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fmvz-unesp 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU 
Curso de Pós-Graduação em Zootecnia – Nutrição e Produção Animal 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELETROFORESE 
 
Joerley Moreira & Rodrigo Garófallo Garcia 
Zootecnistas 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 robertoroca@fca.unesp.br 
 
 
 1 
 
ELETROFORESE 
1- INTRODUÇÃO 
 
 A eletroforese pode ser definida como o movimento de uma molécula 
carregada (ion) em um campo elétrico. O termo eletroforese foi criado por Michaelis, 
em 1909, para descrever a migração de colóides sob a influência de um campo 
elétrico. Eletroforese representa, portanto, a migração de íons submetidos à corrente 
elétrica. Seu princípio é simples: moléculas com carga negativa migram para o polo 
positivo (anodo), e moléculas com carga positiva migram para o polo negativo 
(catodo). Três componentes básicos são necessários para se realizar uma 
eletroforese: um campo elétrico, que é obtido através de uma fonte de corrente 
contínua, um suporte onde a molécula pode migrar e a própria molécula carregada. 
 
1.1- IONIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS 
 
A carga de uma molécula é o resultado da ionização de seus grupos 
dissociáveis. Essa ionização depende do pH do meio e do pK do grupo dissociável. 
O grau de pH. O grau de dissociação pode ser estimado pela equação de Hederson-
Hasselbalch. 
pH = pK + log {base conjugada}/{ácido conjugado} 
A migração diferencial das moléculas ou seja, a sua separação em um campo 
elétrico, resulta das diferentes quantidades de ions carregados em um determinado 
pH. 
 
1.2- MIGRAÇÕES IONICAS 
 
A eletroforese visa a separação de moléculas em função de suas cargas 
elétricas, de seus pesos moleculares e de suas conformações, em suportes porosos 
e tampões apropriados, sob a influência de um campo elétrico contínuo. 
A carga preponderante de uma molécula protéica é função dos seus 
aminoácidos. Em pH neutro, por exemplo, os componentes lisina (Lys), arginina 
(Arg) e histidina (His) contribuem com carga positiva, enquanto os radicais de ácido 
 2 
glutâmico (Glu) e ácido aspártico (Asp) exercem carga negativa. Sendo substâncias 
anfólitas, as proteínas adquirem carga positiva ou negativa em função do pH. É, 
portanto, conveniente manter o pH do meio estável durante a eletroforese, mediante 
o uso de soluções-tampão. O sistema-tampão consiste de duas partes: o tampão do 
gel, usado no preparo do gel, e o tampão dos eletrodos (catodo/anodo), usado nos 
respectivos tanques. 
Em virtude do contato elétrico dos pólos com as soluções-tampão dos 
tanques haverá participação dos componentes dos respectivos tanques na 
neutralização da base formada no catodo e do ácido formado no anoda. As 
soluções-tampão estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo da corrente elétrica, 
mas geralmente elas são inertes no processo eletroforético. 
O tampão deve, portanto , Ter acentuada condutividade elétrica. 
É costume serem aplicados, para este propósito, eletrólitos de 0,05 e 0,5 M. 
Em geral, soluções-tampão mais concentradas fornecem melhor resolução, embora 
o tempo de separação seja maior. 
Quando uma molécula com carga líquida “Q” é colocada em um campo 
elétrico “S”, sofre efeito de uma força de campo “F” que depende do campo elétrico 
e da carga da molécula. 
F = S * Q 
O campo elétrico “S” é a relação entre voltagem (V) e a distância entre os 
eletrodos (d). 
F = V/d*Q 
A velocidade de migração de uma molécula carregada pode ser alterada, 
portanto, mudando a distância entre os eletrodos bem como alterando a voltagem do 
sistema. 
Na ausência de uma força de resist6encia, a molécula acelera até encontrar o 
eletrodo. Entretanto, isso não ocorre devido à resistência resultante da fricção com o 
suporte. A força de fricção “F” é uma função do tamanho e da forma da molécula, 
viscosidade da solução e velocidade de migração como mostra a equação de 
STOKES. 
F = 6ππRNv 
F = Força de fricção 
R = Raio da molécula 
N = Viscosidade do meio 
 3 
v = Velocidade de migração 
Quando a força de resistência excede a força de propulsão da molécula, não 
ocorre a migração. Quando a força de propulsão excede a força de resistência, 
ocorre a migração da molécula carregada. Os fatores que afetam a velocidade de 
migração de uma molécula carregada podem ser obtidos quando a força de 
propulsão e a força de resistência são iguais: 
F = V/d*Q e F = 6ππRNv 
Igualando as forças: 
V/d*Q = 6ππRNv 
Isolando a velocidade: 
V = V*Q/6ππRNv 
A velocidade de migração de uma molécula carregada em um campo elétrico, 
é diretamente proporcional a carga da molécula e a viscosidade da solução. Quando 
o suporte utilizado for um gel de poliacrilamida, o efeito do tamanho dos poros 
devem ser considerados. 
Como cada molécula devem possuir carga e tamanho específicos, devem 
migrar para uma única posição em um campo elétrico, em um dado intervalo de 
tempo. Em uma mistura de ions (proteínas por exemplo), cada um deve posicionar 
em um lugar único dentro do campo elétrico. 
Submetendo-se extratos protéicos ao efeito da corrente elétrica, os seus 
componentes ionizados migrarão com velocidades individuais. 
Com vistas a uma definida enzima, em virtude de sua posição no gel depois 
da corrida, essa enzima pode ser revelada, permitindo, em consequência, 
identificações qualitativas (por sua posição) e quantitativas (pela intensidade de sua 
banda). 
 
