Aula 09 - Laboratório - Sumário

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LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES
ALGETEC – SOLUÇÕES TECNOLÓGICAS EM EDUCAÇÃO
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TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS
COMPETENTES
Transformação é o processo de incorporação de DNA exógeno em uma célula
hospedeira. Esse mecanismo ocorre naturalmente como uma fonte de variação
genética em bactérias denominadas competentes, por expressarem as proteínas
necessárias para o transporte, a integração e a replicação de segmentos de DNA
extracelular (SNUSTAD, 2018). Em laboratório, a transformação de bactérias
competentes permitiu avanços importantes, como a obtenção de cópias de um gene
de interesse (clonagem gênica) e a produção de proteínas recombinantes com
utilidade para a saúde e a economia.
PRODUÇÃO DO PLASMÍDEO COM O DNA DE INTERESSE
Para que a transformação possa ocorrer, é necessário utilizar um vetor capaz
de transportar o fragmento de DNA de interesse para o interior da célula bacteriana. O
tipo de vetor mais empregado nesse processo é o plasmídeo — uma pequena
molécula de DNA circular extracromossômica presente em bactérias, apresentando
características que facilitam a manipulação em laboratório, como a presença de uma
origem de replicação que confere capacidade de duplicação do plasmídeo,
independentemente do DNA genômico bacteriano; genes de resistência a antibióticos;
e sítios de reconhecimento para enzimas de restrição (Figura 1). Essa última
característica permite que, ao submeter um vetor plasmideal e um fragmento de DNA
à clivagem pela mesma enzima de restrição, sejam geradas extremidades coesivas
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complementares que, sob condições adequadas, se unem e formam o plasmídeo
recombinante contendo o gene de interesse para a transformação bacteriana.
Figura 1 – Representação ilustrativa da estrutura do plasmídeo contendo uma origem de replicação bacteriana,
sítios de reconhecimento para enzimas de restrição (setas vermelhas) e genes de resistência aos antibióticos
ampicilina e tetraciclina. Fonte: Sadava (2020).
TRANSFORMAÇÃO E REPLICAÇÃO DO GENE DE INTERESSE
Após a obtenção da molécula recombinante, o vetor plasmideal precisa ser
transferido para o interior de bactérias competentes pelo processo de transformação.
Como a camada fosfolipídica das células bacterianas e os grupamentos fosfatos da
molécula de DNA plasmideal apresentam cargas negativas, um tratamento com íon
divalente (cloreto de cálcio, por exemplo) é realizado para a neutralização da repulsão
eletrostática existente entre a bactéria e o plasmídeo. Na sequência, a mistura é
submetida a um procedimento (choque térmico ou eletroporação) capaz de produzir a
alteração temporária da estrutura da membrana bacteriana, aumentando a
permeabilidade e permitindo a entrada do plasmídeo. Por fim, um meio de cultivo
propício para o crescimento bacteriano é adicionado à mistura, que ficará incubada
sob temperatura controlada para permitir o restabelecimento do metabolismo
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bacteriano e a replicação do plasmídeo recombinante. Como resultado, são obtidas a
proliferação bacteriana e a produção de muitas cópias idênticas do plasmídeo
contendo o gene de interesse.
SELEÇÃO DAS BACTÉRIAS TRANSFORMADAS
Mesmo oferecendo todas as condições necessárias, somente uma fração das
bactérias utilizadas terá incorporado o vetor. Para identificar e selecionar as bactérias
transformadas são utilizados genes plasmideais, cuja expressão é facilmente percebida,
funcionando como um marcador seletivo, também conhecido como gene repórter.
Uma maneira muito utilizada para a seleção envolve a exposição das bactérias a um
meio de cultura contendo um antibiótico. Conforme mencionado anteriormente,
plasmídeos contêm genes de resistência a antibióticos, de modo que somente as
bactérias transformadas sobreviveriam à exposição ao antibiótico de seleção. Por
exemplo, em reação utilizando o plasmídeo pBR322, somente as bactérias
competentes que foram transformadas, ou seja, que foram capazes de incorporar e
replicar o vetor plasmideal contendo o DNA de interesse, sobreviveriam a meios
contendo o antibiótico ampicilina (Figura 1). Dessa forma, após a realização da
transformação, as bactérias utilizadas precisam ser distribuídas em placas de Petri
contendo um meio de cultura em ágar com o antibiótico de seleção, e incubadas em
estufa para proliferação. Como resultado, é observado o crescimento de colônias de
bactérias transformadas e, consequentemente, a replicação do DNA de interesse
(Figura 2).
A transformação de bactérias competentes constitui uma técnica simples e
eficaz para selecionar e amplificar fragmentos de DNA, além de produzir proteínas
recombinantes de interesse. Sua aplicação permitiu o desenvolvimento de produtos
importantes como a insulina, o hormônio do crescimento humano e a vacina
recombinante contra o vírus da hepatite B.
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Figura 2 – Etapas da transformação de bactérias competentes: incorporação do fragmento de DNA de interesse em
um vetor plasmideal a partir da clivagem por enzimas de restrição (A) e a introdução do vetor na célula bacteriana
(B). Fonte: Borges-Osório (2013).
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BORGES-OSÓRIO, M. R.; ROBINSON, W. M. Genética humana. 3. ed. Porto Alegre:
Artmed, 2013.
SADAVA, D. et al. Vida: a ciência da biologia: constituintes químicos da vida, células e
genética. 11. ed. Porto Alegre: Artmed, 2020. v. 1.
SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de genética. 7. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2018.
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	TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES
	PRODUÇÃO DO PLASMÍDEO COM O DNA DE INTERESSE
	TRANSFORMAÇÃO E REPLICAÇÃO DO GENE DE INTERESSE
	SELEÇÃO DAS BACTÉRIAS TRANSFORMADAS
	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS