Imunologia Clínica Laboratorial

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DOCÊNCIA EM 
SAÚDE 
 
 
 
 
 
 
 
IMUNOLOGIA CLÍNICA E LABORATORIAL 
 
 
1 
 
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 Triagem Organização LTDA ME 
 Bibliotecário responsável: Rodrigo Pereira CRB 1/2167 
 Portal Educação 
P842i Imunologia clínica e laboral/ Portal Educação. - Campo Grande: Portal 
Educação, 2012. 
 94p. : il. 
 
 Inclui bibliografia 
 ISBN 978-85-8241-156-8 
 1. Imunologia clínica. 2. Imunologia laboral. I. Portal Educação. II. Título. 
 CDD 616.079 
 
 
 
2 
 
SUMÁRIO 
 
1 HISTÓRICO (DESCOBERTA DE ANTICORPOS E RELAÇÃO COM ANTÍGENOS) ............... 3 
2 ANTICORPOS: ESTRUTURA, DIFERENTES SUBCLASSES E FUNÇÃO .............................. 9 
3 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO E AGLUTINAÇÃO .................................................................. 18 
4 QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO ANTIGÊNICA OU DE ANTICORPOS................... 25 
5 MÉTODOS QUALITATIVOS ..................................................................................................... 37 
6 IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS EM CÉLULAS E ANTÍGENOS ......................................... 42 
7 METODOLOGIAS COM USO DE BIOLOGIA MOLECULAR ................................................... 49 
8 PRINCIPAIS DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS PROPOSTOS PELO MINISTÉRIO DA 
SAÚDE BRASILEIRO PARA AS SEGUINTES DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS ....... 58 
REFERÊNCIAS ................................................................................................................................... 87 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
1 HISTÓRICO ( DESCOBERTA DE ANTICORPOS E RELAÇÃO COM ANTÍGENOS) 
 
 
O sistema imune é capaz de garantir a proteção mais eficaz de indivíduos, numa 
população natural, contra os mais diversos tipos de agentes infecciosos, como: 
1. Bactérias (Figura 1); 
2. Vírus (Figura 2); 
3. Fungos (Figura 3); 
4. E parasitas (Figura 4). 
 
Este sistema é geralmente dividido em resposta imune inata e adaptativa. 
 
Na resposta imune inata temos os seguintes mecanismos de defesa: 
I. Barreiras contrainfecções como a pele; 
II. Células fagocitárias e sistema complemento; 
III. Proteínas de fase aguda como a proteína C-reativa; 
IV. Citosinas inflamatórias; 
V. Células natural killer (NK); 
VI. Eosinófilos. 
 
Já na resposta imune adaptativa temos: 
I. Estrutura e função de anticorpos; 
II. Anticorpos e também alguns componentes do sistema complemento; 
III. Base celular de formação de anticorpos; 
IV. Memória imunológica; 
V. Vacinas; 
VI. Respostas, primária e secundária. 
 
 
 
4 
 
A resposta imune adaptativa é iniciada quando há um reconhecimento específico dos 
antígenos seja por anticorpos e alguns componentes do sistema complemento, sejam por meio 
do receptor de antígenos de linfócitos T (TCR). 
Antes de mais de nada, deve-se sempre lembrar o princípio formulado por Theodosius 
Dobzhansky de que “Nada em biologia faz sentido, a não ser à luz da evolução”. Deste modo, as 
relações evolutivas das respostas imunes, inata e adaptativa adquirem contornos claros para a 
ciência imunogenética, em especial quando se estudam aspectos que evoluem as relações entre 
micro-organismos e a imunidade. Portanto, a resposta imune é resultante da coevolução e os 
processos de ativação, supressão e regulação que se desenvolvem no decorrer do 
desenvolvimento da resposta imune e que envolvem o discernimento deste sistema do que é 
“próprio” e “não próprio”. 
 
 
 
Figura 1: Foto mostrando diferentes cepas bacterianas. Disponível em: 
<http://www.bioamn.blogspot.com/>. Acesso em: 07 fev. 2009. 
 
 
 
 
 
5 
 
 
Figura 2: Foto exemplificando vírus. Disponível em: <http://www.bioamn.blogspot.com/>. Acesso 
em: 07 fev. 2009. 
 
 
 
Figura 3: Foto exemplificando fungos sobre tronco na natureza. Disponível em: 
<http://www.bioamn.blogspot.com/>. Acesso em: 07 fev. 2009. 
 
 
 
 
 
6 
 
 
Figura 4: Foto exemplificando parasitas, sendo que neste caso, são nematelmintos. Disponível 
em: <www.infoescola.com/.../nematelmintos-nematoda/>. 
Acesso em: 07 fev. 2009. 
 
 
Histórico: 
 
Há mais de um século o conceito de discriminação entre o “próprio” e o “não próprio” 
pelo sistema imune foi introduzido por bacteriologista Paul Ehrlich, aproximadamente em 1890 
(Figura 5). 
O termo “balas mágicas” foi criado por tal cientista, dando origem ao conceito de 
"receptores específicos" em Biologia. Paul Ehrlich realizou experimentos nos quais ele constatou 
que alguns tecidos se coravam com apenas certos corantes. Com tal observação, ele concluiu 
que tais tecidos exibiam "receptores" específicos para os corantes utilizados nos experimentos 
que realizou. Nessa época (em meados de 1890), nascia a Imunologia como um ramo da 
Bacteriologia Médica, ela própria um ramo nascente da Medicina experimental criado por 
Pasteur e Koch. 
 
 
 
7 
 
Um pouco mais tarde, em 1908, Paul Ehrlich, juntamente com Ilja I. Mechnikov que 
também realizou trabalhos com imunidade, ambos receberam o prêmio Nobel de Medicina. 
 
 
Figura 5: Foto do médico alemão Paul Ehrlich que introduziu o conceito do que é “próprio” e o 
“não próprio” pelo sistema imune em aproximadamente 1890. 
 
 
Relação de anticorpos com antígenos: 
 
A reação do anticorpo contra antígeno é conhecida como antígeno-anticorpo. Os 
anticorpos são glicoproteínas presentes no sangue do hospedeiro. Já os antígenos são 
quaisquer substâncias dos agentes infecciosos que ao serem introduzidos no hospedeiro são 
capazes de desencadearem a resposta imune com o reconhecimento e produção de anticorpos 
e ativação de células do sistema imune. 
O reconhecimento dos anticorpos dos diversos antígenos presentes em diferentes 
patógenos [bactérias (Figura 1), vírus (Figura 2) fungos (Figura 3) e parasitas (Figura 4)] 
envolve ligações reversíveis e não covalentes como pontes de hidrogênio, interações 
hidrofóbicas e de Van der Waals e ligações iônicas (Figura 6). 
A força de ligação entre anticorpo e antígeno é denominada afinidade. Esta força é 
comumente representada pela dissociação constante, ou seja, o Kd, é capaz de descrever a 
 
 
 
8 
 
concentração dos antígenos necessária para ocupar os locais de ligação de ½ das moléculas de 
anticorpos presentes em uma solução com anticorpo. 
Um Kd menor indica uma interação de afinidade mais forte e maior, uma vez que uma 
concentração menor de antígenos se faz necessária para ocupar os espaços de ligação. 
 
 
 
Figura 6: Esquema de ligação de anticorpos do tipo IgE ou IgG a antígenos representados na 
figura por quadrados em laranja presentes na superfície de um determinado patógeno. PAULA, 
Patrícia Ferreira de. Defesa de Mestrado em: Imunologia pelo Instituto de Ciências Biomédicas 
da USP-SP (2003). 
 
Para anticorpos específicos para antígenos naturais, o Kd usualmente varia de 10-7 a 
10-11M. O soro de um indivíduo imunizado conterá uma mistura de anticorpos com diferentes 
afinidades ao antígeno de determinado patógeno. 
Já a avidez consiste da força total de ligação entre anticorpo e antígeno, ou seja, leva 
em consideração que a dobradiça da região dos anticorpos fornece a eles flexibilidade, 
permitindo-o que um único anticorpo seja capaz de se ligar a antígenos multivalentes por maisde um local de ligação. Deste modo, embora a afinidade de qualquer um dos locais de ligação 
ao antígeno será a mesma para cada epítopo (porção específica do antígeno no qual se liga ao 
anticorpo), a força de ligação do anticorpo ao antígeno deverá levar em consideração a ligação a 
todos os locais de todos os epítopos do antígeno disponível. 
 
 
 
9 
 
2 ANTICORPOS - ESTRUTURA, DIFERENTES SUBCLASSES E FUNÇÕES: 
 
 
Os anticorpos se encontram presentes tanto em fluídos corpóreos como na superfície 
de um número limitado de tipos celulares (Figura 7). 
Os linfócitos B são as únicas células capazes de produzir anticorpos e quando se inicia 
esta produção, passam a ser chamados de plasmócitos. Em um indivíduo adulto saudável com 
70 kg é capaz de produzir cerca de três gramas de anticorpos por dia (Figura 7). 
 
 
Figura 7: Esquema mostrando principalmente, linfócitos B produzindo anticorpos. Disponível em: 
<http://www.bioamn.blogspot.com/>. Acesso em: 07 fev. 2009. 
 
Estrutura molecular dos anticorpos: 
 
Os diferentes anticorpos, também denominados imunoglobulinas ou isótipos 
compartilham as mesmas características estruturais básicas, mas são consideravelmente 
variáveis nos locais que se ligam aos antígenos (Figura 8). Tal variabilidade é importante, pois 
 
 
10 
 
permite que diferentes anticorpos sejam capazes de se ligarem a um número grande de 
antígenos, variando de 107 a 109. 
Cada molécula de anticorpo tem um núcleo simétrico composto de duas cadeias leves 
(VL - Figura 8, cada com aproximadamente 24 kD) e duas cadeias pesadas (VH - Figura 8 cada 
com aproximadamente 55 ou 77 kD) (Figura 8). 
 
Diferentes subclasses de anticorpos (isótipos): 
 
As moléculas de anticorpos podem ser divididas em classes e subclasses diferentes 
em relação às suas cadeias pesadas. As diferentes classes de anticorpos também denominadas 
isótipos e nos seres humanos são subdivididas em subclasses como mostra a Tabela 1. 
 
