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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE AGRONOMIA ISABELLE LOPES OLIVEIRA TOXICIDADE PARA AS ABELHAS Apis mellifera L. DE UM PRODUTO COMERCIAL DE INSETICIDA FORTALEZA 2022 ISABELLE LOPES OLIVEIRA TOXICIDADE PARA AS ABELHAS Apis mellifera L. DE UM PRODUTO COMERCIAL DE INSETICIDA Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Ceará, como um dos requisitos à obtenção do título de Engenheira Agrônoma. Orientador: Prof. PhD. Breno Magalhães Freitas. FORTALEZA 2022 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Sistema de Bibliotecas Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a) O47t Oliveira, Isabelle Lopes. Toxicidade para as abelhas Apis mellifera L. de um produto comercial de inseticida / Isabelle Lopes Oliveira. – 2022. 29 f. : il. color. Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Curso de Agronomia, Fortaleza, 2022. Orientação: Prof. Dr. Breno Magalhães Freitas. 1. Inseticida. 2. Toxicidade. 3. Polinizadores. 4. Clorfenapir. 5. Pirate. I. Título. CDD 630 ISABELLE LOPES OLIVEIRA TOXICIDADE DE UM PRODUTO COMERCIAL DE INSETICIDA PARA AS ABELHAS Apis mellifera L. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Ceará, como um dos requisitos à obtenção do título de Engenheira Agrônoma. Aprovada em: 26/ 01/ 2022. BANCA EXAMINADORA ________________________________________ Prof. PhD. Breno Magalhães Freitas (Orientador) Universidade Federal do Ceará (UFC) _________________________________________ Dr. Francisco Deoclécio Guerra Paulino Universidade Federal do Ceará (UFC) _________________________________________ Dr. Leonardo dos Santos Gurgel Universidade Federal do Ceará (UFC) AGRADECIMENTOS À Deus pelo dom da vida, por sua bondade e misericórdia infinita, sua divina providência que sempre me acompanha e seu amor paternal. A minha família, por todo amor, educação e esforços para que eu chegasse até aqui, são inúmeros nomes que gostaria de citar aqui, mas em especial por meu avô João Bosco, que com seu jeito peculiar ficaria feliz com esta conquista (In Memoriam). A Comunidade Católica Shalom, por me ensinar sempre os caminhos de Deus, acolher-me como leiga consagrada e conduzir-me por todo o caminho formativo. A todos os amigos que fiz no Curso de Agronomia, em especial aqueles que permanecem até hoje, Elane Bezerra, Monique Rocha, Jean Lucas, Eliete Reis e Bruna Aires. Ao professor e orientador Dr. Breno Magalhães Freitas, pela orientação ao longo do trabalho, por abrir as portas do Setor de Abelhas da UFC, por todo conhecimento passado. Ao Engenheiro Agrônomo Dr. Leonardo dos Santos Gurgel, por toda recepção e acolhida no setor, sua colaboração indispensável neste trabalho, por seus conselhos e amizade. Ao Engenheiro Agrônomo Dr. Francisco Deoclécio Guerra Paulino, por toda empatia, atenção, colaboração e conversas no fim da tarde. A todos os alunos do GPA-UFC por me passarem todo seu conhecimento sobre abelhas, pela paciência em me ensinarem os manejos das abelhas. A Arianne Moreira, Paloma Eleutério e Larysson Feitosa, por toda ajuda nos experimentos, conselhos e principalmente amizade. Ao doutorando do Departamento de Fitossanidade da UFC Raimundo Henrique Ferreira Rodrigues, por toda ajuda nos cálculos e ajuste de dosagens. Ao professor Patrik Luiz Pastori pela colaboração e concessão do produto comercial utilizado neste trabalho. A Universidade Federal do Ceará, todos os professores e colaboradores do Curso de Agronomia. RESUMO As abelhas se destacam entre as espécies de polinizadores existentes pois desempenham um papel fundamental na manutenção dos ecossistemas e na produção de alimentos. A espécie Apis mellifera Linneaus (Hymenoptera: Apidae) é uma das mais utilizadas para polinização em áreas cultivadas, devido ao fácil manejo, perfil generalista na busca de recursos e tamanho das colônias. Entretanto, o uso abusivo de produtos fitossanitários, com destaque para os pesticidas tem acarretado grande declínio na população desses polinizadores em diversas áreas agrícolas. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade de um produto comercial com o ingrediente ativo clorfenapir, Pirate® (BASF S.A, São Paulo), em abelhas Apis mellifera. Abelhas campeiras foram coletadas no apiário do Setor de Abelhas do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do Ceará, Campus do Pici e conduzidas ao Laboratório de Abelhas. Para a determinação da dose letal média tópica em 24 h (DL50) foi utilizado o método internacional preconizado pela OECD (Organization for Economic Cooperation and Development), 1998a, desenvolvido para Apis mellifera. O produto comercial com o ingrediente ativo do clorfenapir foi diluído em água destilada, até se obter as doses a serem testadas (0,5 nL p.c./μL, 1 nL p.c./μL, 2,5 nL p.c./μL, 5 nL p.c./μL, 7,5 nL p.c./μL, 20 nL p.c./μL, 40 nL p.c./μL, 60 nL p.c./μL). Foram feitas anotações de abelhas vivas e mortas 24 horas após o contato com o inseticida e os dados foram submetidos à análise estatística do tipo dose- resposta, utilizando-se o software POLO Plus. A DL50 tópica para o produto comercial foi de 0,79 nL p.c./µL/abelha em 24 horas. O produto comercial Pirate® é altamente tóxico, mesmo nas doses mais baixas, se mostrando mais tóxico do que estudos realizados com o ingrediente ativo clorfenapir. Palavras-chave: Inseticida. Toxicidade. Clorfenapir. Polinizadores. DL50. Pirate. ABSTRACT Bees stand out among the existing pollinator species as they play a fundamental role in the maintenance of ecosystems and food production. The species Apis mellifera Linneaus (Hymenoptera: Apidae) is one of the most used for pollination in cultivated areas, due to its easy handling, generalist profile in the search for resources and size of colonies. However, the abusive use of phytosanitary products, especially pesticides, has caused a great decline in the population of these pollinators in several agricultural areas. The present study aimed to evaluate the toxicity of a commercial product with the active ingredient chlorfenapyr, Pirate® (BASF S.A, São Paulo), in Apis mellifera bees. Field bees were collected in the apiary of the Bee Sector of the Zootechnics Department of the Federal University of Ceará, Campus do Pici and taken to the Bee Laboratory. The international method recommended by the OECD (Organization for Economic Cooperation and Development) 1998a, developed for Apis mellifera, was used to determine the mean topical lethal dose in 24 h (LD50). The commercial product with the active ingredient of chlorfenapyr was diluted in distilled water until the doses to be tested were obtained (0.5 nL pc/μL, 1 nL pc/μL, 2 .5 nL pc/μL, 5 nL pc/μL, 7.5 nL pc/μL, 20 nL pc/μL, 40 nL pc/μL, 60 nL pc/μL). Notes were made of live and dead bees 24 hours after contact with the insecticide and the data were submitted to dose- response statistical analysis, using the POLO Plus software. Topical LD50 for the commercial product was 0.79 nL p.c./µL/bee in 24 hours. The commercial product Pirate® is highly toxic, even at the lowest doses, proving to be more toxic than studies performed with the active ingredient chlorfenapyr. Keywords: Insecticide. Toxicity. Chlorfenapyr. Pollinators. DL50. Pirate. SUMARIO 1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 9 2 REFERENCIAL TEÓRICO......................................................................................12 2.1 Importância da abelha Apis mellifera na polinização.....................................12 2.2 Desaparecimento de Apis mellifera em áreas agrícolas................................13 2.3 Toxicidade de inseticidas sobre Apis mellifera..............................................15 3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 17 3.1 Material biológico............................................................................................. 17 3.2 Determinação da DL50 média tópica em 24h................................................ 17 3.3 Análise estatísticas dos dados....................................................................... 18 4 RESULTADOS....................................................................................................... 19 5 DISCUSSÃO......................................................................................................... 21 6 CONCLUSÃO........................................................................................................ 24 7 REFERÊNCIAS...................................................................................................... 