1.3- CORRENTE ELÉTRICA 
 
A eletroforese pode ser conduzida ora sob voltagem, ora sob amperagem 
(corrente) ou, então, wattagem (potência) constantes reguladas pela fonte elétrica. À 
medida que as moléculas migram no campo elétrico, a resistência geralmente 
aumenta. Então, a amperagem diminui sob voltagem constante, ou esta aumenta 
sob amperagem constante. As variações na intensidade da corrente ou na voltagem 
 4 
podem ser detectadas na fonte de energia, anotando-se os respectivos valores no 
início e no final da corrida eletroforética. 
A escolha da voltagem, amperagem ou wattagem é feita empiricamente. 
A temperatura elevada tende a desnaturar moléculas como as proteínas, o 
que acarreta, não raro, alguma perda de atividade enzimática. Quanto mais alta a 
voltagem ou a intensidade da corrente, maior será também o calor emanado. 
Visando manter a temperatura baixa durante a eletroforese, o gel é resfriado com o 
auxílio de uma coluna de água fria em dispositivo apropriado inserido na cuba ou 
efetuando-se a corrida em geladeira. 
 
1.4- SUPORTES DA ELETROFORESE 
 
A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel-filtro, sílica-gel, 
membranas de acetato de celulose e géis de agarosa, de amido ou de 
poliacrilamida. 
O suporte deve ser química e fisicamente inerte de modo a não interferir na 
mobilidade das moléculas. O poder de resolução é importante na escolha do meio 
suporte. 
Para enzimas, géis de amido e poliacrilamida oferecem melhor separação do 
que outro suportes. Além do efeito de carga, a separação dá-se de acordo com o 
tamanho e a estrutura das moléculas (peneiramento molecular). Enquanto o 
movimento de proteínas de alto peso molecular e retardado pelo pequeno diâmetro 
dos poros do gel, proteínas de baixo peso molecular migram livremente de acordo 
com as respectivas cargas. 
A escolha do meio de suporte depende de preferências individuais i dos 
objetivos, mas de modo geral, para proteínas, géis de poliacrilamida têm sido 
preferidos por seu maior poder de resolução graças a ampla variação controlável no 
diâmetro de seus poros. Além disso, géis de poliacrilamidasão muito translúcidos, o 
que possibilita quantificar a atividade enzimática por densitômetria. A eletroforese 
em géis de amido é bem mais barata do que aquela em géis de poliacrilamida, mas 
suas lâminas não tem porosidade rigorosamente controlável e a capacidade de 
separação é, em consequência inferior. 
Por outro lado, géis de amido são compatíveis com diferentes sistemas-
tampão, o que permite otimizar a atividade e a distinção entre enzimas em função 
 5 
dos componentes da solução-tampão e de seu valor de pH. Após a secagem, esses 
géis tornam-se comparavelmente translúcidos aos géis de poliacrilamida. 
 
1.5- POROSIDADE DE GÉIS 
 
A fricção e, em consequência, a velocidade de migração de macromoléculas 
em um campo elétrico dependem da porosidade do gel. 
Em géis de amido, as cadeias de carboidratos ramificam-se e entrelaçam-se o 
suficiente para formar uma textura semi-rígida, adquirindo assim, a estrutura de gel e 
não de líquido viscoso. Ao contrário, a porosidade de géis de poliacrilamida é 
definida pelo teor de seus componentes unitários: acrilamida e N, N’- metileno-Bis-
acrilamida (Bis). Uma solução de acrilamida apenas, uma vez polimerizada, forma 
um líquido altamente viscoso. A concentração de Bis é que determinará a 
porosidade dos géis. 
Géis de agarosa apresentam porosidade bem além da obtida em géis de 
poliacrilamida. A presença de agarosa, geralmente na concentração de 0,5 %, 
imprime ao gel rigidez mecânica bem maior que a de géis de poliacrilamida sem 
agarosa. A agarosa permite a separação de ácidos nucléicos, conforme seus pesos 
moleculares, de ribossomos e de componentes de tamanhos até 200S. 
 
1.6- MOBILIDADE DOS IONS 
 
Extratos protéicos são obtidos por maceração da amostra em soluções 
extratoras apropriadas. O extrato protéico é aplicado no gel e submetido à 
eletroforese, após o que os géis, são removidos das molduras e revelados, visando 
a detecção de proteínas totais ou de enzimas específicas. Para proteínas, os géis 
são imersos numa solução de azul-brilhante-de-comssie ou corantes a base de 
prata. 
Para enzimas específicas, os géis são incubados em soluções, contendo os 
componentes (substrato, coenzimas, solução-tampão e sais) necessários para 
revelação das bandas de atividade enzimática. 
 