 
Figura 8: Diagrama esquemático da estrutura básica referente a uma molécula de anticorpo do 
isótipo IgG (imunoglobulina G). Adaptado de Abbas et al., 2000.VH: Cadeia pesada; VL: Cadeia 
leve. 
Local de ligação 
ao antígeno 
Receptor Fc e regiões de 
ligação de proteínas do 
sistema complemento 
VL 
VL 
VH 
VH 
CL CL 
CH1 
CH
1 
CH
2 
CH
2 
CH
3 
CH
3 
Dobradiça 
 
 
11 
 
Tabela 1: Classes e subclasses de anticorpos humanos e suas principais 
características. Adaptado de Abbas et al. (2000). 
Anticorpo 
ou 
imunoglobu
lina 
Subcla
sses 
Concentração no 
soro humano 
(mg/mL) 
Forma 
Secretória 
Funções 
IgA IgA1 3,0 
Monômero, 
dímero, trímero 
Imunidade da mucosa e neonatal 
 IgA2 0,5 
Monômer, 
dímero, trímero 
IgD 
Não 
tem 
___ Não tem 
Receptora de antígenos em linfócitos 
B não ativados 
IgE 
Não 
tem 
0,05 Monômero Hipersensibilidade imediata 
IgG IgG1 9 Monômero Opsonização, 
Ativação do sistema complemento, 
citotoxidade 
dependente de anticorpo, imunidade 
neonatal, imunidade passiva, feedback 
negativo 
dos linfócitos B 
 IgG2 3 Monômero 
 IgG3 1 Monômero 
 IgG4 0,5 Monômero 
IgM 
Não 
tem 
1,5 Pentâmero 
Receptora de antígenos de linfócitos B 
não ativados, ativação do sistema 
complemento 
___ Concentração indetectável. 
 
 
 
12 
 
Principais funções dos anticorpos e suas classes e subclasses: 
 
As diferentes funções das moléculas de anticorpos são desencadeadas por intermédio 
de suas capacidades de se ligarem especificamente aos diferentes antígenos e também, por 
serem capazes de interagir com outras moléculas efetoras do sistema imune como o sistema 
complemento, e diferentes células do sistema imune. Desta maneira, as funções efetoras dos 
diferentes anticorpos são dependentes de suas interações com os diversos antígenos derivados 
dos mais diversos tipos de patógenos que estão presentes no hospedeiro. No entanto, os 
anticorpos podem interagir com os antígenos do próprio hospedeiro, e assim, muitas doenças 
podem ser desencadeadas como as doenças autoimunes. 
A especificidade é um aspecto muito importante do reconhecimento ao antígeno 
aonde as moléculas de anticorpos podem se ligarem especificamente aos antígenos, 
apresentando diferenças pequenas entre suas estruturas bioquímicas. 
Essa especificidade é aplicada ao reconhecimento dos diferentes antígenos por todas 
as classes de anticorpos (Tabela 1). Além disso, devido às constituições bioquímicas de todos 
os organismos vivos serem fundamentalmente similares, o elevado grau de especificidade será 
tal que os anticorpos produzidos em respostas aos antígenos geralmente não se ligarão com 
moléculas próprias estruturalmente similares. Algumas vezes, no entanto, alguns anticorpos que 
são produzidos em resposta aos micróbios, apresentam reação cruzada aos antígenos do 
próprio hospedeiro que pode ser a base para certas doenças imunológicas como as doenças 
autoimunes. Tal fato refere-se à reação cruzada encontrada em diversas técnicas de 
imunodiagnósticos que será mais bem discutido no Módulo II. 
As respostas das moléculas de anticorpo variam dependendo do tipo do antígeno, 
envolvendo vários tipos celulares da resposta imune como macrófagos e linfócitos T, a história 
prévia de exposição ao antígeno e o local anatômico de entrada deste antígeno. 
 
 
 
 
 
13 
 
Funções das diferentes classes de anticorpos propriamente ditas: 
 
As principais funções efetoras das moléculas de anticorpos são o reconhecimento de 
antígenos, a neutralização, eliminação de patógenos e de suas toxinas. Como já dito acima, a 
eliminação dos antígenos que é mediada por anticorpos requer a participação de outros sistemas 
efetores da resposta imune como os macrófagos (Figura 9) e as proteínas do sistema 
complemento (Figuras 10 e 11; Tabela 1). 
 
 
Figura 9: O anticorpo interage com o organismo infeccioso permitindo que este seja mais bem 
reconhecido pelo macrófago (célula em laranja claro) e agindo assim, como importante opsonina. 
 
Os macrófagos, assim como as células dendríticas são células apresentadoras de 
antígenos, também chamados de APC, ou seja, células capazes de interagirem com os 
antígenos por meio do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), uma grande região 
genômica capaz de apresentar antígenos próprios e não próprios. No entanto, no exemplo da 
Figura 9, o macrófago interage com o antígeno por meio dos anticorpos que neste caso 
M 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
funcionam como moléculas facilitadoras da fagocitose, processo esse que faz parte da resposta 
imune inata. 
O sistema complemento é formado por mais de 30 proteínas presentes no soro ou na 
parede celular de diferentes tipos celulares de hospedeiros e patógenos e pode ser ativado por 
três vias diferentes: a via clássica, alternativa e da lectinas. A via clássica é ativada quando 
isótipos do tipo IgG ou IgM ligados especificamente a antígenos presentes em diversos 
patógenos, associam-se à C1q do complexo C1, que é formado pela associação de duas 
moléculas de C1r e duas moléculas de C1s e C1q (Figura 10). Com a ligação do componente 
C1q a imunocomplexos, há uma mudança conformacional dessa molécula permitindo que as 
moléculas C1r se autoativem e subsequentemente, ativem C1s. Com a ligação do componente 
C1q a imunocomplexos, há uma mudança conformacional dessa molécula permitindo que as 
moléculas C1r se autoativem e subsequentemente, ativem C1s. Com a ativação da serino-
protease C1s, há a clivagem de C4 em C4a e C4b e de C2 em C2a e C2b (Figura 10). 
Os fragmentos C2a permanecem ligados aos fragmentos C4b formando o complexo 
chamado de C3 convertase da via clássica, por apresentar atividade enzimática sobre as 
moléculas de C3, clivando-as em C3a e C3b (Figura 10). A anexação de vários fragmentos de 
C3b ao complexo enzimático C4bC2a gera atividade enzimática sobre C5 (C5 convertase) 
clivando-o em C5a e C5b (Figura 10). A partir deste ponto, inicia-sea formação do complexo 
molecular denominado complexo de ataque à membrana (MAC) (Figuras 10 e 11). Esse 
complexo é formado a partir da associação de C6, C7, C8 e várias moléculas de C9 e é capaz 
de provocar alterações na membrana ou parede celular do patógeno, podendo acarretar em 
ruptura e lise celular (Figuras 10 e 11; Tabela 1). 
Um resumo das diferentes funções dos anticorpos já foi apresentado na Tabela 1. 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
 
Figura 10: Esquema mostrando a eliminação de determinado antígeno (em verde) através da 
formação do complexo de ataque à membrana (MAC) formado a partir da ativação do sistema 
complemento via clássica. PAULA, Patrícia Ferreira de. Defesa de Mestrado em Imunologia pelo 
Instituto de Ciências Biomédicas da USP-SP (2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
C1r2C1s2 
C1q 
C1 
VViiaa cclláássssiiccaa:: 
 
C4a 
C4 C4b 
CC11ss 
C2b 
C2 C2a 
CC11ss 
C4b 
C2a 
C3b 
C4b2a3b C4b2a 
C3 C3a C5 C5a 
C5b 
MAC 
C5b 
C6 
 C
7 
C8 
C9 
 
 
16 
 
 
 
Figura 11: Micrografia eletrônica demonstrando poros na parede celular promovidos pela 
ativação do sistema complemento através da formação do complexo de ataque a membrana 
(MAC) na bactéria gram-negativa Shigella dysenteriae. Disponível em: 
<users.rcn.com/.../BiologyPages/C/Complement.html>. Acesso em: 14 fev. 2009. 
 
 
As funções dos anticorpos estão condicionadas à forma como são produzidos. Os 
anticorpos são primeiramente gerados a partir de seus primeiros contatos com o antígeno 
(resposta primária) e quando interagem através de um segundo contato (resposta 
secundária), são derivados da ativação de linfócitos B denominados linfócitos B de memória 
(Figura 12). Desta forma, a resposta secundária se desenvolve mais rapidamente, de forma 
mais intensa e duradoura, apresentando quantidades maiores de anticorpos do que a resposta 
primária (Figura 12). 
 
 
 
 
 
17 
 
 
 
Figura 12: Esquema mostrando a cinética das repostas imunes dependentes de anticorpos 
primárias e secundárias. Disponível em: 
<http://www.bioamn.blogspot.com/>. Acesso em: 07 fev. 2009. 
 
 
A) 1ª exposição: 1º contato com o antígeno desencadeia resposta imune primária, 
durante a qual são ativados linfócitos B e T que se diferenciam em células efetoras e de 
memória. 
B) e C) 1ª e 2ª exposições: Eliminando os antígenos, as células efetoras 
desaparecem, permanecendo as células de memória que promoverão uma resposta secundária 
mais rápida, intensa e prolongada frente a um segundo contato com o antígeno que 
desencadeou a resposta primária. 
 
 
 
A) 1ª exposição 
C) 2ª exposição 
B) 1ª exposição 
 
 
18 
 
3 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO E AGLUTINAÇÃO 
 
 
Precipitação 
Interações polivalentes entre anticorpos e antígenos apresentam significância 
biológica. Uma concentração correta de imunocomplexos (anticorpos-antígenos interagindo 
polivalentemente) é denominada “zona de equivalência”. (Figura 13). Neste contexto, os 
imunocomplexos formam uma extensiva rede de moléculas ligadas não covalentemente de tal 
forma que a maioria das moléculas de anticorpos e antígenos estará sobre a forma de 
complexadas em grandes massas (Figura 13). 
A reação de precipitação é um conceito importante, uma vez que imunocomplexos são 
formados naturalmente durante o desenvolvimento da resposta imune e, caso eles não sejam de 
alguma forma retirados de circulação, eles poderão se acumular em diferentes tecidos do 
hospedeiro, levando a injúria do tecido (Figura 13). 
O acúmulo de imunocomplexos nos diferentes tecidos poderá levar a doenças 
autoimunes como lúpus eritematoso sistêmico (LES). Esta doença autoimune é crônica e apesar 
de ser de etiologia desconhecida, por intermédio de pesquisas científicas já se sabe que é 
multifatorial. A LES acomete principalmente mulheres de 20 a 30 anos de idade, sendo cerca de 
90% dos casos. 
Indivíduos primariamente deficientes de proteínas do sistema complemento como 
pacientes deficientes de C1q, C1r, C1s, C2, C3 e C4 foram descritos com LES. Como os 
fragmentos C3b e C4b gerados a partir da ativação deste sistema são importantes para 
solubilização e remoção de imunocomplexos da circulação sanguínea, pacientes deficientes das 
proteínas do sistema complemento, tendem ter depósitos de grandes redes de imunocomplexos 
em diversos tecidos podendo levar ao LES, bem como outras doenças autoimunes como a 
glomerulonefrite. Além disso, a reação de precipitação é utilizada em diferentes métodos de 
imunodiagnósticos, como será visto a partir do Módulo II. 
 