25 9 1 INTRODUÇÃO Estima-se que 75% das espécies de plantas fanerógamas existentes no planeta são dependentes de polinização (FREITAS; PINHEIRO, 2010). Dentre os vários agentes polinizadores, os insetos apresentam maior eficiência tanto pelo seu número na natureza quanto por sua melhor adaptação. As abelhas se destacam entre as espécies de polinizadores existentes pois desempenham um papel fundamental na manutenção dos ecossistemas e na produção de diversos alimentos (MACIEL et al., 2018; WOLOWSKI et al., 2019). A espécie Apis mellifera Linneaus (Hymenoptera: Apidae) é uma das mais utilizadas para polinização em áreas cultivadas, devido ao fácil manejo, perfil generalista na busca de recursos e tamanho das colônias. Estes polinizadores possuem um grande valor econômico evidenciados pelos bens de consumo produzidos como mel, cera, própolis, pólen e geleia real (PIRES et al., 2016). Apesar de apresentar uma fundamental importância ecológica e econômica, nas últimas décadas a diversidade dessas espécies vem sendo ameaçadas. Nos agroecossistemas mundiais vem sendo observado altas taxas de mortalidade e desaparecimento desses agentes polinizadores. Tal fenômeno ficou conhecido como “Desordem do Colapso das Colônias” do inglês Colony Collapse Disorder (PIRES et al., 2016). O declínio dos polinizadores em áreas agrícolas está relacionado a múltiplos fatores. Um dos principais fatores desse desequilíbrio é o uso desenfreado de pesticidas (PIRES et al., 2016). Os agrotóxicos são utilizados de forma preventiva ou curativa no combate a pragas em cultivos agrícolas, principalmente monoculturas. O Brasil se encontra entre os maiores consumidores de agrotóxicos do mundo (CARVALHO et al., 2017). Embora o uso de agrotóxicos não seja direcionado a esses insetos polinizadores acabam trazendo danos devido seus efeitos nocivos. Castilhos et al. (2019) alega que em diversas regiões do Brasil são perdidas 50% das colônias anualmente, chegando a quase um bilhão de abelhas mortas no país. Segundo o Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Vegetal (SINDIVEG) a área tratada com defensivos agrícolas cresceu 8,7% no terceiro trimestre de 2021 em comparação com o mesmo período do ano anterior. 10 As pesquisas que analisam a resistência desses insetos à agrotóxicos utilizam em sua maioria a abelha Apis mellifera, devido sua grande importância como polinizador (JACOB et al.,2014). As abelhas podem entrar em contato com inseticidas através da exposição a partículas suspensas no ar e nas partes vegetais e pela ingestão de néctar e pólen contaminados (KLEIN et al., 2007; SILVA et al, 2015; CHAM et al., 2017; HEARD et al., 2017). Alguns inseticidas, como por exemplo, Imidacloprido, Tiametoxam, Clotianidina, Fipronil, Deltametrina, Abamectina, Novaluron e Malathion, têm sido relatados como letais as abelhas (COSTA et al., 2014; TOMÉ et al., 2015; PITTS-SINGER; BARBOUR, 2017; PADILHA et al., 2020; DA SILVA BORGES et al., 2020). Neste cenário se torna tão essenciais pesquisas de avaliação de toxicidade de agrotóxicos sobre as abelhas visando a conservação e preservação desses polinizadores. Avaliações de toxicidade são realizadas através da dose ou concentração letal média. A DL50 ou a CL50 de uma substância, expressa o grau de toxicidade aguda de substâncias químicas, correspondendo à dose suficiente para matar 50% dos animais de um lote utilizados num experimento. Em laboratório são observadas as curvas de mortalidade determinadas através da DL50 e/ou CL50. Na DL50 o indivíduo é exposto a uma única dose da substância (exposição aguda) e os efeitos são detectados em um intervalo de 24 a 48 horas e CL50 é quando os insetos são expostos ao conteúdo tóxico em uma determinada concentração por um período de tempo pré- determinado (CAMPOS e ANDRADE, 2001). Clorfenapir é um pró-inseticida/acaricida e, portanto, não tem ação tóxica em sua forma inicial, passa por um processo de ativação, o qual é causado por enzimas monooxigenases dependentes do citocromo P450 (HUNTY e TREACY, 1998). A absorção de clorfenapir pelos indivíduos ocorre principalmente por ingestão, havendo também alguma absorção por contato. Clorfenapir possui ação ovicida limitada. Nas plantas, essa molécula não tem ação sistêmica, mas sim ótima ação translaminar (DEKEYSER, 2005). Pouco se conhece sobre seus efeitos e toxicidade em abelhas Apis mellifera. Uma das formas de preservação desses insetos polinizadores seria por meio da utilização de inseticidas seletivos, ou seja, que causam mortalidade ao inseto-praga, mas apresentam baixa toxicidade para as abelhas. A maioria dos estudos realizados utilizam os ingredientes ativos, pouco se analisou sobre a ação dos produtos comerciais, mesmo havendo indícios de que os materiais inertes potencializam o efeito tóxico dos inseticidas para as abelhas. Este 11 trabalho utilizou o produto comercial Pirate® (BASF S.A, São Paulo), que possui formulação em suspensão concentrada, classificação toxicologia 4 e ambiental II, concentração do ingrediente ativo clorfenapir 240g/L. Visto que os testes de toxicidade estabelecem valores de DL50 utilizando os ingredientes ativos, e pouco se sabe dos efeitos da formulação comercial que de fato são utilizadas nas áreas agrícolas, foi avaliado a toxicidade do produto comercial Pirate® para as abelhas Apis mellifera e determinado o valor de DL50 média tópica em 24h. 12 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Importância da abelha Apis mellifera na polinização. Polinização é a transferência de grãos de pólen entre órgãos masculinos e femininos das flores, um processo importante para a reprodução das plantas que resulta na formação de frutos e sementes. Esta pode ocorrer dentro de uma mesma flor (autopolinização), ou entre flores diferentes do mesmo indivíduo (geitonogamia), e ainda entre flores de indivíduos diferentes (polinização cruzada) (RECH et al., 2014, CARDOSO et al., 2018). A polinização é realizada tanto por animais como por vento ou água. A maioria das plantas, cultivadas ou nativas, é polinizada por animais e depende destes para sua reprodução (KLEIN et al. 2007; OLLERTON et al. 2011; ROUBIK 2018). Estudos realizados em 200 países mostraram que a produção de vegetais, frutas e sementes das 86 culturas mais importantes mundialmente, dependem da polinização, enquanto 28 não dependem diretamente de polinizadores (KLEIN et al., 2007). Nas regiões tropicais as plantas cultivadas polinizadas por animais, que são 70% do total de 1.330 cultivos, quando polinizadas adequadamente produzem frutos e sementes com melhor qualidade e maior quantidade (ROUBIK,2018). Os animais polinizadores podem ser vertebrados, como lagartos, morcegos, pássaros e alguns mamíferos, contudo a maioria são insetos, tais como borboletas, mariposas, abelhas, moscas, vespas, besouros e tripes. Entre os insetos polinizadores as abelhas se destacam e são consideradas os principais polinizadores em diversos ecossistemas (OLLERTON, 2017). As abelhas se destacam não somente por sua diversidade de espécies, morfologia e comportamento, mas também pelo seu importante papel na reprodução das angiospermas que tem suas flores visitadas e polinizadas por esses insetos. Os recursos florais coletados pelas abelhas são essenciais para sua sobrevivência, assim ao longo da evolução foi desenvolvido uma relação mutualista entre as abelhas e as angiospermas (PINHEIRO et al., 2014). Estima-se que existem de 25 a 30 mil espécies de abelhas no mundo (MICHENER, 2007), aproximadamente 20 mil espécies são conhecidas (CUNHA et al., 2014) e de acordo com Ascher e Pickering 13 (2018), cerca de 1.902 encontram-se no Brasil. A Apis mellifera é uma das mais utilizadas para a polinização de plantas cultivadas em todo o mundo devido ao fácil manejo e tamanho de suas colmeias, como também pela eficiência e rapidez nesse processo em relação aos outros polinizadores, sendo imprescindível para obtenção de frutos em diversas culturas agrícolas (PIRES et al., 2016; KLEIN et al., 2020). Ao se tornarem abelhas adultas com a tarefa de operárias essas saem para forragear assim realizam a polinização, sendo o principal agente de dispersão de pólen nas culturas comerciais, e contribuindo com o ambiente (BALBUENA et al., 2015). Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) os serviços prestados pelos agentes polinizadores à agricultura brasileira chegam a somar um valor econômico de R$ 43 bilhões em 2018. Mesmo em espécies onde ocorre a autopolinização a presença de polinizadores aumentam a produção em qualidade e quantidade. Na cultura do café, por exemplo, a ação de polinizadores aumentou em 30% o rendimento do cultivo (HIPÓLITO et al. 2018). Nas últimas cinco décadas, estudos demonstraram que o volume de produção de culturas dependentes de polinizadores aumentou em 300% e que a produção de várias culturas diminui quando os polinizadores declinam, apresentando menor crescimento e rendimento, tornando os meios de subsistência cada vez mais dependentes dos serviços de polinização (IPBES, 2016). A polinização prestada pelas abelhas são serviços essenciais ao agroecossistema e na produção de alimentos, melhoram a subsistência, são benéficas à sociedade e protegem a biodiversidade (MARTINS et al., 2020). Além de resultar em valores significativos para a economia global, a polinização é um importante insumo agrícola (POTTS et al., 2010). 