protocolo-008---extracao-de-rna-total-de-plantas-mar2013

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV 
Laboratório de Sistemática Vegetal (LSV) - DBAA 
Herbarium JABOTI (JABU) 
 
PROTOCOLOS 
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PROTOCOLO 008 
 
 
Protocolo CTAB para extração de RNA total de plantas (Bekesiova et al., 1999) 
 
1º DIA 
(confira a temperatura do banho-maria e, se necessário, ajuste para 65°C) 
1. Prepare o tampão de extração adicionando 14µL de 2-mercaptoetanol/ amostra. 
Atenção: utilize a capela para preparar esta solução e descarte lá mesmo luvas, ponteiras 
e outros descartáveis que entrem em contato com o mercapto. 
2. Pré-aqueça 700µL do tampão de extração (por amostra) a 65°C em tubos de 
2mL (ligue a centrífuga e deixe-a resfriando a 4°C). 
3. Pulverize 100mg de tecido em cadinho com nitrogênio líquido. 
4. Transfira o macerado para os tubos e misture por inversão. 
5. Leve ao banho-maria (65°C) por 15min, invertendo os tubos a cada 5min. 
6. Adicione 1mL da solução de clorofórmio: álcool isoamílico, e inverta os tubos 
por 2min. 
7. Centrifugue a 10.000 rpm por 10min a 4°C. 
8. Transfira a fase aquosa para tubos limpos e repita os passos 5 e 6 (identifique os 
tubos necessários para a próxima lavagem). 
9. Transfira a fase aquosa para tubos limpos e adicione o equivalente a ¼ do 
volume recuperado da solução de LiCl 10M. 
10. Inverta os tubos por 2min. 
11. Precipite o RNA a 4°C overnight. 
 
2º DIA 
12. Centrifugue a 10.000 rpm por 20min a 4°C (aliquote o volume de acetato e 
etanol em tubos e deixe no -20°C para gelar). 
13. Dissolva o RNA em 50µL de água DEPC 
14. Repita a precipitação, agora com 0,1 volume (~5µL) de acetato de sódio 3M (pH 
5,2) e 2,5 vol (~125µL) de etanol absoluto. 
15. Inverta os tubos por 2min e incube em freezer -80°C por, no mínimo 30min. 
16. Centrifugue a 10.000 rpm por 20min a 4°C 
17. Descarte e deixe secar o pellet 
18. Dissolva o pellet em 20-30µL de água DEPC e estoque a -20°C
 
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PROTOCOLOS 
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SOLUÇÕES REQUERIDAS 
 
1. Tampão de extração 
2. Clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) 
3. LiCl 10M 
4. Acetato de sódio 3M 
 
 Todas as soluções devem ser preparadas com água DEPC (0,1%) 
 
1. Tampão de extração 
Reagente MM [ ] final na 
solução-tampão 
[ ] final na 
solução-estoque 
Massa utilizada em 
30mL DEPC 
(solução-estoque) 
CTAB - 2% 10% 3g 
PVP - 2% 10% 3g 
Tris-HCl 
(pH 8.0) 
121,1 100mM 0,5M 1,82g 
EDTA 
(pH 8.0) 
372,24 25mM 0,125M 1,4g 
NaCl 58,44 2M (não preparar)* 5,844g* 
 
*Para cada reagente deve ser preparada uma solução-estoque com concentração 
maior, conforme tabela acima, exceto o NaCl, que deve ser adicionado diretamente ao 
tampão, conforme abaixo. 
1.1. Preparo 
As soluções CTAB e EDTA diluem melhor se aquecidas brevemente, por uns 10 
seg no microondas. A correção do pH deve ser feita separadamente em cada solução 
com adição de NaOH diluída em água DEPC. Mas, antes de utilizar o pHmetro é 
preciso lavar o eletrodo com água DEPC. 
Sob agitação adicione 10mL de cada solução-estoque. Ao final adicione aos 
poucos a quantidade necessária de NaCl, se necessário, aqueça novamente por 10seg no 
microondas e retorne a solução ao agitador. Após homogenizada (a solução fica 
transparente) complete com água DEPC para atingir 50mL. Este volume é suficiente 
para mais de 50 extrações. 
 
2. Clorofórmio: álcool isoamílico 
 
Para produzir 50mL de solução misture 2mL de álcool isoamílico a 48mL de 
clorofórmio. Atenção: estes reagentes devem ser manipulados em capela. 
 
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PROTOCOLOS 
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3. LiCl 10M 
Reagente MM [] final na 
solução-
tampão 
Massa utilizada 
em 25mL 
DEPC 
LiCl 42,39 10M 10,6g 
*Solução produz reação exotérmica, cuidado. 
 
4. Acetato de sódio 3M (pH 5.2) 
Reagente MM [] final na 
solução-
tampão 
Massa utilizada 
em 25mL 
DEPC 
Acetato de 
sódio 
136,08 3M 10,206g 
*Para corrigir o pH utilize HCl 100%. 
 
 
 
 
Referencias 
 
BEKESIOVA, I., NAP, J:P & MLYNAROVA, L. 1999. Isolation of high quality DNA 
and RNA from leaves of the carnivorous plant Drosera rotundifolia. Plant Molecular 
Biology Reporter 17: 269–277