 
 
19 
 
 
Figura 13: Curva mostrando como ocorre a reação de precipitação quando há excesso de 
anticorpos em solução (Zona excesso de Anticorpos); quando há a concentração adequada de 
imunocomplexos (Zona de Equivalência) e por fim, quando há excesso de antígenos em 
solução (Zona de Excesso de Antígenos). 
 
 
Aglutinação 
O fundamento básico das técnicas de aglutinação é similar ao princípio das técnicas 
que se utilizam do conceito de precipitação. No entanto, a reação de aglutinação baseia-se na 
capacidade do anticorpo se ligar ao antígeno presente em uma superfície de uma grande 
partícula de tal forma que leva a uma alteração do estado físico do antígeno que é denominada 
interação secundária (Figuras 14, 15 e 16). 
A interação secundária pode ser identificada de diferentes maneiras como, por 
exemplo, quando o antígeno está presente em uma superfície de uma partícula grande como 
uma bactéria, fungos, látex ou um eritrócito; os anticorpos, uma vez ligados, levam estas 
partículas se agruparem de modo visível num fenômeno conhecido como aglutinação (Figuras 
14 e 15). Deste modo, as reações utilizadas para identificar os diferentes grupos sanguíneos 
(ABO e Rh) utilizam-se deste princípio sendo, neste caso, denominada de hemoaglutinação (do 
grego, haima, sangue). 
ZZoonnaa ddee EExxcceessssoo 
ddee AAnnttííggeennooss 
ZZoonnaa ddee 
EEqquuiivvaallêênncciiaa 
ZZoonnaa ddee EExxcceessssoo 
ddee AAnnttiiccoorrppooss 
 
 
 
 
20 
 
Tal procedimento é utilizado para identificar qual grupo sanguíneo ABO (Figuras 14, 
15 e 16) um indivíduo possui e também pode ser utilizado para o grupo Rh, mas se deve levar 
em consideração que somente 75% dos indivíduos Rh positivos (D positivos) podem ser tipados 
desta forma, uma vez que existem os D “fracos” que necessitam ser testados pela forma de 
aglutinação indireta por meio da técnica Coombs indireto. 
Para esta tipagem utiliza-se anticorpos (aglutininas) anti-A ou anti-B e anti-D que se 
ligarão nos determinantes antigênicos A, B e D respectivamente presentes nas hemácias 
(aglutinogênios) (Figuras 14, 15 e 16). Estes aglutinogênios estão presentes em um grande 
número de cópias na superfície das hemácias, levando as células a se ligarem cruzadamente 
entre si quando da ligação do anticorpo específico (Figuras 14, 15 e 16). Estas ligações 
cruzadas ocorrem por meio da ligação simultânea de uma mesma molécula de anticorpo em 
células diferentes, uma vez que cada molécula de imunoglobulina possui pelo menos dois sítios 
de ligação ao antígeno (Figuras 8 e 16). 
 
A) Amostra de sangue na placa teste: 
 
 
 
B) Reagente anticorpo (Anti-A, Anti-B): 
 
 
 
 
 
 
21 
 
 
C) Mistura-se: 
 
 
 
D) Controle negativo: 
 
 
 
E) Leitura do resultado: Um resultado positivo é indicado por uma 
aglutinação visível, como ilustrado abaixo. 
 
 
22 
 
 
Figura 14: Exemplificando tipagem sanguínea para sistema ABO em lâminas. Disponível em: 
<www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 14/02/2009. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15: Foto mostrando o resultado final da reação de aglutinação em hemácias para sistema 
ABO em lâminas. Disponível em: <www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 14/02/2009. 
 
 
 
 
 
 
 negativo positivo 
 
 
23 
 
 
 
 
Figura 16: Esquema mostrando a reaçãode aglutinação em hemácias. Disponível em: 
<www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 14/02/2009. 
 
A relação antígeno-anticorpo (Figura 17) tem sido aplicada nas mais diversas 
metodologias para imunodiagnóstico das mais diferentes doenças existentes, sendo que, hoje, 
cada vez mais, amplia-se o número destas metodologias para melhoria da relação custo-
benefício para os diversos laboratórios clínicos espalhados por todo o país. 
Desta forma, com o intuito de que os tratamentos das diferentes doenças sejam mais 
efetivos, rápidos e acurados por intermédio de um diagnóstico o mais precoce possível, mas com 
um custo relativamente baixo; muitas metodologias já consagradas têm sido aprimoradas 
(Ferreira de Paula & Waldman, 2009). 
Neste módulo, serão apresentadas diferentes metodologias que estão separadas de 
acordo com o seu objetivo. 
 
 
 AAnnttiiccoorrppoo 
 AAnnttííggeennoo 
 
 
24 
 
 
Figura 17: Esquema apresentando a interação antígeno-anticorpo, fenômeno utilizado 
em todas as técnicas laboratoriais de imunodiagnóstico das mais diversas doenças existentes. 
PAULA, Patrícia Ferreira de. Aula de defesa de Mestrado em Imunologia pelo Instituto de 
Ciências Biomédicas da USP-SP (2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antígeno 
Anticorpo 
 
 
25 
 
4 QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO ANTIGÊNICA OU DE ANTICORPOS 
 
 
a) Imunodifusão Radial Simples (Mancini, & Fahey, 1965) 
 
A aplicação desta técnica tem sido utilizada para a quantificação de proteínas séricas, 
como componentes do sistema complemento, anticorpos como imunoglobulinas (IgM), e 
proteínas de fase aguda como a proteína C-reativa, que é uma proteína que quando está em 
níveis elevados indicadora de infecção. 
Nesta técnica, uma quantidade padronizada do anticorpo específico é incorporada ao 
gel e a mistura é colocada sobre uma placa ou lâmina (Figuras 18 e 19). Após a geilificação, são 
realizados orifícios no gel para a colocação do antígeno em volumes precisos em diferentes 
diluições, além da amostra-padrão com suas concentrações conhecidas do antígeno a ser 
quantificado (Figuras 18 e 19). 
O antígeno se difunde de acordo com seu tamanho molecular e encontra o anticorpo 
imobilizado no gel; à medida que mais antígeno chega o precipitado se dissolve (zona de 
excesso de antígeno demonstrada na Figura 13 do Módulo I) e o antígeno migra mais, 
encontrando novas moléculas de anticorpo. Após algumas horas de difusão, encontra-se a zona 
de equivalência (Figura 13 do Módulo I e Figura 18), permitindo assim, que os complexos 
antígenos-anticorpos se precipitem em um halo ao redor do orifício (Figuras 18 e 19). 
O tempo para difusão depende do coeficiente do anticorpo, sendo que moléculas 
maiores como alfa-2-macroglobulina e IgM, necessitam de até 96 horas para completar a 
migração, enquanto moléculas pequenas podem completar a difusão em 24 horas. 
A metodologia requer rigorosa padronização das condições e reagentes, como pureza 
e concentração do gel de agarose, concentração do anticorpo incorporado ao gel, espessura do 
gel na placa, uniformidade do tamanho do orifício, além do pH e concentração iônica do meio. 
 
 
 
 
26 
 
 
 
Figura 18: Esquema mostrando uma placa de imunodifusão radial simples ou Mancini onde, no 
exemplo, pretende-se investigar o antígeno encontrado na amostra de soro humano. PAULA, 
Patrícia Ferreira de. Aula de defesa de Mestrado em Imunologia pelo Instituto de Ciências 
Biomédicas da USP-SP (2003). 
 
 
Figura 19: Figura mostrando uma placa de imunodifusão radial simples ou Mancini. Disponível 
em: <www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 21 fev. 2009. 
 
 
Poços onde são 
colocados padrões 
e amostras a serem 
dosados 
Agarose 
contendo 
anticorpos 
anti-IgG humana 
Halo de precipitação 
 
IgG – anti-IgG 
Utilização: dosagem 
de IgG, IgA e IgM e 
proteínas séricas. 
Ag Ag Ag Ag 
Ag Ag Ag 
 Ag 
FFiilleeiirraa ggeerraallmmeennttee 
uussaaddaa ppaarraa ooss ppaaddrrõõeess 
110000%% 7755%% 5500%% 2255%% 
110000%% 5500%% 110000%% 5500%% 
 
 
27 
 
Após a realização do experimento, os halos serão medidos utilizando régua apropriada 
como mostra a Figura 20 e posteriormente, deverá ser realizado um gráfico da curva padrão 
confrontando as concentrações conhecidas com os tamanhos de halos medidos em mm2, onde a 
área desses halos é diretamente proporcional à concentração dos antígenos (Figura 20). 
 
A) Mais detalhe: 
 
 
B) Mais amplo: 
 
 
Figura 20: Figura mostrando como se mede, utilizando uma régua específica, os halos da 
técnica de Mancini. Disponível em: 
<www2.ucg.br/cbb/professores/49/Medicina/3_Semana/Precipitacao.ppt>. 
Acesso em: 21 fev. 2009. 
 
 
28 
 
 
 
Figura 21: Figura mostrando a curva-padrão que deverá ser realizada a partir da medida dos 
halos (mm2) comparando com as concentrações conhecidas dos padrões, para enfim, se 
conseguir as concentrações desconhecidas das amostras. PAULA, Patrícia Ferreira de. Defesa 
de Mestrado em Imunologia pelo Instituto de Ciências Biomédicas da USP-SP (2003). 
 
