Prática 1 - Contagem global de leucócitos, confecção de extensão sanguínea e etc

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ATIVIDADE ORIENTADA VIIIA- PRÁTICAS DE HEMATOLOGIA 
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Prática 1: Contagem global de leucócitos, confecção de extensão 
sanguínea, coloração das extensões sanguíneas, preparo de extensão 
para contagem de reticulócitos 
 
 
 
 
Material: 
• Pipeta automática de 20L 
• Ponteiras 
• Câmara de contagem ou hemocitômetro tipo Neubauer 
• Microscópio 
• Líquido de Turk 
• Tubo de ensaio 
• Pipeta de 5 mL 
• Corantes 
• Lâminas 
• Corante Azul de Cresil Brilhante 
• Banho-maria 
 
 
 
 
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1. CONTAGEM GLOBAL DE LEUCÓCITOS 
Baseia-se no mesmo princípio da contagem de eritrócitos. 
4- Solução diluente (líquido de Turk) 
 
Ácido acético glacial............................ 
Violeta de genciana 1%........................ 
Água destilada qsp............................... 
10 mL 
10 mL 
1000 mL 
 
 
 
 
Método: 
1- A diluição deve ser feita em tubo, pipetando-se 20L de sangue e 0,38 mL de solução diluente. Temos assim 
uma solução 1:20. 
3- Homogeneizar e preencher a área reticulada da câmara. 
4- Deixar sedimentar por 3 minutos e contar ao microscópio com aumento de 100x. 
5- Contar todas as células coradas nos 4 quadrados externos do retículo da câmara de Neubauer. 
6- Aplicar a fórmula para determinar o número de leucócitos por mm3 de sangue : 
 
Fontes de Erro e Comentários: 
 
1- São válidas as mesmas recomendações feitas para a contagem de eritrócitos. 
2- Quando eritrócitos nucleados estão presentes na amostra eles não são lisados, sendo contados como leucócitos 
porque é impossível distingui-los no hemocitômetro. Se 5 ou mais eritrócitos nucleados em 100 leucócitos, são 
contados na diferencial, a contagem de leucócitos deve ser corrigida pela seguinte fórmula: 
 
contagem de leucócitos incorreta x 100 
número de eritrócitos nucleados em 100 leucócitos 
 
 
 
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PREPARO DAS EXTENSÕES SANGUÍNEAS 
O material (sangue, medula óssea, etc) deve ser distendido sobre lâmina de vidro e seco ao ar. 
Recomenda-se a utilização do sangue antes de entrar em contato com o anticoagulante. Entretanto, as 
dificuldades no momento da coleta impedem este procedimento. Permite-se então a utilização do sangue 
anticoagulado, preferencialmente dentro de 3 horas após a coleta. 
 
 
COLORAÇÃO DAS EXTENSÕES SANGUÍNEAS 
A coloração das extensões de sangue é feita com corantes especiais, baseados na mistura de 
Romanowsky. Este pesquisador observou que soluções envelhecidas de azul de metileno coravam em púrpura 
os núcleos dos leucócitos. 
Hoje sabemos que esse fato decorre do aparecimento de azures de metileno. As misturas tipo 
Romanowsky contém também eosina, portanto, soluções de eosinatos de azul e azures de metileno. Entre os 
corantes atualmente em uso, temos os corantes de Leishmann, Wright e Giemsa, todos contendo azul de 
metileno, eosina e azures de metileno e, por isso, conhecidos como misturas do tipo Romanowsky de corantes 
panóticos. Após aplicação destes corantes, temos basicamente 4 tipos de coloração, segundo a afinidade das 
estruturas celulares: 
a) afinidade pelo azul de metileno indica basofilia 
b) afinidade pelos azures indica azurofilia 
c) afinidade pela eosina, acidofilia ou eosinofilia 
d) afinidade por mistura complexa, neutrofilia 
Usamos o corante de Leishmann, que dá uma diferenciação celular muito boa, permitindo um bom 
estudo citológico. A extensão sanguínea corada presta-se a realização da contagem diferencial de leucócitos e 
ao estudo morfológico dos eritrócitos. 
 
 
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I. Coloração com Leishman 
O corante pode ser comprado pronto ou preparado na proporção: 
• eosina-azul de metileno seg. Leishmann...................1,2 g 
• Álcool metílico absoluto.........................................1000 mL 
É importante que seja filtrado em papel de filtro para retirar os precipitados. 
 
