol 95:4,7:0,3 (frações 1 até 18); 2. 
hexano/acetato de etila/ isopropanol 94:5,6:0,4 (frações 19 até 37); 3. hexano/acetato de etila/ 
isopropanol 92:7,5:0,5 (frações 38 até 56); 4. hexano/acetato de etila/ isopropanol 88:11,2:0,8 
(frações 57 até 77); 5. hexano/acetato de etila/ isopropanol 80:18,7:1,3 (frações 78 até 97); 6. 
45 
 
 
hexano/acetato de etila/ isopropanol 70:28:02 (frações 98 até 120); 7. hexano/acetato de etila 
1:1 (frações121 até 130); 8. acetato de etila (frações 131 até 138); 9. metanol (fração 139). 
Como o rendimento de massa das frações da cromatografia em coluna 1 foi baixo, foi 
realizada uma segunda cromatografia em coluna com as frações 3 e 4 da extração em fase 
sólida em maior escala otimizando algumas condições da cromatografia em coluna 1. 
Cromatografia em coluna 2: Foi realizada cromatografia em coluna com as frações 3 e 
4 da extração em fase sólida em maior escala. Utilizou-se uma coluna de vidro de 5 cm de 
diâmetro interno, preenchida com 20 cm de sílica gel (0,040-0,063 mm). Foram adicionados 
1.061,2 mg da fração 3 e 2.079,4 mg da fração 4. A eluição (Veluente: 1000 mL) foi realizada 
como segue: 1. hexano/ acetato de etila/ isopropanol 98:02 (frações 1 até 11) 2. 
hexano/acetato de etila/ isopropanol 90:9,3:0,7 (frações 12 até 30) 3. hexano/acetato de 
etila/isopropanol 89:10,2:0,8 (frações 31 até 50) 4. hexano/acetato de etila/ isopropanol 
87:12,1:0,9 (frações 51 até 70) 5. hexano/acetato de etila/ isopropanol 83:15,8:1,2 (frações 71 
até 90) 6. hexano/acetato de etila/isopropanol 75:23,3:1,7 (frações 91 até 110) 7. 
hexano/acetato de etila/isopropanol 70:28:02 (frações 111 até 130) 8. hexano/acetato de etila 
50:50 (frações 131 até 140) 9. acetato de etila (frações 141 até 147) 10. metanol (fração 148 e 
149). Todas as frações foram coletadas com volume de 50 mL, com exceção das frações 
eluídas com metanol que foram coletadas com volume de 500 mL. 
Todas as frações obtidas por EFS ou CC foram secas em capela ou rotaevaporador e, 
em seguida, em dessecador com sílica gel sob vácuo. Após foram armazenadas sob 
refrigeração em frascos fechados. 
 
4.5 Cromatografia em camada delgada 
 
Todas as frações obtidas foram solubilizadas em acetato de etila (5 mg/mL) e submetidas 
à análise por cromatografia em camada delgada, utilizando uma série de eluentes e 
reveladores seletivos como anisaldeído (terpenos e esteroides) e NP/PEG (flavonoides), além 
de ácido sulfúrico 10 % como revelador de compostos orgânicos (revelador universal). 
Condições cromatográficas: sílica Gel 60G (20 x 20 cm x 0,25 mm); ativação: 110ºC