As vantagens da imunodifusão radial simples são: facilidade de execução, tempo 
curto de realização, não necessita de aparato especial. 
Já as principais desvantagens são: baixa sensibilidade e especificidade e difícil 
preservação do gel. A sensibilidade é uma característica inerente ao método, estreitamente 
relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou de anticorpo que poderá ser detectada. A 
especificidade indica que o método em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo 
desejado. 
 
b) ELISA e Radioimunensaio (RIA) 
 
[Ag] 
mm2 
R
2  0,90 
 
 
29 
 
O ELISA (“Enzime-linked ImmunoSorbent Assay”) e o radioimunensaio (RIA) são 
técnicas mais sensíveis que a de Manicini para determinar a concentração sérica de 
determinado antígeno ou anticorpo. 
O ELISA foi desenvolvido nos anos 1970 e muito difundido comercialmente a partir dos 
anos de 1985 como método para identificar e quantificar anticorpos anti-HIV. Neste método, que 
é o mais comumente utilizado nos laboratórios, há a imobilização de um dos componentes, 
antígeno ou anticorpo, em fase sólida que em geral é realizada utilizando uma placa de 
poliestireno (Figura 22). Além disso, a identificação e quantificação do antígeno ou anticorpo 
ocorrem através de que um dos dois é conjugado com uma enzima marcada como fosfatase 
alcalina, peroxidase ou beta-galactosidase e que preserva a sua atividade enzimática e 
imunológica. 
O substrato da enzima utilizada para esta técnica forma um produto colorido cuja 
alteração da cor poderá ser monitorada visualmente ou por meio de espectrofotômetro, que 
determina a relação entre a intensidade da cor e a quantidade que está sendo analisado na 
amostra (Figuras 22, 23 e 24). 
O método ELISA pode ser utilizado para pesquisa de antígenos por meio do: 
I) ELISA competitivo com antígeno marcado; 
II) ELISA competitivo com anticorpo marcado; 
III) ELISA de captura de antígeno ou sanduíche (Figura 22). 
 
Já para a pesquisa de anticorpos; 
I) ELISA indireto (Figura 23); 
II) ELISA de captura de Imunoglobulina classe específica; 
III) ELISA sanduíche. 
 
O ELISA apresenta então, as seguintes vantagens: 
 
 
30 
 
I) De ser um método de alta sensibilidade; 
II) Permite quantificar anticorpo ou antígeno; 
III) Ser seguro e IV) de baixo custo. 
 
Já a principal desvantagem do ELISA consiste na possibilidade de resultados 
alterados por pequenas variações na pipetagem e tempo de incubação em razão à elevada 
sensibilidade deste método. 
Exemplificando a diferenciação do método de ELISA do Radioimunensaio (RIA), será 
apresentada mais detalhadamente na Figura 22, o ELISA sanduíche e o RIA sanduíche para 
pesquisa de antígenos, que é a variação mais usada nos laboratórios. 
No caso do RIA, um radioisótopo marcado fica conjugado a um dos dois, antígeno ou 
anticorpo. Isto significa que,apenas no final da reação é que o ELISA e o RIA se diferenciam, no 
resto eles são bastante semelhantes (Figura 22). 
Apesar do RIA ser um método altamente sensível, capaz de detectar e quantificar 
substâncias presentes em amostras com limite de detecção da ordem de picogramas, capaz, 
portanto, de determinar a presença de hormônios, possui a desvantagem de ter que se 
manipular isótopo radioativo, apresentando risco operacional, a necessidade de se aplicar 
medidas especiais, bem como elevado custo de biossegurança. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
 
 
33ºº PPaassssoo:: 
44ºº PPaassssoo:: 
Ag 
11ºº PPaassssoo:: 
B) ELISA e Radioimunensaio (Sanduíche): 
22ºº PPaassssoo:: 
1º Ac 
 
 
 
 
32 
 
55ºº PPaassssoo:: 
 
Figura 22: Esquema mostrando semelhanças e diferenças entre os métodos ELISA sanduíche e 
Radioimunensaio sanduíche para a pesquisa de antígenos. Adaptado de Abbas et al., 2000. O 1º 
e o 3º passos do esquema são para lavar com tampão específico e retirar os excessos, 
respectivamente, de anticorpo e de antígeno. 
 
 
 
Radioisótop
o 
Radioimunensaio 
2º Ac 
 
Substrato 
Enzima 
ELISA 
 
 
33 
 
 
 
 
Figura 23: Esquema um ELISA indireto para pesquisa de anticorpos. Disponível em: 
<http://www.fes.br/disciplinas/far/imunologia%20clinica/>. Acesso em: 21 fev. 2009. 
 
 
(2) Anticorpo 
conjugado com 
enzima 
 
 
34 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 24: Figura apresentando uma placa de poliestireno do ELISA cuja reação do substrato 
com a enzima utilizada resultou em uma coloração esverdeada. Disponível em: 
<www.slideshare.net/labimuno>. Acesso em: 21 fev. 2009. 
 
c) Western Blotting. 
 
Em geral, este método é utilizado para identificar o antígeno e determinar a quantidade 
relativa e o peso molecular das proteínas em uma mistura proteica ou de outras moléculas. 
Em primeiro lugar a mistura é separada por meio do uso de um SDS-PAGE, de tal 
forma que as posições finais das diferentes proteínas no gel estarão de acordo com seus pesos 
moleculares como mostra na Figura 25. O aparelho utilizado para tal separação está 
representado em diferentes tamanhos na Figura 26. A partir desta separação, as proteínas são 
transferidas para uma membrana através da ação de capilaridade (blotting) ou por eletroforese 
de tal forma que a membrana adquire uma réplica das proteínas separadas como mostra a 
Figura 24. 
A posição do antígeno que se pretende obter com este teste, pode ser detectada 
utilizando o seu anticorpo específico marcado. No caso da Figura 25, o anticorpo específico foi 
marcado com um isótopo radioativo e o resultado foi revelado com o uso de autorradiografia, 
mas o anticorpo poderia ter sido marcado com enzima capaz de interagir com um substrato que 
liberasse cor assim, como ocorre no ELISA. 
 
 
35 
 
As vantagens do método de Western Blotting são: 
I) Alta sensibilidade e especificidade; 
II) Reconhecimento de antígenos individuais em um estrato; 
III) Realização de perfil de reconhecimento de antígenos; 
IV) Determinação de proteínas imunodominantes. 
 
As suas principais desvantagens são: 
I) Custo médio a elevado; 
II) Procedimento longo e propenso a erro em vários passos; 
III) Dependendo da forma de revelação do resultado pode haver problemas de 
biossegurança. 
 
 
 
Figura 25: Esquema do método Western blotting. Adaptado de Abbas et al., 2000. 
+ EElleettrrooffoorreessee 
Papel de filtro 
 
Membrana 
Papel filtro espesso 
Tampão 
AAuuttoorrrraaddiiooggrraaffiiaa 
Blotting 
 
 
36 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 26: Figura apresentando aparelho, em diferentes tamanhos (A e B) utilizado para separar 
as proteínas antigênicas de interesse em uma mistura proteica. Disponível em: 
<www.slideshare.net/labimuno>. Acesso em: 21 fev. 2009. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
5 MÉTODOS QUALITATIVOS 
 
 
a) Imunoeletroforese 
 
Este método combina eletroforese e imunodifusão dupla em meio gelificado, em 
tempos distintos, com alto poder resolutivo. A imunoeletroforese é capaz de comparar misturas 
complexas de antígenos que são separados em geral, em gel de agarose, pela aplicação de uma 
corrente elétrica. No entanto, para a realização da eletroforese, também são utilizados como 
suportes papel de filtro, acetato de celulose, gel de Agar e poliacrilamida. 
As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com seus 
pesos moleculares e cargas elétricas (Figura 27). Posteriormente, uma canaleta é recortada 
entre os poços onde foram colocadas as amostras com os antígenos e então, é preenchida com 
o anticorpo que se difunde até formar arcos de precipitação com os antígenos separados por 
eletroforese (Figura 27). 
 
 
Figura 27: Esquema mostrando como é realizada a imunoeletroforese. Adaptado de Abbas et al., 2000. PAULA, Patrícia Ferreira de. Aula de 
Imunodiagnóstico para alunos de graduação em Ciências Biológicas pelo Instituto de Biociências da USP-SP na disciplina de Imunologia do 
Departamento de imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP-SP (2001). 
 
Ag 
Ac 
+ - 
Ag 
 
 
38 
 
A imunoeletroforese é um método qualitativo que pode ser utilizado para detectar 
antígenos utilizando anticorpos específicos a eles, desde que os imunocomplexos formados 
tenham tamanho suficiente para formar as linhas de precipitação. Esta técnica também permite 
a caracterização de proteínas com confiabilidade, detectando anormalidades estruturais (padrão 
de mobilidade eletroforética) e alterações nas concentrações (espessura do arco 
precipitado). A sua principal desvantagem é que não apresenta relativamente sensibilidade 
muito alta. 
 
b) Imunodifusão dupla radial (Ouchterlony, 1947): 
 
Neste método qualitativo, os dois componentes, antígeno e anticorpo, difundem-se 
radialmente em todas as direções, a partir de orifícios no meio gelificado e se encontram 
formando linhas ou arcos de precipitação correspondentes aos imunocomplexos possíveis desta 
interação, ou seja, cada arco corresponde a um par de imunocomplexo antígeno-anticorpo 
(Figura 28). As linhas de precipitação poderão ser visualizadas com corante após lavagem das 
proteínas solúveis do meio gelificado com tampão apropriado. 
A técnica permite a comparação simultânea, por exemplo, de vários sistemas 
antigênicos contra o mesmo sistema de anticorpo de reatividade e especificidade conhecidas 
(Figura 29), desde que a interação antígeno-anticorpo tenha atingido a zona de equivalência e 
que esteja em quantidade suficiente para formar turvação ou precipitado visível (Figura 28). 
Esta técnica é muito utilizada na pesquisa e diagnóstico de determinadas doenças 
como a cisticercose. As principais desvantagens da imunodifusão radial simples são: 
I) Método semiquantitativo; 
II) Ser de baixa sensibilidade; 
III) Requer o uso de extratos antigênicos em concentração elevada, da ordem de 
mg/mL. 
 
 
 
39 
 
 
Figura 28: Esquema mostrando como é realizada a imunodifusão radial dupla. PAULA, Patrícia 
Ferreira de. Aula de Imunodiagnóstico para alunos de graduação em Ciências Biológicas pelo 
Instituto de Biociências da USP-SP na disciplina de Imunologia do Departamento de imunologia 
do Instituto de Ciências Biomédicas da USP-SP (2001). 
Figura 29: Esquema mostrando as diferentes possibilidades de resultados da interação 
antígeno- anticorpo em uma imunodifusão radial dupla. Disponível em: 
<www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 28 fev. 2009. 
 