 
2.0- ELETROFORESE EM GEL DE AMIDO 
 6 
 
Géis naturais são de natureza química bem variada: proteínas como gelatina 
e caseína, e polissacarídeos como amido, ágar e pectina. A água se difunde em géis 
pela população de macromoléculas, rendendo porosidade uniforme do gel, o que 
garante sua morfologia. Géis apresentam o fenômeno da desidratação, a qual 
geralmente é lenta. Trata-se de uma forma de intemperismo, a sinerese. O gel, 
entretanto, mantém sua morfologia, apesar de se encolher. Por esse motivo, géis 
apropriados para eletroforese não se conservam bem por muitos dias. 
A porosidade do gel de amido varia conforme sua origem e seu preparo. O 
amido em seu estado nativo, é constituído de α-amilose e amilopectina. A α-amilose 
é formada por longas cadeias (em torno de 300 unidades) não ramificadas de D-
glucose, cujas unidades são interligadas por ligações α- 1, 4. Em água, a amilose 
forma micelas hidratadas, cujas cadeias polissacarídicas assumen a forma 
helicoidal. Já a amilopectina, embora apresente esqueleto similar ao da amilose, é 
altamente ramificada, cujos pontos de ramificação são ligações α- 1, 6. Em água, a 
amilopectina forma soluções coloidais ou micelares. 
Sob aquecimento, a suspensão aquosa de amido torna-se viscosa. 
Sua viscosidade aumenta acentuadamente a 65ºC, ponto em que os grânulos 
de amido se desfazem; a partir daqui, à medida que a temperatura aumenta, a 
viscosidade diminui abruptamente e atinge um valor mínimo e uniforme a 95ºC. 
Neste ponto, a suspensão deve ser desgaseificada e vertida para as molduras 
próprias. Após resfriamento, a suspensão geleifica-se, formando uma rede 
tridimensional de polímeros de glucose com ligações glicosídicas α- 1, 6, originárias 
da amilopectina. Quando frio, o gel está preparado para receber o extrato protéico e 
ser submetido à eletroforese. A concentração de gel define a sua consist6encia e 
porosidade. Seu preparo é relativamente empírico, o que requer habilidade do 
pesquisador. Na eletroforese em gel de amido, as moléculas, ao migrarem entre as 
malhas do gel, estão sujeitas ao efeito de fricção e peneiramento molecular, 
proporcionando o fracionamento das amostras. 
Conforme mencionado anteriormente, a eletroforese em gel de amido é 
menos onerosa do que a em gel de poliacrilamida, mas suas lâminas não 
apresentam porosidade controlada, não permitem preparo de gradientes de pH e 
sua resolução é inferior. Por ser um polímero natural, a composição do amido pode 
 7 
variar de lote para lote, o que pode afetar suas propriedades de geleificação e 
resolução, tornando-se necessário, muitas vezes, recalibrar o sistema ao utilizar 
diferentes lotes de produtos. Em pH alcalino, o gel de amido exibe ligeiro efeito 
eletroendosmótico em direção oposta a da migração das proteínas. 
Amido hidrolizado de alta qualidade, próprio para eletroforese, é 
imprescindível e encontra-se, atualmente, disponível no mercado. 
Todavia se necessário, a hidrólise do amido pode ser conduzida no 
laboratório. Para isso, 300g de amido solúvel são suspensos em 600mL de solução 
de acetona: HCl concentrado (100:1) a 38,5ºC. 
Cuidados especiais devem ser tomados para impedir a volatilização da 
solução em hidrólise. Após 45 minutos de repouso nesta temperatura, interrompe-se 
a hidrólise pela adição de 150 mL de solução aquosa de acetato de sódio 1M. A 
seguir. A suspensão é filtrada em funil de Buchner e lavada, cuidadosamente, com 
água destilada. Para remover possíveis traços remanescentes de acetato, 
resuspende-se o amido em água destilada e, após 12 horas de repouso, filtra-se a 
suspensão em funil de Buchner, lava-se novamente com água destilada e, por 
ultimo, com acetona. A seguir, seca-se o amido a 45-50ºC. Durante a hidrólise, a 
temperatura deve ser rigorosamente controlada. 
 