 
1. Colocar o corante sobre as extensões até cobri-lo completamente e deixar por 4 minutos (tempo de 
fixação). 
2. Colocar sobre o corante a mesma quantidade de água destilada de pH neutro e deixar 14 minutos (fase 
de coloração). 
3. Lavar a lâmina com água corrente. Limpar o verso da lâmina e deixar secar à temperatura ambiente. 
 
II. Coloração com Eosina-Azul de metileno segundo May Grunwald e Giemsa 
Preparo: 
-Eosina Azul de Metileno 2g para 1 L de metanol. Filtrar. 
- Giemsa- solução comprada pronta. Filtrar 
 
 
1. Cobrir a extensão sanguínea com corante May Grunwald- deixar por 1 minuto 
2. Adicionar água destilada na extensão, homogeneiza e deixa mais 3 minutos 
3. Lavar a extensão com água destilada, cobrir com Giemsa e deixar mais 10 minutos. 
4. Lavar. 
 
III. Coloração com Panótico Rápido – seguir orientações do fabricante 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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CONTAGEM DE RETICULÓCITOS 
O reticulócito é o último estágio de eritrócito imaturo e ainda contém RNA citoplasmático 
remanescente. 
A visualização dos reticulócitos se faz pela coloração deste RNA residual com corantes 
supravitais. Coloração supravital é aquela realizada após a morte somática e antes da morte molecular 
da célula. A contagem de reticulócitos é um meio simples de avaliar a velocidade de produção de 
células vermelhas, ou seja, a atividade eritropoética da medula óssea. 
 
Material e Reagentes: 
1- Tubos de ensaio 11x75 mm 
2- Lâminas de vidro 
3- Solução corante 
azul cresil brilhante................................ 1,0 g 
solução fisiológica 0,9%.........................100 mL 
4- Microscópio 
 
Método: 
1- Colocar 2 gotas de sangue e 2 gotas da solução corante em um tubo de ensaio 11x75 mm. 
2- Misturar e incubar a 37oC por 30 minutos. 
3- Após este tempo, fazer esfregaço, secar. Examinar em objetiva de imersão. 
 4- Contar, em 10 campos aleatórios, o número de eritrócitos e de reticulócitos por campo. Calcular a 
% de reticulócitos, conforme o exemplo: 
 Ex. Em 10 campos foram contados 2500 eritrócitos e 22 reticulócitos 
22 ---------- 2500 
x ------------ 100 
x = 0,88% 
 5- Conhecendo o número absoluto de eritrócitos podemos calcular o número de reticulócitos por mm3. 
no de reticulócitos/mm3 = % de reticulócitos x no de eritrócitos/mm3 
 100 
Valores Normais: 
0,5 a 2,0 % 
24.000 - 84.000 / mm3 ou 24 a 84.109 / L 
 
 
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Correção da contagem de reticulócitos: 
Em amostras com hematócrito baixo, a porcentagem de reticulócitos pode estar falsamente 
elevada porque o sangue total contém poucos eritrócitos. 
Um fator de correção é usado, considerando que o hematócrito médio normal é 0,45 L/L. 
reticulócito corrigido = reticulócito ( % ) x Hematócrito ( L/L ) 
 0,45 
 
Índice Reticulocítico: 
Os reticulócitos podem ser liberados da medula prematuramente, e estes chegam ao sangue 
muito grandes e com carga exagerada de ribossomos (shift cells). Estes reticulócitos deixam a medula 
óssea para compensar anemia. Os reticulócitos normais levam 1 dia para completar a maturação 
enquanto estas células levam até 2,5 dias. Quando avaliamos a eritropoese, deve-se corrigir a presença 
de shift cells porque a quantidade de reticulócitos, no sangue periférico, pode estar aumentada sem um 
aumento da eritropoese. 
 
IR = reticulócito corrigido 
2 ( tempo de maturação ) 
 
Uma resposta adequada da medula óssea é usualmente indicada por um IR maior que 3. Uma 
resposta inadequada é vista quando o IR é menor que 2. 
Alguns autores recomendam calcular o IR utilizandoos seguintes tempos de maturação, 
relacionados ao hematócrito: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hematócrito (%) Tempo de maturação (dias) 
35-39 1,5 
25-34 2,0 
15-24 2,5 
< 15 3,0 
 
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