 
Identidade total ou fusão Identidade total ou fusão 
não Identidade 
Identidade parcial com 
formação de esporão 
Identidade parcial com 
formação de duplo esporão 
Identidade total e 
independência 
Ag 
Ac 
 
 
40 
 
c) “Veneral Disease Research Laboratory” (VDRL) 
 
O VDRL é um teste sanguíneo rotineiramente utilizado no diagnóstico da sífilis, mas 
que também tem sido aplicadono seguimento terapêutico desta doença. 
A base do VDRL consiste no uso de um anticorpo que é produzido pelo paciente com 
sífilis e que reagem contra cardiolipina, presentes em numerosos tecidos e que atingem 
elevados níveis na infecção por Treponema pallidum. 
O VDRL pode permanecer reagente por longos períodos, mesmo após a cura da 
infecção, porém, apresenta quedas progressivas em suas titulações, até que se torna não 
reagente. Desta forma, esse teste é indispensável para o seguimento da sífilis pós-tratamento. 
Recomenda-se que o exame seja realizado de seis em seis meses até o final do segundo ano. 
No caso dos recém-nascidos não infectados, eles podem apresentar os anticorpos 
maternos e por isso, o teste será reagente até o 3º mês de vida. Isto significa, que se o 
diagnóstico for realizado dentro do período de nascimento do bebê até o seu terceiro mês de 
vida, o resultado será falso-positivo. 
Muitas outras condições podem gerar resultados falso-positivos como viroses 
(mononucleoses, hepatites), drogas, gravidez, febre reumática, artrite reumatoide, lúpus 
eritematoso sistêmico, malária e lepra. Desta forma, apesar de apresentar alta sensibilidade, o 
VDRL apresenta baixa especificidade. 
Em geral, para os indivíduos adultos, quando o teste VDRL for negativo, será 
compatível a um indivíduo sem sífilis. Entretanto, indivíduos podem ser negativos para VDRL e 
ainda terem sífilis, uma vez que nos estágios iniciais da doença, o VDRL em geral é negativo e 
esta condição é denominada, falso-negativo para VDRL. 
A titulação do VDRL ocorre por meio da aglutinação do sangue que é proporcional à 
quantidade de anticorpos presentes no sangue, podendo diluí-lo uma, duas, três ou quatro vezes 
mais até que a reação não aconteça mais. No entanto, os títulos de VDLR são considerados 
positivos quando 1/16 ou superiores. 
 
 
 
41 
 
Neste teste, aproximadamente 1% dos pacientes com sífilis na fase secundária (as 
diferentes fases da sífilis será visto no Módulo IV), apresenta o efeito pró-zona. Este efeito 
consiste no excesso de anticorpos no indivíduo a ser testado, proporcionando um resultado 
falso-negativo. Isto porque, como já apresentado por intermédio da Figura 13 do Módulo I, 
quando há excesso de anticorpos, não há a zona de equivalência necessária para a visualização 
do resultado de um teste. Mas, tal fenômeno ocorre quando o soro não for diluído, por isso existe 
a necessidade de diluí-los de 1/16 ou mais. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
42 
 
6 IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS EM CÉLULAS E ANTÍGENOS: 
 
 
a. Imunofluorescência 
 
A imunofluorescência é utilizada com o objetivo de se identificar a distribuição de um 
antígeno anatomicamente, ou seja, sua localização em tecidos ou células, intracelular ou de 
membrana. Esta metodologia caracteriza-se pela utilização de anticorpos que permanecem 
ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos. 
Os fluorocromos são moléculas que absorvem luz em comprimento de onda baixa e 
elevada energia e são capazes de emitir luz em comprimento de onda maior, de menor energia. 
Este fenômeno é conhecido como fluorescência. 
O fluorocromo geralmente usado na técnica de imunofluorescência é o isotiocianato 
de fluoresceína, mas também pode ser utilizado a lisamina-rodamina B, vermelho Texas e 
ficoeritrina. Cada um desses florocromos apresenta uma emissão de cor de comprimentos de 
onda diferentes, garantindo que se realizem testes simultâneos para identificação de diferentes 
marcadores celulares. 
Esta técnica constitui basicamente em incubar o tecido ou célula com um anticorpo 
marcado com o fluorocromo e a posição onde ocorreu esta marcação poderá ser visualizada, por 
intermédio da leitura final deste ensaio, utilizando um microscópio de fluorescência. A Figura 30 
exemplifica como seria a visualização do resultado por meio da técnica de imunofluorescência. 
 
 
 
 
 
 
 
43 
 
 
Figura 30: Foto mostrando o depósito de IgG em biópsia renal por meio da técnica de 
imunofluorescência. Disponível em: <www.fleury.com.br>. Acesso em: 07 mar. 2009. 
 
A vantagem deste método é que ele é altamente específico e sensível e sua principal 
desvantagem é o elevado custo do microscópio utilizado para a visualização do resultado da 
imunofluorescência. 
Como poderá ser visto, a seguir, na Figura 31, existem duas variações desta 
metodologia: 
I) Imunofluorescência direta; 
II) Imunofluorescência indireta. 
 
I) Imunofluorescência direta (Figura 31): 
 
A imunofluorescência direta é caracterizada pela detecção do antígeno diretamente 
em células ou tecidos utilizando o anticorpo específico ao antígeno que se deseja localizar 
marcado com o fluorocromo. 
 
 
 
44 
 
Este tipo de imunofluorescência é utilizado para a detecção direta de micro-organismos 
em secreções como na urina, nas fezes, em cortes de tecidos entre outros, além de ser usado 
na caracterização de células tumorais. 
A principal limitação deste tipo de teste de imunofluorescência tem haver com a 
relação custo-benefício, pois se faz necessário a utilização de um conjugado para cada antígeno, 
elevando o seu custo. 
 
II) Imunofluorescência indireta (Figura 31): 
 
A imunofluorescência indireta utiliza um anticorpo anti-imunoglobulina marcado com 
fluorocromo para a detecção de anticorpos que se ligarão a antígenos presentes em células ou 
tecidos. 
Os conjugados de fluorocromo e anti-imunoglobulina permitem identificar os diferentes 
isótipos de anticorpos presentes na amostra a ser testada, como anti-IgG ou anti-IgA. 
Esta variação do teste de imunofluorescência tem a vantagem de apresentar maior 
sensibilidade e possibilidade de se utilizar o mesmo conjugado de fluorocromo e anti-
imunoglobulina para vários sistemas, reduzindo o custo do teste. 
A imunofluorescência indireta é usada no diagnóstico de diversas doenças 
infecciosas como doença de Chagas, AIDS e hepatites; além de imunocomplexos de doenças 
autoimunes. 
 
 
 
 
 
 
 
45 
 
 
Figura 31: Esquemas dos tipos de imunofluorescência. Adaptado de Abbas et al. (2000). 
 
b) Citometria de Fluxo (FACS) 
 
A citometria de fluxo é um método multiparamétrico capaz de analisar individual e 
simultaneamente os componentes estruturais celulares. Além de possibilitar a investigação dos 
diferentes estágios de maturação ou ativação celulares por meio da análise da expressão de 
diferentes moléculas intracelulares ou da superfície celular. 
Nesta técnica, as células são geralmente marcadas com fluorocromos e assim, a 
fluorescência emitida pela célula é medida por meio do desvio de luz incidente. Em relação ao 
método de imunofluorescência, a citometria de fluxo apresenta a vantagem de permitir a 
detecção do tamanho relativo da célula e sua granulosidade. 
Como mostra a Figura 32, na citometria de fluxo, populações celulares misturadas 
com diferentes anticorpos marcados com fluorocromos (em vermelho e em azul claro) passam 
por um feixe de laser (em amarelo) que incidirá sobre a célula, permitindo que essa crie 
Imunofluorescência: 
FFlluuoorrooccrroommoo 
Direta 
Indireta 
 
 
46 
 
diferentes sinais fluorescentes de acordo com o fluorocromo que ela estiver ligada (vermelho ou 
azul claro). Os tipos celulares serão separados de acordo com esses diferentes sinais gerados, 
conforme mostra a Figura 32. 
A Figura 33 mostra um exemplo de resultado (gráfico) obtido a partir da citometria de 
fluxo. 
Esta metodologia é bastante utilizada nos laboratórios de análise clínica para a 
contagem e fenotipagem das células do sangue periférico, uma vez que essas células 
apresentam em suas membranas antígenos específicos geralmente classificados com um 
número correspondente ao seu e denominados “cluster of diferentiation” (CD), como 
exemplificado na Figura 33. 
Na clínica, é comum ainda à aplicação desta metodologia na monitorização da infecção 
pelovírus de imunodeficiência humana (HIV) através da quantificação das populações 
linfocitárias T CD4+ e T CD8+. Isto porque, os o linfócitos T CD4+ decrescem progressivamente a 
partir da infecção, uma vez que o HIV infecta essas células tão importante para a resposta imune 
contra agentes infecciosos; enquanto que os linfócitos T CD8+ elevam quantitativamente a partir 
da infecção. 
Outra importante contribuição desta metodologia é no diagnóstico de leucemias e 
linfomas, uma vez que com ela se é capaz de se reconhecer antígenos específicos presentes na 
superfície ou no interior de células normais e de células neoplásicas em vários estágios de 
maturação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
47 
 
 
Figura 32: Esquema da citometria de fluxo (FACS). Adaptado de Abbas et al. (2000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FFlluuoorreessccêênncciiaa 
Analisa e 
Separa 
Citometria de Fluxo (FACS) 
 
 
48 
 
 
Figura 33: Gráfico resultante de uma citometria de fluxo (FACS) mostrando um histograma de 
células normais de sangue periférico obtido em função da positividade para a molécula CD45. 
Disponível em: <www.labmed.pt/>. Acesso em: 07 mar. 2009. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
49 
 
7 METODOLOGIAS COM USO DE BIOLOGIA MOLECULAR: 
 
 
a) Reação em cadeia da polimerase (PCR e RT-PCR): Conceito, Descrição da 
técnica, exemplos de utilização 
 
A) PCR 
 
A metodologia da reação em cadeia pela polimerase (PCR- “polymerase chain 
reaction”) permite obter a quantidade suficiente para se detectar e analisar qualquer sequência 
específica de DNA em estudo. 
Com essa metodologia qualquer sequência específica de DNA poderá ser amplificada 
a partir de diversos materiais biológicos como sangue, urina, cabelo e biópsias de tecidos. No 
entanto, a molécula de DNA deverá ser extraída do material coletado utilizando proteínas 
desproteinizantes como o fenol, clorofórmio, capazes de desnaturar e retirar as proteínas que 
ficam associadas à molécula de DNA no interior do núcleo. Posteriormente, o etanol é 
adicionado permitindo que o material genético se precipite no tubo e por fim, possa ser 
solubilizado utilizando solução de tampão apropriada. 
 
Conceito 
 
A PCR, desenvolvida pelo geneticista Kary Mullis em 1993, utiliza a enzima Taq-
polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus, que atua em elevadas temperaturas e 
baseia-se no processo de replicação do DNA que ocorre in vivo. Desta forma, para se entender 
melhor esta metodologia, primeiramente se faz necessário, relembrar alguns conceitos básicos 
de biologia. 
 
 
50 
 
O DNA é uma molécula de fita dupla formada por quatro nucleotídeos básicos: guanina 
(G), citosina (C), timina (T) e adenina (A); sendo que a guanina interage com a citosina e a timina 
com a adenina. In vivo, para que haja a replicação do DNA, essa molécula deverá se separar de 
forma a permitir que nucleotídeos novos emparelhem com cada uma das fitas de DNA 
separadas. 
A ligação destes novos nucleotídeos e a formação de duas novas fitas de DNA 
ocorrerá a partir da presença de um conjunto de enzimas existentes no núcleo dos diferentes 
tipos celulares e que são importantes em cada etapa da replicação do DNA. 
Assim como ocorre in vivo, a PCR também permite a formação de novas fitas de DNA. 
Neste caso, sequências específicas de DNA se amplificam em aproximadamente 1 Kb de 
comprimento por meio da repetição dos chamados ciclos de DNA, como será visto a seguir. 
 
 
Descrição da técnica 
 
A PCR envolve ciclos múltiplos de um processo que pode ser dividido nas seguintes 
etapas: 
 
1) Denaturação, que significa separação da fita dupla de DNA em duas fitas únicas; 
2) Anelamento de oligonucleotídeos do tipo primers à sequência molde de DNA; 
3) Extensão do primer ao longo da sequência-alvo de DNA; 
4) Formação de novas fitas duplas de DNA. 
 
1) Denaturação (Figura 34): 
 
 
 
51 
 
A separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples ocorre quando se eleva a 
temperatura da amostra de DNA para 95º a 100ºC. 
 
2) Anelamento dos primers (Figura 34): 
 
O primer constitui em uma pequena sequência de ácido nucleico que se liga à fita de 
DNA alvo. Ele serve como ponto de partida para adição (extensão) de nucleotídeos (A, G, C, T) 
complementares ao longo do resto da fita molde de DNA. 
Na PCR, é necessário que se tenha um conhecimento prévio da sequência do DNA 
que se deseja amplificar que é denominada sequência-alvo. A partir disso, desenham-se dois 
primers, ou seja, duas sequências iniciadoras que serão capazes de começar o processo de 
síntese da sequência alvo, ou seja, uma que servirá para promover a síntese da sequência-alvo 
em um sentido da fita de DNA (3’-5’) e outro para o sentido inverso (5’-3’). 
O anelamento dos primers, ou seja, a ligação dos primers à sequência-alvo 
ocorrerá quando a temperatura for diminuída para aproximadamente 40º a 60ºC. 
 
3) Extensão do primer ao longo da sequência-alvo de DNA (Figura 34): 
 
A extensão do primer ao longo da sequência-alvo de DNA ocorrerá por intermédio da 
adição de nucleotídeos com o uso da polimerase estável ao calor (Taq- polimerase). Neste caso, 
a temperatura deverá ser elevada para 70º a 75ºC. 
 
4) Formação de novas fitas duplas de DNA, como mostra a Figura 34. 
 
 
 
 
52 
 
O procedimento inteiro incluindo as quatro etapas do ciclo de DNA pode ser realizado 
com um tubo de plástico de microcentrifuga contendo uma reação com uma mistura de tampões, 
nucleotídeos, primers, Taq- polimerase e uma amostra de DNA molde. 
 
Figura 34: Esquema da metodologia da reação em cadeia pela polimerase (PCR) com suas 
etapas. Disponível em: <www.dialogica.com.ar/>. Acesso em: 28 mar. 2009. 
 
O aparelho utilizado para esta técnica é um termociclador (Figura 35) que é capaz de 
controlar as diferentes temperaturas necessárias para a realização da PCR de forma 
automatizada e contínua. 
 
 
 
53 
 
Através da PCR, uma única molécula de DNA poderá se multiplicar em mais de um 
bilhão de cópias após 30 ciclos em menos de três horas, dependendo do tempo aplicado para 
cada passo no ciclo e do tipo de termociclador usado. 
 
 
Figura 35: Foto de um termociclador. Disponível em: <www.saberweb.com.br/>. Acesso em: 14 
mar. 2009. 
 
 
O produto amplificado poderá ser visualizado por intermédio de um gel de 
eletroforese corado com brometo de etídeo e o seu tamanho poderá ser estimado comparando 
com padrões lineares de DNA, apresentados fora da foto na Figura 36. 
 
 
 
 
 
 
54 
 
 
Figura 36: Foto de eletroforese em um gel de agarose de produtos amplificados por PCR. 
Acesso em: <www.geocities.com/>. Acesso em: 14 mar. 2009. 
 
 
As principais vantagens da PCR são ser simples e rápida e a necessidade de 
quantidades pequenas de DNA alvo. Desta forma, a PCR constitui uma das mais poderosas 
ferramentas da biologia molecular atualmente sendo cada vez mais utilizada pelos 
pesquisadores e em laboratórios clínicos, além de poder ser utilizada para vários fins como 
poderá ser visto a seguir. No entanto, suas principais limitações constituem na reprodutividade 
relativamente baixa no padrão das bandas eletroforéticas e no problema da contaminação do 
DNA por outro material genético que não aquele que se pretende investigar. 
 
 
 
 
 
55 
 
Exemplos da utilização da PCR 
 
A PCR pode ser usada não só para amplificar sequências de moléculas de DNA, mas 
também permite detectar mutações em uma sequência-alvo, ou mesmo detectar moléculas de 
DNA de organismos que não são fáceis de serem cultivados. Além disso, por meio desta técnica 
é possível realizar comparações genotípicas entre linhagens de diferentes organismos. 
Por outro lado, a PCR constitui uma das técnicas mais usadas em laboratórios de 
pesquisas médicas e biológicas para diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas, testes 
de paternidade e na medicina forense e criação de organismos transgênicos. 
 
B)RT-PCR 
 
A descrição técnica da RT-PCR é a mesma que a de PCR mostrado acima, uma vez 
que a RT-PCR constitui uma variação da PCR. Desta forma, para a sua realização, se faz 
necessária a utilização de uma enzima denominada transcriptase reversa, previamente ao uso 
da polimerase. 
A transcriptase reversa é uma enzima capaz de realizar uma transcrição ao contrário, 
ou seja, capaz de polimerizar moléculas de DNA a partir de moléculas de RNAm (RNA 
mensageiro) e é encontrada naturalmente em vírus como o HIV. 
O isolamento da transcriptase reversa permitiu que houvesse adaptação da PCR e 
assim, moléculas de RNA são convertidas para moléculas de DNA, denominadas de cDNA. Elas 
recebem este nome por ser uma fita de DNA complementar ao RNA, sendo que, a partir da 
síntese do cDNA, protocolos padrões da metodologia da PCR já apresentada acima são 
utilizados como pode ser visto na Figura 37. 
 
 
 
 
56 
 
 
Figura 37: Esquema mostrando uma reação de RT-PCR. 
A) Início da utilização da enzima transcriptase reversa. 
B) Síntese do DNA complementar (cDNA). 
C) Início da reação do PCR, mostrado na Figura 36. 
Disponível em: <http://www.rsbcancer.com.br>. Acesso em: 14 mar. 2009. 
 
 
Exemplos da utilização da RT-PCR 
 
A técnica de RT- PCR permite estudar a expressão de um gene específico, pois só 
haverá cDNA para ser amplificado, se tiver existido um RNAm que corresponde, portanto, à 
expressão do gene responsável pela transcrição deste RNAm. 
A expressão para a produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da 
célula dentro do organismo do hospedeiro, como por exemplo, células musculares expressam 
proteínas diferentes das células cardíacas. Além disso, existem vários artigos na literatura 
 
 
 
57 
 
especializada mostrando adaptações desta técnica para os mais diversos objetivos e a partir de 
diferentes amostras como plantas e outros animais como porcos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
58 
 
8 PRINCIPAIS DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS PROPOSTOS PELO MINISTÉRIO DA 
SAÚDE BRASILEIRO PARA AS SEGUINTES DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS 
 
 
A doença infecciosa pode ser entendida como uma doença, humana ou animal, que 
se manifesta de forma clínica e que se resulta de uma infecção. Por sua vez, infecção é a 
penetração de micro-organismos no organismo de um hospedeiro, produzindo-lhe danos, com 
ou sem o aparecimento de sintomas clinicamente reconhecíveis. 
 
a) Doença de Chagas 
 
A doença de Chagas é endêmica nas Américas, ou seja, exclusiva do continente 
americano, mas com agravamento entre os países em desenvolvimento pela precariedade das 
condições de saúde e higiene, bem como elevado grau de pobreza e miséria. 
 
I. História natural 
 
A doença de Chagas é uma doença parasitária causada pelo protozoário flagelado 
Trypanossoma cruzi (Figura 38) que é transmitido principalmente por intermédio dos barbeiros 
da espécie Triatoma infestans. (Figura 39). A transmissão ocorre no momento da picada, que é 
quando os barbeiros eliminam suas fezes infectadas pelo protozoário para o homem, mamíferos 
domesticáveis como cão, gato e rato doméstico e animais silvestres como gambá e morcego. 
 
 
 
 
 
 
59 
 
 
Figura 38: Foto mostrando o Trypanossoma cruzi visto ao microscópio. Disponível em: 
<cbme.usp.br/.../microbiologia__1/trypanossoma>. Acesso em: 21 mar. 2009. 
 
Por outro lado, existem relatos da transmissão ter ocorrido via transfusão sanguínea, 
quando o sistema de controle de transfusão não foi eficiente e até mesmo, transmissão 
congênita (da mãe para o rebento), mas neste último caso com morte prematura. 
 
Figura 39: Foto mostrando do Triatoma infestans., vetor da doença de Chagas. Disponível em: 
<http://www.sucen.sp.gov.br>. Acesso em: 21 mar. 2009. 
 
 
 
60 
 
A doença de Chagas apresenta a fase aguda e a fase crônica, sendo que seus 
sintomas podem variar ao longo da infecção. A fase aguda é assintomática ou apresenta 
sintomas geralmente mais leves como febre, mal-estar geral, cefaleia e edemas causados na 
pálpebra denominados sinal de Romaña ou no local de inoculação do Trypanossoma cruzi. 
Com a progressão da doença, durante até 20 anos, os sintomas tornam-se crônicos e 
graves tais como doença cardíaca e do aparelho digestivo. Se não tratada, a doença de chagas 
crônica é muitas vezes fatal. 
 
II. Diagnóstico laboratorial da Doença de Chagas 
 
A confirmação da infecção pelo protozoário Trypanossoma cruzi (Figura 38) é 
realizada por intermédio de critérios clínico-epidemiológicos e laboratoriais. 
As metodologias utilizadas podem ser parasitológicas diretas, ou seja, com o intuito de 
se identificar o Trypanossoma cruzi (Figura 38) no sangue periférico como pesquisa direta do 
parasita em gotas de sangue por microscopia ou sorológicos, como a aplicação do ELISA e de 
imunofluorescência. 
Na fase aguda, a parasitemia (parasita presente no sangue) é mais intensa e, 
portanto, a sensibilidade de todos os métodos parasitológicos é considerada elevada nesta 
fase. Enquanto que na fase crônica, quando há menor parasitemia, ou são utilizados métodos 
que aumentam o número de tripanossomas como o cultivo deles, mas há a preferência para o 
uso de métodos sorológicos capazes de medir os anticorpos IgG antiantígenos do 
Trypanossoma cruzi (Figura 38). 
 
b) Dengue 
 
O dengue é uma doença infecciosa febril causada por um arbovírus da família 
Flaviviridae de evolução benigna na maioria dos casos. 
 
 
61 
 
A sua forma de transmissão ocorre pela picada da fêmea do mosquito Aedes aegypti 
(Figura 40) infectado com o arbovírus da família Flaviviridae ao homem, sendo que não ocorre 
transmissão de pessoa para pessoa. 
 
 
Figura 40: Foto da fêmea do mosquito Aedes aegypti responsável pela transmissão do vírus 
causador do dengue ao homem. Disponível em: <http://www.fiocruz.br>. Acesso em: 21 mar. 
2009. 
 
O dengue é classificado em quatro tipos diferentes de vírus, ou seja, os sorotipos 1, 2, 
3 e 4, sendo que, no Brasil, predominam os sorotipos 1 e 2. 
O dengue pode se apresentar clinicamente das seguintes formas: infecção 
inaparente, dengue clássica (DC), febre hemorrágica de dengue (FHD) e síndrome do 
choque do dengue (SCD), que pode evoluir para óbito. 
Geralmente, o DC se inicia com uma febre alta abrupta, seguida de cefaleia, 
prostração, mialgia, anorexia, náuseas, vômitos, manchas avermelhadas, dores nas articulações, 
entre outras características não só atribuíveis ao dengue. 
No início, embora a FHD e a SCD apresentarem sintomas semelhantes ao da DC 
podem evoluir para hemorragias e ocasionalmente, falência múltipla dos órgãos e ao óbito. 
Desta forma, nestes casos, o quadro clínico se agrava rapidamente. 
 
I. Diagnóstico laboratorial do dengue 
 
 
62 
 
O diagnóstico do dengue compreende de exames clínicos, laboratoriais e investigação 
epidemiológica. Deste modo, o diagnóstico definitivo da dengue é realizado por intermédio de 
métodos de isolamento do vírus, de algum dos antígenos virais ou da detecção de seu RNA no 
soro ou tecido dos pacientes. 
O isolamento viral é realizado a partir das amostras do sangue, derivados ou tecidos 
coletados nos primeiros cinco dias após o início da febre, sendo importante para a identificação 
do sorotipo viral circulante. Já a detecção de seus antígenos virais é realizada por 
Imunofluorescência e RNA, por RT-PCR. 
A detecção de anticorpos também é empregada para fins de diagnóstico, sendo o 
método de ELISA para captura de IgM é o mais usado. Neste teste, o objetivo é detectar 
anticorpos IgM específicos aos quatro sorotipos do vírus da dengue, pois esses isótipos se 
desenvolvem rapidamente, podendo ser detectados após o 5º dia de desenvolvimento da 
doença e portanto precocemente. Além disso, na maioria dos casos, apresenta a vantagem de 
necessitar somente de uma amostra do soro para a realização do ELISA. 
 
c) FebreAmarela 
 
A febre amarela é uma doença febril aguda de curta duração (12 dias), causada por 
um vírus da família Flaviviridae. É epidemiologicamente dividida em febre amarela urbana e 
silvestre, ou seja, a forma silvestre é transmitida principalmente pelo mosquito do gênero 
Haemagogus janthinomys para macacos e o homem, poderá se infectar acidentalmente quando 
entra neste ecossistema. Enquanto que a forma urbana é transmitida principalmente pelo Aedes 
aegypti (Figura 40) para o homem. 
A febre amarela é uma doença de gravidade variável, sendo que o quadro típico 
apresenta evolução bifásica, ou seja, período de infecção e período de intoxicação. 
O início dos sintomas da febre amarela é abrupto, com febre alta, calafrios, cefaleia, 
dorsalgia, mialgia, prostração, náuseas e vômitos, durando cerca de três dias. Posteriormente, o 
caso poderá evoluir para a cura ou para a forma mais grave (período de intoxicação) que se 
caracteriza pelo aumento da febre, diarreia, reaparecimento de vômitos, instalação de 
 
 
63 
 
insuficiência hepática e renal. A icterícia que é discreta no início da doença se intensifica, 
ocorrem manifestações hemorrágicas, prostração intensa, podendo levar ao estado de coma. 
 
i. Diagnóstico laboratorial da febre amarela 
 
O diagnóstico da febre amarela é clínico, epidemiológico e laboratorial. A comprovação 
da infecção pode ser realizada pelo isolamento do vírus a partir de amostras de sangue, 
derivados ou tecidos coletados nos primeiros cinco dias após o início da febre. Além disso, o 
genoma viral poderá ser demonstrado utilizando PCR, enquanto que antígenos do vírus da febre 
amarela no sangue ou no tecido do paciente poderão ser demonstrados utilizando a metodologia 
de imunofluorescência. 
O diagnóstico sorológico, assim como a dengue, é realizado principalmente através do 
ELISA para captura de IgM contra antígenos do vírus da febre amarela, sendo que, na maioria 
dos casos, apresenta a vantagem de necessitar apenas de uma amostra de soro para a sua 
realização. 
 
d) HIV/AIDS 
 
I. História natural 
 
A Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença caracterizada por 
uma disfunção grave do sistema imunológico do indivíduo infectado pelo vírus de 
imunodeficiência humana (HIV) (Figura 41) com dois tipos conhecidos HIV-1 e HIV-2. O 
indivíduo portador do vírus HIV se torna incapaz de controlar infecções oportunistas 
principalmente pela significativa destruição dos linfócitos T CD4+. 
 
 
 
 
64 
 
 
Figura 41: O Vírus HIV infectando uma célula. Disponível em: <http://www.fiocruz.br>. Acesso 
em: 21 mar. 2009. 
 
O HIV pode ser transmitido por: relação sexual; transfusão de sangue ou de produtos 
sanguíneos contaminados; uso de agulhas ou seringas contaminadas; da mãe para o filho 
durante a gravidez, parto ou por meio do leite materno infectado ou até mesmo, acidentalmente, 
por intermédio do contato de sangue com mucosas ou ferimentos na pele ou perfurações com 
instrumentos perfurocortantes infectados com HIV. 
No entanto, o vírus HIV não é transmitido pelo convívio social ou familiar, por abraço 
ou beijo, alimentos, água, picada de mosquitos ou outros insetos. 
 
A evolução da HIV/AIDS pode ser dividida em três fases: 
 
A) Fase aguda 
 
 
 
65 
 
Essa fase ocorre de poucos dias até duas semanas a partir da infecção por HIV e o 
indivíduo pode apresentar febre, dor de garganta, mialgia, fadiga, diarreia, lesão na mucosa oral, 
entre outras, dificultando o diagnóstico da doença por apresentar sintomas semelhantes a outras 
doenças virais. 
 
B) Infecção assintomática ou Latência clínica 
 
Esta fase que apresenta duração variável de alguns anos, o indivíduo permanece livre 
de qualquer sintoma e aparentemente, nada tem de diferente de um indivíduo sadio, a não ser 
pelo fato de que se for realizado um teste sorológico, este indivíduo apresentará anticorpos 
contra HIV. 
 
C) Doença sintomática (AIDS) 
 
A AIDS propriamente dita é definida por diversos sinais, sintomas e doenças, 
principalmente as oportunistas, que com a progressiva destruição de células imunológicas, o 
indivíduo não consegue mais combater infecções causadas por micróbios que em condições 
normais não seriam patogênicos como candidíase e herpes simples; ou mesmo infecções com 
outros micróbios que podem se reativar na presença do vírus HIV, como é o caso da tuberculose 
pulmonar, a doença oportunista mais comum entre os pacientes com AIDS. 
 
II. Diagnóstico laboratorial de HIV/AIDS 
 
O diagnóstico laboratorial do HIV em pacientes portadores desse vírus é realizado por 
intermédio da utilização de metodologias que permitam investigar anticorpos anti-HIV, antígenos, 
material genético ou que isolem o vírus em cultura. 
 
 
66 
 
Para os indivíduos menores de 18 meses de idade, é indicado investigar o DNA ou 
RNA viral, uma vez que poderia haver reação cruzada com os anticorpos maternos nas 
crianças. Desta forma, poderão ser utilizados PCR para DNA viral e RT-PCR para RNA viral. 
Já para aqueles com mais de 18 meses de idade, os testes que pesquisam os 
anticorpos são os mais utilizados como o método de ELISA, Western Blotting e 
Imunofluorescência Indireta. 
No entanto, deve ser levado em consideração que os anticorpos anti-HIV somente 
serão detectáveis em torno de 30 dias após a infecção em indivíduos imunologicamente 
competentes. Esse intervalo entre a infecção e a detecção dos anticorpos por metodologias 
laboratoriais é denominado janela imunológica. Nesse período, as provas sorológicas podem 
ser falso-negativas e por isso, há a necessidade de realizar mais de um teste em tempos 
diferentes. 
Em geral, o método de ELISA é usado amplamente como teste inicial para a detecção 
de anticorpos anti-HIV no sangue dos pacientes, sendo que se o resultado for positivo, o 
indivíduo deverá realizar outros testes adicionais, denominados confirmatórios como a 
Imunofluorescência Indireta e Western Blotting. 
 
e) Hepatites Virais A, B, C, D e E 
 
Embora, cada hepatite seja causada pelo seu respectivo vírus, ou seja, vírus para 
hepatite A (VHA), para B (VHB), para C (VHC), para D (VHD) e para hepatite E (VHE); o 
termo hepatite viral engloba processos inflamatórios do fígado causados por vírus. 
 
 
I. Hepatite A 
 
 
 
 
67 
 
O principal modo de transmissão do VHA é fecal-oral por meio da ingestão de água e 
alimentos contaminados. Deste modo, é mais comum onde há condições precárias de 
saneamento básico. 
A hepatite A viral é aguda com o início dos sintomas (com a duração média de sete 
dias) caracterizado principalmente por mal-estar, cefaleia, febre baixa, dores abdominais, fadiga 
intensa, perda de apetite, náuseas e vômitos. 
O estágio posterior é caracterizado pela presença de icterícia (amarelamento da pele 
e dos olhos causado pelo acúmulo de bile no sangue) que se apresenta com intensidade variável 
e colúria (urina escura castanho-avermelhada) e sua duração é de, geralmente, quatro a seis 
semanas. Por outro lado, a hepatite A é considerada benigna, com a recuperação completa de 
praticamente 99% dos casos. 
 
a. Diagnóstico laboratorial da hepatite A 
 
O diagnóstico pode ser clínico-laboratorial e clínico-epidemiológico. Primeiramente, são 
realizados exames capazes de identificar alterações hepáticas como as dosagens de 
aminotransferases que indicam a lesão do parênquima hepático, podendo estar em níveis três 
vezes maiores que o normal. 
Como apenas os sintomas clínicos não são capazes de identificar o agente etiológico, 
ou seja, não é capaz de identificar o VHA responsável pelo desenvolvimento da doença, a 
aplicação de exames sorológicos torna-se fundamental. 
De três a quatro semanas após a infecção por VHA, os isótipos IgM poderão ser 
detectados por ELISA e eles persistem por cerca de quatro meses. Enquanto que, os isótipos de 
IgG quando detectados, constituem marcadores de infecção passada ede vacinação para essa 
doença, permanecendo no sangue durante toda a vida do indivíduo. 
 
II. Hepatite B 
 
 
 
68 
 
As principais formas de transmissão do VHB são: via sexual, transfusão de sangue e 
procedimentos médicos, odontológicos e hemodiálises sem as adequadas normas de 
biossegurança. 
A hepatite B viral pode ser assintomática ou sintomática. Quando sintomática, ocorre 
principalmente febre baixa, mal-estar e dor nas articulações, podendo ou não haver icterícia. 
Essa fase aguda tende a desaparecer em um período inferior a seis meses. No entanto, alguns 
indivíduos podem desenvolver a forma crônica com processo inflamatório hepático por mais de 
seis meses, podendo culminar em cirrose hepática ou até mesmo câncer de fígado. 
 
a. Diagnóstico laboratorial da Hepatite B 
 
Além dos testes aplicados para se verificar alterações hepáticas como se faz para 
investigar a hepatite A, métodos sorológicos e de biologia molecular são realizados nas fases 
aguda e crônica, considerando diferentes moléculas denominadas marcadoras da hepatite B, ou 
seja, são indicadores da presença e diferentes estágios da doença como são mostradas nas 
Tabelas 2 e 3, a seguir. Desta forma, a confirmação diagnóstica é realizada por exame destes 
marcadores no sangue. 
 
Tabela 2: Marcadores sorológicos e seus respectivos significados para a hepatite B 
aguda. Retirado de: Ministério da Saúde. Guia de Bolso. Volume I, 2004. 
Marcador Significado 
HBsAg 
É o primeiro marcador detectado no curso da infecção por HBV e 
declina rapidamente a níveis indetectáveis. 
Anti-HBc-IgM 
Marcador recente da infecção, permanecendo no soro até seis meses 
após a infecção. 
Anti-HBc-IgG Marcador de longa duração que representa contato prévio com o vírus. 
 
 
69 
Pode estar presente nas infecções agudas e crônicas. 
HBeAg Indicador de replicação viral. Sua presença indica alta infectividade. 
HBV-DNA 
Níveis deste marcador durante a fase de replicação intensa do vírus 
estão acima de 100.000 cópias/mL. 
Anti-HBe 
Surge após o desaparecimento do HBeAg, indicando o fim da fase 
replicativa do VHB 
Anti-HBs 
É o único anticorpo que confere imunidade ao HBV. Está presente no 
soro após o desaparecimento do HBsAg, indicando cura e imunidade. Está 
presente também isoladamente em indivíduos vacinados. 
 
 
Tabela 3: Marcadores sorológicos e seus respectivos significados para a hepatite B 
crônica. Retirado de: Ministério da Saúde. Guia de Bolso. Volume I, 2004. 
Marcador Significado 
HBsAg Sua presença por mais de seis meses indica hepatite crônica. 
HBeAg Está presente enquanto ocorrer replicação viral na infecção crônica. 
Anti-HBe 
Sua presença sugere redução ou ausência da replicação viral, 
indicando melhora bioquímica e histológica. 
HBV-DNA 
É encontrado em qualquer fase da doença, sendo, portanto necessário 
ser quantificado para monitorar tratamento. 
 
O DNA deste do VHB-DNA pode ser detectado por PCR e os anticorpos e seus 
antígenos por ELISA. 
 
 
 
 
70 
 
III. Hepatite C 
 
A hepatite C constitui um dos problemas mundiais mais graves de Saúde Pública por 
causa do grande número de casos que evoluem para a forma crônica, podendo levar para 
cirrose e câncer do fígado. 
A sua transmissão ocorre principalmente após o contato com o sangue contaminado 
via transfusão de sangue, usuários de drogas injetáveis e trabalhadores de saúde que se 
acidentam com agulhas contaminadas, mas também pode ocorrer via sexual, principalmente 
entre indivíduos com muitos parceiros sexuais. 
 
a. Diagnóstico laboratorial da hepatite C 
 
O principal método sorológico utilizado para diagnosticar a hepatite C é o método de 
ELISA para a detecção de anticorpos anti-VHC. A presença do vírus deve ser confirmada pela 
investigação qualitativa do vírus VHC por PCR. 
 
IV. Hepatite D 
 
A hepatite D ou delta é uma doença viral aguda que pode evoluir para forma crônica, 
sendo que pode ser transmitido junto com o VHB a indivíduos sem contato prévio com o vírus da 
hepatite B, caracterizando uma coinfecção, ou ainda, pode ser transmitido a indivíduos já 
portadores do antígeno HBsAg, caracterizando uma superinfecção. Na verdade, o VHD 
necessita do VHB para produzir a infecção por hepatite D. 
O VHD é transmitido de forma semelhante ao VHB, ou seja, via sexual, transfusão de 
sangue e procedimentos médicos, odontológicos e hemodiálises sem as adequadas normas de 
biossegurança. 
 
 
 
71 
 
A hepatite D apresenta-se assintomática, sintomática ou com formas gravíssimas, 
podendo levar a óbito. 
 
a. Diagnóstico laboratorial da hepatite D 
 
Os exames laboratoriais realizados são os mesmos aplicados para identificação dos 
marcadores para hepatite B, bem como anticorpos IgM e IgG anti-HDV detectados pelo método 
de ELISA. 
 
V. Hepatite E 
 
A hepatite E é uma doença viral aguda de curso benigno, que não cronifica, podendo 
apresentar-se de forma assintomática ou com sintomas semelhantes ao da hepatite A, sendo 
que a icterícia é observada na maioria dos casos. 
O VHE é transmitido via oral-fecal, semelhante à hepatite A, mas se apresenta 
principalmente no Sudeste da Ásia, África, México e por enquanto, apenas existem registros 
sorológicos de sua circulação no território brasileiro e não há descrição de casos. 
 
a. Diagnóstico laboratorial da hepatite E 
 
O diagnóstico é clínico-laboratorial, sendo que o ELISA é a técnica mais usada para a 
detecção de seu marcador sorológico que é a IgM anti-VHE. Tal marcador tem sido detectado 
em 95% dos casos com infecções recentes, ou seja, cerca de quatro dias após o início dos 
sintomas e desaparece após quatro ou cinco meses. O RNA deste vírus pode ser detectado por 
meio do uso de RT-PCR. 
 
 
 
72 
 
f) Leptospirose 
 
A leptospirose é uma doença infecciosa causada pela bactéria Leptospira interrogans 
(Figura 42) que acomete homens e animais. O seu modo de transmissão para o homem é pelo 
contato com água ou solo contaminado, pela urina dos animais portadores, sendo o rato o 
principal foco de disseminação da doença no meio urbano. Deste modo, após enchentes e 
calamidades onde se sabe que houve contaminação do ambiente com esgotos (moradia dos 
ratos), espera-se um número maior de leptospirose humana. 
O contato da bactéria com a pele ou mucosas lesadas permite a sua entrada no 
organismo e o início da infecção, que é abrupto e apresenta um espectro clínico que varia desde 
um estado semelhante ao gripal até formas mais graves, podendo ocorrer meningite, 
insuficiência renal e icterícia. Uma característica bem comum entre os pacientes com 
leptospirose é a presença de mialgia (dor) nas panturrilhas, coxa, abdome e musculatura 
paravertebral. 
 
 
Figura 42: Foto da bactéria Leptospira interrogans causadora da leptospirose. Disponível em: 
<http://www.leptospirosis.org>. Acesso em: 21 mar. 2009. 
 
 
 
73 
 
I. Diagnóstico laboratorial da leptospirose 
 
O diagnóstico é clínico-epidemiológico e laboratorial. Na prática laboratorial é indicativo 
isolar as leptospiras de sangue, urina ou líquido cefalorraquiano por cultivo e também avaliar o 
DNA bacteriano por meio de PCR do sangue, urina, liquor e amostras de tecidos. 
Entre os métodos sorológicos, existe um teste de referência denominado MAT 
(“Microscopic Agglutination Test”) que incuba várias cepas vivas de leptospiras com o soro dos 
pacientes em diferentes diluições para que por meio de uma reação de aglutinação microscópica 
seja possível indicar a presença de anticorpos antileptospiras nos soros dos pacientes. No 
entanto, como esta técnica é trabalhosa e necessita de cepas vivas, apresentando elevado risco 
operacional e, portanto, o método de ELISA para a detecção de anticorpos IgM tem sido uma 
alternativa cada vez mais difundida. 
 
g) Malária 
 
A malária é uma doença infecciosa causada pelos protozoários parasitas Plasmodium 
vivax, Plasmodium falciparum (Figura 43)