2.1- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
Preparo Do Gel 
1- Suspenda 39g de amido em 150mL de solução-tampão do gel (gel 13-14%), à 
temperatura ambiente, em frasco Kitazato, sob agitação constante. A solução-
tampão do gel varia de acordo com a espécie estudada. Existem várias 
composições que podem ser encontradas em livros de bioquímica ou biologia. 
2- Adicione à suspensão 150 mL da mesma solução, procurando lavar as paredes 
do frasco. 
3- Cozinhe a suspensão em forno de microondas, agitando-a fortemente a cada 40 
segundos no início e a cada 10 segundos após o aquecimento, antes de atingir a 
fervura, para que o cozimento seja homogêneo. Após o cozimento, a suspensão 
torna-se viscosa e transparente. 
4- Mantenha a suspensão no forno de microondas até a fervura. 
 8 
5- Tampe o frasco com uma rolha de borracha e adapte sua saída lateral a uma 
bomba de vácuo, para eliminação das pequenas bolhas de ar formadas durante 
o cozimento. 
6- Verta cuidadosamente a suspensão de amido nas molduras de acrílico. A fim de 
uniformizar a superfície do gel e evitar o excesso de evaporação, cubra o gel 
com uma placa de vidro. Assim que o gel atingir a temperatura ambiente, 
mantenha-o em geladeira pelo menos por 30 a 60 minutos antes de aplicar as 
amostras e proceder à eletroforese. 
 
 
2.1.1- APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS E ELETROFORESE 
 
1- Remova a placa de vidro que cobre o gel. 
2- A cerca de 2.5 cm de uma das extremidades, corte o gel com auxílio de 
escalpelo ou lâmina própria. O corte deve ser perpendicular e atingir a face 
inferior do gel. 
3- Afaste a menor porção do gel para facilitar a aplicação das amostras. 
4- Triture pequena porção do tecido (que se deseja estudar) em pequeno volume 
)10 a 20 µl) de tampão do gel ou aplique amostras previamente preparadas e 
armazenadas em tubos Eppendorf a–85ºC. Alguns materiais exigem tampões de 
extração mais complexos. 
5- Aplique, sequencialmente, ao longo da face cortada do gel maior as amostras 
adsorvidas nas tiras de papel-filtro (12 x 5mm), fazendo com estas cubram 
completamente a espessura do gel. É conveniente aplicar também solução de 
azul-de-bromofenol, quer em tira própria, quer juntamente com uma das 
amostras, para monitorar a migração. 
6- Apoie o suporte do gel sobre as cubas. 
7- Empregue o sistema-tampão gel/eletrodo adequado, de acordo com o material 
estudado. 
8- Conecte o gel às cubas dos eletrodos, mediante uma ponte de pano, tipo Perfex, 
ou similar, previamente embebida na solução tampão. 
9- Ligue o aparelho e faça o devido controle elétrico, usando-se voltagem (V), 
corrente (I) ou potência (W) constantes, dependendo do sistema-tampão 
gel/eletrodo empregado. 
 9 
10- Anote todos os dados da condição da corrida (V, A, W) aferidos no aparelho. 
Isso é importante para monitorar a análise e diagnosticar possíveis problemas 
durante a eletroforese. 
11- Faça uma pré-corrida eletroforética durante 15 minutos, a fim de que o material 
em estudo seja liberado das tiras de papel contendo o extrato para o gel. 
12- Desligue o aparelho, desconecte o gel das cubas e remova as tiras do papel filtro 
com o auxílio de uma pinça cirúrgica. Mediante o uso de cotonete, limpe a face 
cortada do gel onde foram aplicados os extratos. 
13- Apoie o suporte do gel sobre as cubas e cubra-o com um plástico, deixando livre 
cerca de 2 cm em cada extremidade. Esse procedimento evita a evaporação de 
água durante a eletroforese. 
14- Conecte o gel às cubas e religue o aparelho, tendo o cuidado de anotar os dados 
de voltagem, potência e corrente. 
 
2.1.2-PROBLEMAS COMUNS NO PREPARO DO GEL E DURANTE A 
ELETROFORESE 
 
Prob lema Causa Provável Sugestão 
Formação de 
grumos na 
suspensão 
quente 
O amido não foi bem misturado 
com a solução-tampão. 
Prepare nova suspensão, certificando-
se de que o amido seja adicionado, 
pouco a pouco, à solução-tampão e 
sob constante agitação, a fim de se 
obter uma suspensão bem 
homogênea. 
Gel flácido e 
aquoso 
Excesso de solução-tampão 
adicionada. Cozimento 
insuficiente do amido. Tempo 
insuficiente para o resfriamento 
do gel. 
Adicionar quantidade certa de 
solução-tampão. Aumentar o tempo 
de cozimento. Resfriamento num 
tempo adequado 
Gel rígido e 
difícil de fatiar 
Congelamento do centro do gel 
devido ao gelo usado para 
resfriá-lo. Cozimento excessivo 
do amido. 
Mudar o sistema de resfriamento. 
Diminuir o tempo de cozimento de gel. 
 10 
Gel de 
espessura 
irregular 
F6orma do gel fora de nível. 
Vazamento dos lados da fôrma. 
Preparar um novo gel nivelando 
adequadamente a fôrma do gel e 
prender firmemente os grampos. 
Não detecção 
de bandas 
Soluções corantes misturadas 
impropriamente. Deterioração 
dos produtos químicos ou das 
soluções-tampão. 
Uso de corantes e soluções 
apropriadas e na quantidade 
adequada. 
Arraste de 
bandas a partir 
da origem 
Baixa força iônica do tampão 
da amostra ou quantidade 
insuficiente do mesmo. 
Presença de bolhas de ar no 
gel. Presença de amilose no 
extrato cru. 
Verificar a presença de bolhas de ar 
no gel. Rever as soluções tampão. 
 