2.2 Desaparecimento de Apis mellifera em áreas agrícolas. Existem diversos fatores que podem ser ameaças aos polinizadores como mudanças climáticas, uso da terra, agricultura intensiva e de larga escala, uso indiscriminados de agrotóxicos, desmatamento, poluição ambiental, espécies invasoras, efeitos indiretos do uso de organismos geneticamente modificados, pragas, patógenos, e a interação entre eles (IPBES 2016). O desaparecimento de polinizadores chamou a atenção da opinião pública a partir da divulgação do fenômeno Colony Collapse Disorder (CCD) ou síndrome do desaparecimento das abelhas, em 2007 nos Estados Unidos e posteriormente em outros países, que relatou 14 o desaparecimento de colônias de Apis mellifera (MAUÉS, 2014). Essa síndrome se caracteriza pelo desaparecimento repentino de abelhas operárias ou redução rápida no tamanho da colônia, ainda que não falte alimento, sem relato de abelhas mortas na colmeia ou proximidades (GONÇALVES, 2012; FREITAS et al., 2009). Atualmente estudos apontam que o declínio das populações de abelhas A. mellifera tem relação direta com uma combinação de fatores e está relacionada, ao menos em parte, à exposição delas a agrotóxicos, em especial aos inseticidas (GOULSON et al., 2015; FENG et al., 2017; BERNARDES et al., 2019). Segundo Krupke et al. (2012), as abelhas são contaminadas durante o processo de forrageamento, exemplo visto em plantações de milho onde as sementes foram tratadas com agrotóxicos e as abelhas se expuseram aos agrotóxicos ao coletarem recursos nas proximidades. Mesmo as abelhas visitando cultivos não tratados com agrotóxicos podem acabar sendo contaminadas pelo efeito residual, devido à pulverização em áreas com ação de ventos que carregam os agrotóxicos a grandes distâncias (PEREIRA, 2010). As perdas de colônias de Apis mellifera, no Brasil, são atribuídas principalmente ao uso intensivo de agrotóxicos em áreas agrícolas (SILVA et al., 2015; CERQUEIRA; FIGUEIREDO, 2017; CASTILHOS et al., 2019). De acordo com o Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Vegetal (SINDIVEG), no Brasil a área tratada com defensivos agrícolas cresceu 8,7% no terceiro trimestre de 2021 em comparação com o mesmo período do ano anterior. No total, 209,3 milhões de hectares foram tratados no período, contra 192,4 milhões de hectares no 3º trimestre de 2020: aumento de 16,8 milhões ha. A soja foi o produto com maior área tratada no período (32% do total), seguida por pastagem (20%), trigo (12%), milho (10%), cana de açúcar (7%) e demais cultivos. O valor de mercado dos defensivos agrícolas aplicados chegou a US$ 1,7 bilhão, com elevação de 21,7% sobre julho a setembro de 2020 (US$ 1,4 bilhão). Embora o uso de agrotóxicos não tenha como alvo os agentes polinizadores, estes acabam sendo afetados direta ou indiretamente por seus efeitos. A perda dos polinizadores geraria um prejuízo enorme para a agricultura mundial e para os ecossistemas, o que tem chamado a atenção dos pesquisadores e das autoridades pelo mundo. 15 2.3 Toxicidade de inseticidas sobre Apis mellifera. Agrotóxicos são usados na prevenção ou na cura no combate a pragas e doenças nas áreas agrícolas, especialmente em monoculturas. Os agrotóxicos interferem na atividade biológica normal dos seres vivos através dos ingrediente ativo presente em sua composição (PELAEZ et al., 2010), os que são comercializados no Brasil provocam efeitos letais e subletais nos insetos polinizadores (MALASPINA et al., 2008; FREITAS; PINHEIRO, 2012). Estudos realizados no Brasil vêm demonstrando a toxicidade de agrotóxicos para as abelhas. Tais estudos utilizam as abelhas A. mellifera como modelo, devido ao amplo conhecimento biológico da espécie, a abrangente distribuição geográfica, a facilidade de mantê-las em laboratório e também por serem as abelhas mais frequentes em culturas agrícolas (IBAMA, 2017). Os inseticidas, entre os agrotóxicos, têm por objetivo repelir ou eliminar insetos-pragas, mas acabam também eliminando outros insetos como os polinizadores e os predadores naturais de insetos-pragas (ALVES-DOS-SANTOS et al., 2014). Quando os inseticidas são aplicados na fase de floração das plantas podem contaminar o néctar e o pólen (OLDROYD, 2007; DAVID et al., 2016), fontes de alimentos indispensáveis das abelhas. Quando utilizados em larga escala podem ocasionar desequilíbrios em populações de abelhas, provocando efeitos de toxicidade aguda ou alterações comportamentais nos indivíduos, prejudicando a manutenção da colônia (MALASPINA et al., 2008). Muitos dos inseticidas têm sido relacionados a uma alta taxa de mortalidade em abelhas (RIAÑO-JIMENEZ; CURE, 2016; MARTIN- CULMA; ARENAS-SUAREZ, 2018). Diante dessa realidade, pesquisas vêm sendo realizadas para avaliar a toxicidade de diferentes inseticidas sobre esses agentes polinizadores. Estudos com o inseticida Tiametoxam, onde foram avaliadas diferentes doses crônicas e uma única dose aguda mediante exposição oral, observaram que a exposição aguda ou crônica a Tiametoxam pode alterar significativamente o voo das abelhas (TOSI et al., 2017). De acordo com Costa et al. (2014), avaliando os efeitos toxicológicos de inseticidas em A. mellifera, identificaram por meio do fornecimento de dieta contaminada, que os inseticidas Tiametoxam, Abamectina, e Clorfenapir destacaram-se como extremamente tóxicos via ingestão, dentre os nove produtos testados em sua pesquisa. 16 A toxicidade dos agrotóxicos para as abelhas é determinada em condições de laboratório por meio da dose ou concentração letal, capaz de ocasionar a mortalidade de 50% de uma população em um período de 24 ou 48 horas, a DL50 e CL50. Esses testes são realizados baseados nos protocolos e diretrizes para testes de produtos químicos da OECD (Organization for Economic Cooperation and Development) (OECD 1998a, 1998b) e são administrados tópica ou oralmente. Os protocolos avaliam a toxicidade de agrotóxicos em abelhas operárias adultas, expostas a diferentes doses em sua alimentação como parâmetro para avaliar toxicidade oral ou por contato para avaliar toxicidade tópica. A determinação do valor da DL50 pode variar devido a fatores como: idade das abelhas, variabilidade genética, variações climáticas locais e manipulação do pesquisador durante a execução dos testes (PEREIRA, 2010). Clorfenapir é um inseticida/acaricida análogo do pirazol que recentemente vem sendo amplamente utilizado, indicado principalmente para as pragas resistentes a fosforados, carbamatos, piretróides e fisiológicos. No Brasil é registrado e comumente utilizado para o controle de ácaros, tais como Tetranychus urticae, Polyphagotarsonemus latus (Banks) e Aculops lycopersici (Massee) e de insetos, como Diabrotica speciosa (Germar), Liriomyza huidobrensis (Blanchard), Bemisia tabaci (Gennadius), Tuta absoluta (Meyrick), Thrips palmi Karny e Spodoptera frugiperda (JE Smith), em culturas como algodão, batata, cebola, citros, crisântemo, feijão, mamão, milho, rosa e tomate (AGROFIT, 2020). Este composto é um pró- inseticida e a remoção oxidativa do grupo N-etoximetil de sua molécula o converte para sua forma tóxica. Nestas condições, após o composto chegar à mitocôndria provoca perdas de prótons H+. Consequentemente, tal distúrbio afeta a produção de ATP resultando na falta de energia e morte dos indivíduos suscetíveis expostos (RAGHAVENDRA et al. 2011, IRAC 2019). Um dos produtos comerciais com o ingrediente ativo de clorfenapir é o Pirate®, tem ação de contato e ingestão sobre os artrópodes-praga por ingestão, embora a ação por ingestão seja aparentemente a mais eficiente, podendo apresentar em espécies de plantas uma atividade translaminar (BASF, 2011). 17 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material biológico Abelhas campeiras de Apis mellifera de três colônias diferentes, foram coletadas no apiário do Setor de Abelhas do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do Ceará, Campus do Pici, Cep. 60356-000, Fortaleza – CE, Brasil, localizado entre as coordenadas geográficas 3.74° S e 38.58° W, clima tropical semiúmido, e conduzidas ao Laboratório de Abelhas. 3.2 Determinação da DL50 média tópica em 24h Para a determinação da dose letal média tópica em 24h foi utilizado o método internacional preconizado pela OECD (Organization for Economic Cooperation and Development), 1998a, desenvolvido para Apis mellifera, ressalvando uma adaptação no que diz respeito à anestesia das abelhas, pois no protocolo é recomendado que esse procedimento seja realizado utilizando-se dióxido de carbono ou nitrogênio e no presente trabalho foi realizado por resfriamento em um freezer. O produto comercial com o ingrediente ativo do clorfenapir (Pirate® da BASF S.A, São Paulo), foi diluído em água destilada, até se obter as doses a serem testadas (0,5 nL p.c./μL, 1 nL p.c./μL, 2,5 nL p.c./μL, 5 nL p.c./μL, 7,5 nL p.c./μL, 20 nL p.c./μL, 40 nL p.c./μL). Cada tratamento (dose) foi composto por três repetições de 10 abelhas por pote plástico totalizando 30 abelhas. As abelhas foram anestesiadas por resfriamento através de um freezer a uma temperatura de -2º C por 30 minutos. Após isso cada abelha recebeu um gota de 1µL na região do pronoto, através de uma micropipeta monocanal de volume variável, contendo as respectivas soluções do inseticida (figura 1a), exceto as do grupo controle que receberam 1µL de água destilada. Após serem expostas ao produto as abelhas foram colocadas em uma bandeja plástica por 10 minutos para que ocorresse a evaporação do solvente. Posteriormente foram acondicionadas em potes plásticos de 250 mL e colocadas em estufa BOD (demanda bioquímica de oxigênio) com suprimento de água e alimento (mel in natura) sem 18 contaminação, por meio de tubos do tipo eppendorf, temperatura de 28 ± 2ºC e umidade relativa de 70 ± 10 % durante todo o experimento (figura 1b). Figura 1 - Aplicação de 1 µL da solução inseticida na região do pronoto de abelhas Apis melífera (a) e abelhas acondicionadas em potes plásticos de 250 mL e divididas por tratamentos dentro da BOD (b). (a) (b) Fonte: autor 3.3 Análise estatísticas dos dados Cada dose testada era composta por três repetições contendo 10 abelhas por pote plástico. Foram feitas anotações de abelhas vivas e mortas 24 horas após o contato com o inseticida e os dados foram submetidos à análise estatística do tipo dose-resposta, utilizando-se o software POLO Plus (LEORA, 2003). 19 4 RESULTADOS A DL50 tópica para o produto comercial Pirate® foi de 0,79 nL p.c./µL/abelha em 24 horas (tabela 1 e figura 2). Os resultados mostraram que esse produto fitossanitário é altamente tóxico para esta espécie de abelha de acordo com a classificação de Johansen e Mayer (1990), que consideram inseticidas com uma DL50 < 2,0 µg/abelha como altamente tóxicos para esses insetos. Tabela 1. Dose letal estimada (DL50) de Clorfenapir, sobre abelhas após exposição 24 horas Tratamento η χ2 P Slope Intercepto DL50 (IC 95%) (nL/µL) Clorfenapir 240(5 ) 0.14 1 0.99 5.44± 1.54 0.541± 0.25 0.79 (0.560 - 0.981) η: número de indivíduos; Entre parênteses Graus de Liberdade; χ2:Chi-quadrado; P: Significância; DL: Dose letal; IC:Intervalo de confiança; 20 Figura 2 - Determinação da DL50 tópica em 24 horas do inseticida Pirate® para abelhas operárias de Apis mellifera. 21 5 DISCUSSÃO Os resultados apontaram que o produto comercial Pirate® é altamente tóxico, mesmo nas doses mais baixas, se mostrando mais tóxico do que estudos realizados com o ingrediente ativo clorfenapir. De acordo com o perfil ambiental do IBAMA (2020) para clorfenapir a DL50 foi de 0,2 µg/abelha em 48h, e considera-se altamente tóxico as abelhas DL50 entre 0-2 µg/abelha. Carmo et al., (2017) avaliando a toxicidade de inseticidas sobre A. mellifera constataram que clorfenapir proporciona alta mortalidade para as abelhas, com taxas de 100%. Portanto este inseticida não é considerado seletivo para A. mellifera, devendo-se ter cuidados ao usá-lo para que não haja contato com estes insetos. Em estudos sobre a toxicidade de inseticida em brássicas, Dorneles et al., (2017) concluíram que clorfenapir apresenta também alta toxicidade via oral, mesmo nas baixas concentrações testadas. Clorfenapir se encontra entre os princípios ativos que mais apresentam periculosidade para as abelhas (RHODES e SCOTT 2006). Assim, esse inseticida pode ser considerado altamente tóxico para A. mellifera de forma tópica e oral. Sendo análogo ao pirazol, grupo químico que afeta diretamente o sistema nervoso, sistema de aprendizagem e memória das abelhas, podendo afetar estruturas cerebrais com paralisia das pernas, asas e aparelho digestivo (GUNASEKARAN et al., 2007; CARRILLO et al., 2013), esse inseticida pode causar danos severos em organismos alvos e não alvos, como as abelhas e outros polinizadores. A maioria dos trabalhos publicados utilizam nos testes o ingrediente ativo e não o produto comercial, de acordo com os resultados obtidos por esse estudo é necessário investigar melhor o papel dos adjuvantes presentes nas formulações dos pesticidas, pois há indícios que os mesmos tornam os produtos ainda mais tóxicos. Pesquisas recentes observaram que a concentração dos ingredientes ativos dos pesticidas somados com seus adjuvantes, tem causado diversos efeitos fisiológicos em organismos não alvos (SURGAN et al., 2010; MULLIN et al., 2015). Contradizendo assim a informação usualmente