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Laboratório de Química e Bioquímica Vegetal - LQBV 
 
Método adaptado em 01/09/2017 
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS 
Departamento de Química e Bioquímica 
Análises Químicas e Bioquímicas em vegetais 
Eng. Agrônomo Me. Gean Charles Monteiro 
Eng.ª Agrônoma Ma. Marla Sílvia Diamante 
Prof.ᵃ Dr.ᵃ Giuseppina Pace Pereira Lima 
FRAP 
 
1. INTRODUÇÃO 
O FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) é um teste simples, rápido, preciso, 
capaz de reproduzir em condições adversas e relativamente barato que mede a capacidade 
dos antioxidantes para reduzir o ferro férrico (Fe3+). A baixo pH, o excesso de Fe3+ na 
mistura da reação é reduzido à forma ferrosa, ao qual gera a formação de cor que está 
diretamente relacionada com a capacidade de redução da amostra. 
 
2. MÉTODO 
2.1. Reagentes e soluções 
A) Tampão Acetato 0.3 M, pH 3,6 
- 16 mL de ácido acético (CH3COOH, 17.3 M) 
- 1,87 g acetato de sódio anidro (CH3COONa, MW = 82.04) 
✓ Completar para 1 litro com H2O. 
✓ Ajustar pH para 3,6 (com NaOH 10%). 
 
B) Solução TPTZ 10 mM em 40 mM HCl 
 
- 0,156 g TPTZ (2,4,6-tristripyridyl-S-triazine, MW = 312.33) 
- 0,8 mL HCl (ácido clorídrico, 2.5 M). 
✓ Completar para 50 mL com H2O. 
 
C) FeCl3 20 mM em H2O 
- 0,273 g FeCl3*6H2O (MW = 270.3) 
✓ Completar para 50 mL com H2O. 
Obs: Preparar na hora do uso. Armazenar no escuro e/ou cobrir com papel alumínio. 
 
D) FeSO4*7H2O 50 mM para calibração 
- 0,0695 g FeSO4 (MW = 278.02) 
✓ Completar para 5 mL com H2O. 
✓ Diluir para 5 mM. 
Obs: Preparar na hora do uso. Esse reagente só é feito para calibração. 
 
E) FRAP 
- 25 mL tampão acetato 
- 2,5 mL TPTZ 
✓ Agitar para misturar o tampão e o TPTZ. 
- 2,5 mL de FeCl3 (adicionar sempre por último) 
✓ Após preparar o reagente, levar ao banho maria à 37 °C (deve ficar 
transparente). 
Laboratório de Química e Bioquímica Vegetal - LQBV 
 
Método adaptado em 01/09/2017 
Obs: Preparar na hora do uso. Armazenar em frasco âmbar. 
 
2.2. Ensaio 
 
Extração: 
➢ Pesar a amostra e adicionar o extrator (metanol ou etanol, acidificado ou não), 
entre 3 a 10 mL (fazer testes). 
➢ Levar ao banho ultrassônico por 10 minutos. 
➢ Centrifugar por 10 minutos a 6000 rpm em 10 °C. 
 
Reação: 
 Em tubos de ensaio pipetar da seguinte maneira: 
 
 
 
 
 
 
 
- Para realizar o ensaio, usar cubeta com largura de 1 cm e volume de 1 mL. 
- Zerar equipamento com H2O. 
- Leitura a 594 nm (Espectrofotômetro). 
- Marcar leitura do branco. 
✓ Após adicionar todos os reagentes, rapidamente misture e leia após 10, 30 e 60 
minutos no comprimento de onda 594 ±2 nm. 
✓ Com base na calibração com FeSO4, a atividade é expressa em micromoles ou 
mmol de Fe reduzido por litro (Fe2 L-1) ou kg, se a massa fresca ou seca do 
alimento. 
Obs: Leitura em cubetas de plástico. A reação pode ser realizada direto nas cubetas. 
 
2.3. Cálculo 
 
1°- Leitura da Amostra – Leitura do Branco = Leitura Real 
 
2°- Calibração 
 
Curva de calibração 
Vol FeSO4 (mL) Vol final (mL) M mM uM 
0,5 3,0 8,333E-05 0,08333 83,3 
1,0 3,0 0,0001667 0,16667 166,7 
1,5 3,0 0,00025 0,25 250,0 
2,0 3,0 0,0003333 0,33333 333,3 
2,5 3,0 0,0004167 0,41667 416,7 
3,0 3,0 0,0005 0,5 500,0 
Branco 
- 900 μL reagente FRAP 
- 30 μL do extrator 
- 90 μL de H2O 
 
Amostra 
- 900 μL reagente FRAP 
- 30 μL amostra 
- 90 μL de H2O 
Laboratório de Química e Bioquímica Vegetal - LQBV 
 
Método adaptado em 01/09/2017 
 
3°- Curva Padrão 
 
- Fazer a curva padrão utilizando os dados obtidos (diluições x leituras). 
 
A figura abaixo representa um exemplo de curva padrão: 
 
 
4° - Cálculo 
- Realizado utilizando a equação da reta: 
 
y = 0,6992x - 0,0044 
 
- Digamos que: 
- A leitura observada após os 30 mim foi de 0,25 Abs; 
- Portanto, substituindo a leitura da amostra (0,25) na equação, vem: 
 
X = (0,25 + 0,0044) = 0,36 mM 
 0,6992 
 
Obs: É ainda necessário realizar os cálculos de diluição (usar peso da amostra e volume 
do extrator). 
 
 
Bibliografia 
BENZIE, Iris FF; STRAIN, John J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a 
measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Analytical biochemistry, v. 239, n. 1, 
p. 70-76, 1996. 
 
y = 0,6992x - 0,0044 R² = 0,9992
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
A
b
so
rb
a
n
ci
a
 (
5
9
5
 n
m
)
Fe2 L-1 em mM
Curva Padrão