2.1.3- CORTE DO GEL EM FATIAS 
 
Com o auxílio de guias e mediante o uso de um fio de náilon, corte o gel 
horizontalmente em fatias de, aproximadamente, 1 mm de espessura. Retire, 
cuidadosamente, as fatias e distenda-as em fôrmas tipo pirex, para receber soluções 
corantes específicas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 11 
 
 
 
 
 
2.1.4- REVELAÇÃO DE PROTEÍNAS EM GÉIS 
 
Após a eletroforese, os géis são corados em soluções apropriadas para 
revelação de bandas de proteínas totais ou enzimas específicas. Para proteínas 
totais, a eletroforese é usualmente desenvolvida em géis de poliacrilamida, em 
virtude de seu maior poder de resolução. Para enzimas, tanto o gel de amido quanto 
o gel de poliacrilamida podem ser empregados satisfatoriamente, e os métodos de 
revelação são essencialmente os mesmos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.1.5- SECAGEM DO GEL 
 
Os métodos empregados para secagem dos géis variam dos mais simples, 
rápidos e baratos aos mais complexos, demorados e dispendiosos. O método usado 
Figura 1 – Preparo do gel de amido. 
Eletroforese e coloração. A: desgaseificação 
da suspensão de amido, B: adição da 
suspensão de amido na forma de gel, C: 
corte do gel, D: apli cação da amostra. 
FIGURA 2 – Cont. E: gel sobre as 
cubas, F e G: laminação do gel 
após eletroferese, H: coloração. 
 
Figura 3 – I: Coloração e revelação do gel. A: 6-fosfogluconato 
desidrogenase, B: superóxido dismutase, C: segregação 
aloenzimática em progênie de Tanatephorus cucumeris. 
 12 
deve preservar a tonalidade de coloração das bandas e manter, ao máximo, a 
integridade do gel, evitando rachaduras e encolhimento, que mascaram ao padrões 
eletroforéticos. Há disponíveis no mercado e eficientes e sofisticados secadores de 
géis que funcionam a vácuo e sob temperaturas relativamente elevadas. 
 
2.1.5.1- Método do b astidor 
 
Após coloração e fixação, o gel é mantido em solução constituída de metanol 
(65%) e glicerol (0.5%), sob agitação lenta, durante 15 minutos, a fim de remover o 
excesso de água contido nos poros do gel. Uma folha de papel-celofone bem 
poroso, ou similar, encharcada de água, é estendida sobre o arco interno de um 
bastidor de madeira, apoiado sobre um disco de isopor com espessura igual à 
largura do bastidor e diâmetro ligeiramente inferior ao da sua circunferência interna. 
O gel é colocado sobre a folha de papel-celofone e, a seguir, coberto com outra 
folha de celofone, igualmente encharcada de água e de mesma dimensão. Para 
facilitar a secagem, o conjunto gel-bastidor é mantido em posição vertical, à 
temperatura ambiente, por 24 horas. Posteriormente o gel é removido dos 
bastidores, etiquetado e arquivado para análise dos resultados. 
 
2.1.5.2- Método d a Placa de Vidro 
 
Mergulha-se o gel em uma solução aquosa de metanol (65%) e glicerol 
(0.5%), por 1 a 4 minutos. A seguir, o gel é colocado sobre uma lâmina de papel-
celofone distendida sobre uma placa de vidro, sendo o excesso de água removido 
por adsorsão, mediante o uso de papel-filtro. Uma Segunda folha de celofone de 
mesma dimensão deve ser distendida sobre o gel, tendo-se o cuidado de remover 
as bolhas que se formarem entre o gel e o celofone. O tempo de secagem pode ser 
de duas a quatro horas, a 50ºC, em forno com ventilação forçada. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 – 
Representação 
diagramática do aparato 
utilizado para secagem 
do gel de amido e 
poliacrilamida 
 13 
 
2.1.6- DOCUMENTAÇÃO DE RESULTADOS EM GEL 
 
2.1.6.1- Fotografia Convencional 
 
A câmera fotográfica é acoplada a um sistema de iluminação com luz 
incidente e transmitida. Os braços flexíveis da luminária permitem a focalização da 
luz sobre o gel. Muitas vezes apenas a luz transmitida é suficiente para sensibilizar o 
filme e obter fotos de boa qualidade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.1.6.2- Fotografia Digital 
 
A fotodocumentação digital é feita mediante o uso de um sistema 
computadorizado que permite a captura, a visualização e o processamento de 
imagens de bandas de proteínas e ácidos nucléicos reveladas em géis. O sistema 
consiste de uma câmara escura de mesa, tendo internamente um transiluminador 
móvel de luz ultravioleta (UV) para géis corados com brometo de etídio para ácidos 
 