repassada de que os materiais inertes que compõem os pesticidas comerciais são biologicamente inofensivos. Os aditivos ou adjuvantes, são substâncias inertes que compõem alguns agrotóxicos e tem por finalidade vencer as barreiras dos organismos alvo à 22 penetração, modificando a atividade dos produtos aplicados bem como as características da pulverização, promovendo uma maior eficiência na aplicação (QUEIROZ et al.,2008). Mullin et al. (2016) alertou, em sua revisão de literatura, que as avaliações dos riscos toxicológicos dos pesticidas que abordam apenas os ingredientes ativos sem os adjuvantes, poderá negligenciar resultados importantes de toxicidade para os organismos não alvo, sobretudo as abelhas. Embora os mesmos sejam considerados materiais inertes, esses mesmos autores ainda afirmam que a falta de conhecimento e informações sobre suas composições, aliado a intensa junção desses produtos aos pesticidas comerciais e a pulverização intensa no período de floração, podem estar diretamente relacionados ao declínio de abelhas melíferas nos EUA. Para a cultura do milho Pirate® é indicado para combater a lagarta-do- cartucho (Spodoptera frugiperda) na dose de 0,5 - 0,75 L p.c./ha (Agrofit), dose que se mostrou altamente tóxica para Apis mellifera com taxa de mortalidade de 100% em 24h. Este inseticida é registrado para aproximadamente 20 culturas comerciais no Brasil (AGROFIT), inclusive algumas delas na fase de florescimento onde ocorre a visitação das abelhas nessas culturas. As abelhas são importantes para o aumento de produtividade em diversas culturas tornando-se essencial a preservação desses insetos. Uma das formas de preservação desses agentes polinizadores no agroecossistema é por meio da utilização de produtos seletivos. A seletividade está relacionada ao inseticida, ou seja, a dose utilizada é capaz de controlar a praga, mas não afeta as populações de insetos benéficos (predadores, parasitoides e polinizadores) presentes nas culturas. Portanto a escolha do produto a ser utilizado no controle de pragas é muito importante para a preservação ou minimização dos impactos sobre esses insetos benéficos. Assim, visto que o Pirate® mostrou-se não seletivo para a abelha A. mellifera, as aplicações desse inseticida devem ser evitadas durante o período de florescimento das culturas. Recomenda-se a adoção de medidas que visam reduzir a exposição das abelhas a esse agrotóxico, uma das medidas seria priorizar a aplicação desse inseticida durante a noite ou adiantando crepúsculo, quando as abelhas não estiverem mais visitando as flores. Além disso, sugere-se evitar aplicações diurnas desse inseticida, principalmente nos horários de temperaturas mais elevadas do dia, período de maior atividade de forrageamento das abelhas. 23 Não foram encontrados na literatura trabalhos que apontem a toxicidade aguda de Pirate® ou do ingrediente ativo clorfenapir, com valores de DL50 e CL50. De acordo com os resultados encontrados com este produto é fundamental que mais estudos e pesquisas sejam feitas com este objetivo, para que se obtenham mais e melhores dados com essa e outras espécies, já que o inseticida estudado foi considerado altamente tóxico para A. mellifera. 24 6 CONCLUSÃO O presente trabalho demonstrou que o produto comercial Pirate® foi altamente tóxico para a espécie de abelha Apis mellifera por via tópica, mostrando-se mais tóxico do que o ingrediente ativo clorfenapir, segundo dados referentes na literatura. São necessárias mais pesquisas e estudos sobre os impactos das formulações comerciais de inseticidas em populações de abelhas, pois este estudo indicou que formulação foi mais tóxica que o princípio ativo, conforme a literatura onde há indícios de que os materiais inertes contidos nestes insumos potencializam os efeitos tóxicos, tornando-os ainda mais severos a esses insetos. 25 REFERÊNCIAS AGROFIT Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento: Disponível em: <http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons>. Acesso em: 07 jan. 2022. ALVES-DOS-SANTOS, I.; AIZEN, M.; SILVA, C. I. Conservação dos polinizadores. In: Rech, A. R. et al. (org.) Biologia da polinização. Rio de Janeiro: Projeto Cultural, p. 493-524, 2014. ASHER, J. S.; PICKERING, J. 2018. Discover life: bee species guide and world checklist (Hymenoptera: Apoidea: Anthophila). Disponível em: http://www.discoverlife.org/mp/20q? guide=Apoidea_ species. 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