Figura 5 – Aparato utili zado para fotografias convencionais de géis: a-base, b-haste-
suporte, c- luminária, d- lâmpadas de 200W, e- câmara fotográfica e f- 
transiluminador para luzbranca. 
 14 
nucléicos ou transiluminador de luz branca para géis de proteínas ou enzimas 
coradas. 
Em virtude de seu alto custo atualmente,este sistema é ainda inacessível à 
maioria dos laboratórios, mas suas consideráveis vantagens em relação aos 
métodos convencionais de documentação de resultados em géis justificam o seu 
uso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.0- ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA 
 
3.1- Fundamentos 
 
Géis de poliacrilamida são formados por copolimerização de acrilamida e Bis-
acrilamida (Bis) na presença de persulfato de amônia e tetrametiletilenodiamina 
(TEMED) ou riboflavina e TEMED sob luz ultravioleta ou fluorescente. O TEMED 
catalisa a liberação de radicais livres de persulfato que, por sua vez, iniciam a 
polimerização. O sistema riboflavina-TEMED exige fotoenergia para iniciar o 
 
Figura 6 – Sistema de fotodocumentação digital: a) câmara 
escura de mesa, contendo internamente um transiluminador 
de luz ultra violeta (UV) ou de luz branca; b) câmara de 
vídeo, munida de lente “zoom”; c) monitor; d) impressora 
térmica; e e) computador. 
 15 
polimerização. A fotodecomposição da riboflavina libera radicais livres que 
promovem a polimerização. 
A polimerização ocorre pela formação de radicais livres de acrilamida obtidos 
química ou fotoquimicamente. A polimerização para render géis, requer ligações 
entre as cadeias de poliacrilamida geradas por moléculas de Bis. Na falta de Bis, por 
copolimerização, causa reticulação entre as cadeias de poliacrilamida. 
O diâmetro dos poros do gel é função das concentrações de acrilamida e Bis 
(T%). Para separação de moléculas maiores, usam-se géis com menor teor de 
acrilamida. 
Para proteínas desnaturadas, empregam-se, comumente, géis com gradiente 
de concentração. Analogamente a géis comuns, a concentração do gradiente é 
escolhida de acordo com o peso molecular das proteínas em estudo. Na prática, 
confeccionam-se géis em gradiente, na faixa de 7% a 16% de acrilamida. Na 
eletroforese de proteínas desnaturadas, o SDS (dodecilsulfato de sódio) e o 
mercaptoetanol aniquilam o efeito de cargas das moléculas protéicas nativas. Neste 
caso, as separações se dão segundo o peso molecular, e a migração é 
consequência tão-somente das cargas negativas do SDS, causando efeito de 
peneiramento molecular. Quanto maior a molécula, menor a mobilidade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7 – Efeito da concentração de acrilamida sobre o 
diâmetro dos poros do gel. 
 16 
Tabela 1 – Faixa de concentração de acrilamida (T%) em relação ao peso molecular 
das proteínas a serem separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. 
Concentração de acrilamida (T%) Faixa ótima de peso molecular (kDa) 
3-5 
5-12 
10-15 
>15 
>100 
20-150 
10-80 
<15 
 
3.2- SISTEMAS DE ELETROFORESE 
 
Géis em placa têm sido comumente usados por serem mais fáceis de 
manusear e permitirem comparação de várias amostras num mesmo gel em 
condições idênticas de eletroforese. Em algumas situações, contudo, géis em tubos 
são ainda usados, especialmente na primeira direção da eletroforese bidimensional. 
Quanto a posição do gel, o sistema de eletroforese pode ser vertical ou horizontal, 
quanto aos tampões e respectivos valores de pH, o sistema pode ser contínuo ou 
descontínuo. 
No sistema contínuo, o gel tem porosidade uniforme e o tampão usado na 
preparação da amostra e do gel é o mesmo utilizado nos tanques dos eletrodos. No 
sistema descontínuo, os íons tamponante do gel são diferentes daqueles dos 
eletrodos. O sistema descontínuo consiste de géis formados por fases de diferentes 
porosidades e valores de pH. Além disso, a solução-tampão do gel é distinta 
daquela dos eletrodos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8 – Sistemas de eletroforese. A- vertical: a) tanque do eletrodo, b) cavidade do 
gel, c) gel e d) eletrodo e B- horizontal: a) tanque do eletrodo, b) eletrodo, c) ponte 
eletrolíca (Perfex), d) gel e e) ponto no gel de apli cação das amostras. 
 17 
3.3- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
Preparo das amostras 
Efetue a extração de proteínas ou material desejado. Misture uma parte do 
extrato (0.5mL) com outra (0.5mL) do tampão da amostra. No caso da análise de 
proteínas desnaturadas, use tampão da amostra contendo SDS e β-mercaptoetanol 
ou DTT e ferva as amostras por 10 minutos para completar a desnaturação. 
 
Material 
1- Estojo para preparo das placas do gel 
2- Aparelho para controle elétrico (fonte de energia) 
3- Vitrine vertical metalfrio ou geladeira comum 
4- Pipetas automáticas com respectivas ponteiras, béqueres e provetas. 
 
Componentes Acríli cos 
Acrilamida/Bis (30% T; 2.6% C): 
a) 73 g de acrilamida; 
b) 2 g de Bis; 
c) 250 mL de água deionizada. 
Filtre a solução e armazene em geladeira (a 10ºC), no escuro. 
 
Tampão do g el Separador ou de Corr ida 
Tris-HCl, pH 8.9: 
a) 45.75 g de tris base. 
b) Adicione aproximadamente 60mL de água deionizada, que deve ser previamente 
aquecida para eliminar O2 dissolvido e facilitar a dissolução. Titule com HCl 
concentrado para pH 8.9. 
c) Complete o volume para 100 mL, filtre a solução e armazene-a em geladeira. 
 
Tampão do g el Empilhador 
Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8: 
a) 7.475 g de tris base. 
b) Adicione aproximadamente 80 mL de água deionizada e titule com HCl para pH 
6.8. 
 18 
c) Complete o volume para 100 mL, filtre a solução e armazene-a á temperatura 
ambiente. 
 
Tampão do Tanque (Eletrodo ) 
Tris-glicina, pH 8.9: 
a) 63.2 g de Tris base. 
b) 39.9 g de glicina. 
c) Adicione aproximadamente 900 mL de água. 
d) Complete o volume para 1.000 mL. O pH da solução fica em torno de 9.2. Não 
ajuste o pH. Filtre a solução e armazene-a em geladeira (10ºC). Dilua a solução a 
1:10 antes do uso; o pH cairá, aproximadamente, para 8.9. 
 
Solução-Estoque de SDS 
a) 10 g de SDS. 
b) Complete o volume para 100 mL com água deionizada. 
 
Tampão da amostra 
a) Para Proteínas nativas 
a) 5 mL de glicerol. 
b) 2.5 mL de Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8 
c) 2.5 mL de azul-de-bromofenol. 
d) Complete o volume para 25 mL e armazene a solução, em alíquotas, em 
congelador a –20ºC. 
 
b) Para Proteínas Desnaturadas 
a) 5 mL de glicerol. 
b) 2.5 mL de Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8. 
c) 0.5 mL de β-mercaptoetanol ou 0.39 g de ditiotreitol (DTT). 
d) 5 mL de solução de SDS 10%. 
e) 2.5 mL de azul-de-bromofenol. 
f) Complete o volume para25 mL e armazene a solução, em alíquotas, em 
congelador a –20ºC. 
 
 19 
Persulfato de Amônia 
a) 0.05 g de persulfato de amônia. 
b) 0.5 mL de água desmineralizada. 
 
Obs:. Use sempre solução fresca, preparada imediatamente antes do uso. 
 
 
 
3.4- PREPARO DO GEL 
 
Sistema PAGE 
O termo PAGE representa eletroforese em gel de poliacrilamida. 
É usado para análise do padrão de enzimas e outras proteínas nativas. A 
concentração de acrilamida do gel separador depende do peso molecular dos 
componentes que se deseja analisar. 
Rotineiramente, usam-se géis na faixa de 7.5 a 10%. Para variar a 
concentração de acrilamida no gel, para um mesmo volume de solução, basta alterar 
o volume da solução estoque de acrilamida-Bis em relação ao da água, as 
quantidades dos demais componentes do gel permanecem inalteradas. 
Tão logo sejam preparadas as soluções de persulfato e TEMED, deve-se 
aplicar a solução nas molduras do gel. A geleificação se processa dentre de poucos 
minutos. 
Com o auxílio de uma seringa, aplique a solução do gel separador no espaço 
entre as placas de vidro até a altura de 1.5 cm abaixo da extremidade inferior do 
pente. Imediatamente após, complete com água destilada o espaço entre as duas 
placas para uniformização da parte superior do gel e para sua proteção contra 
oxigênio, que inibe a polimerização. Após a polimerização em temperatura ambiente, 
remova a água sobrenadante por decantação e uso de papel-filtro e introduza a 
solução do gel empilhador. A seguir, insira um pente de “teflon” nessa solução. Em 
seguida á polimerização, remova o pente e enxágüe as cavidades resultantescom 
solução-tampão do tanque, diluída à razão de 1:10. Remova também o excesso de 
tampão com o auxílio de papel adsorvente (papel higiênico ou papel-filtro). 
 
 20 
Sistema SDS-PAGE 
Este sistema é aplicado no estudo de proteínas desnaturadas por 
aquecimento na presença de SDS e β-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT). Ele visa 
à determinação do peso molecular de proteínas. O método empregado é similar a ao 
anterior, PAGE, exceto que SDS é adicionado às soluções do gel, e aos tanques dos 
eletrodos. A cada 30 mL de solução do gel separador e 15 mL do empilhador, usam-
se respectivamente, 200 e 100 mL de SDS a 10%. 
Aos tanques adicionam-se 10 mL da mesma solução para cada 1.000 mL de 
solução-tampão diluída a 1:10. Amostras fervidas contendo SDS e β-mercaptoetanol 
ou DTT são aplicadas no gel. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.5- APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS E ELETROFORESE 
 
Em cada cavidade do gel aplique, cuidadosamente 75 µL do extrato de 
proteína. A quantidade de amostra a ser aplicada depende da concentração de 
proteína e da atividade enzimática. Complete os volumes das cavidades com 
solução-tampão de tanque diluída (1:10) e adicione, respectivamente, nos tanques 
 
 
Figura 9 – Preparo do gel de poliacrilamida, 
eletroforese e coloração: A) suporte para placas, 
espaçadores e pente de “teflon” , B) cuba para 
eletroforese, C) montagem das placas, D) 
apli cação da solução de acrilamida. 
Figura 10 – Cont... E) colocação do 
pente de “teflon”, F) remoção do 
excesso de solução de acrilamida e 
lavagem das cavidades com solução-
tampão do tanque, G) aplicação das 
amostras e eletroforese, H) remoção 
do gel, I) coloração e J) conjunto de 
bandas de proteínas reveladas no 
gel. 
 21 
superior e inferior 500 e 1.000 mL dessa mesma solução. Calibre o aparelho para 
100 V. 
Quando a linha frontal do azul-de-bromofenol atingir o gel separador, regule o 
aparelho para 200 V. 
 
3.6- PROBLEMAS NO PREPARO DO GEL E DURANTE A ELETROFORESE 
 
Prob lema Causa Provável Sugestão 
Gel não 
polimeriza 
Má qualidade de acrilamida ou 
Bis. Solução velha de 
acrilamida/Bis ou de persulfato 
de amônia. 
Use reagentes com alto grau de 
pureza e com idoneidade. Usar 
soluções recém-preparadas. A 
solução de persulfato deve ser 
preparada no momento do uso. 
Gel 
esbranquiçado 
Concentração excessiva de Bis Verifique as concentrações e pesos 
de acrilamida e Bis. 
Gel quebradiço Concentração excessiva de Bis Verificar a concentração adequada 
de Bis. 
Rachaduras no 
gel 
Expansão e contração da 
acrilamida provocadas pela 
produção de calor durante a 
polimerização. 
Reduza a concentração de Bis. Use 
placas devidamente limpas 
Fraca coloração 
de bandas 
Receita inadequada Verifique a receita, pois é comum a 
ocorrência de erros em receitas. 
Não detecção de 
bandas 
Polaridade reversa. Baixa 
concentração de amostra. 
Corrida muito rápida ou muito 
demorada. 
Verifique a polaridade. Aumente a 
concentração da amostra. Verifique 
as concentrações das solução-
tampão e se a corrente é 
adequada. 
 
 
 
 
 
 22 
3.7- REVELAÇÃO, FOTOARQUIVAMENTO E SECAGEM DE GÉIS 
 
Assim que a linha frontal do azul-de-bromofenol atinja aproximadamente 0.5 
cm da extremidade inferior do gel, a eletroforese, por via de regra, será interrompida. 
Para moléculas de baixa mobilidade anodal, entretanto, torna-se conveniente 
prolongar a corrida mesmo após a saída do azul-de-bromofenol do gel. Após a 
eletroforese, os géis são removidos cuidadosamente, das placas e imersos numa 
solução de coloração. A revelação de bandas protéicas é, usualmente, feita com 
azul-de-coomassie (“Brilliant Blue”)0.1%. 
Outros corantes recomendados para proteínas baseiam-se no emprego de 
prata coloidal ou na redução de Ag+. Ainda apreciadas técnicas que se valem de 
amido “black, fucsida básica e preto B de Sudam”. Para enzimas, os géis são 
imersos em soluções apropriadas contendo substrato, coenzimas, etc. necessários à 
atividade de cada enzima. 
Após a revelação, os géis são fixados em solução aquosa de glicerol 10% e, a 
seguir, fotoarquivados ou desidratados. 
 
4.0- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
ALFENAS, A. C. Eletroforese de Isoenzimas e Proteínas Afins. Fund amentos e Aplicações em 
Plantas e Microorganismos. Editora Viçosa, Viçosa, Universidade Federal de Viçosa, 1998, 574p. 
 
ALFENAS, A. C. et ali. Eletroforese de Proteínas e Isoenzimas de Fungo s e Essências 
Florestais. Viçosa, Universidade Federal de Viçosa, 1991, 242p. 
 
CONN, E. E. & STUMPPF, P.K. Introdu ção à Bioqu ímica. 4ª Edição – São Paulo, Edgard Blucher, 
1980, 525p. 
 
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioqu ímica. 2ª Edição – São Paulo, 
Sarvier, 839p., 1995. 
 
SANTOS, C. D. Apostila de Bioqu ímica Prática Aplicada à Agricultura. Lavras, Universidade 
Federal de Lavras, 1997, 89p. 
 
STRYER, L. Bioqu ímica. 4ª Edição – Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1000p., 1996.