RELATORIO DAS AULAS PRATICAS - Extração de DNA

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CENTRO UNIVERSITÁRIO APARÍCIO CARVALHO
CURSO DE BIOMEDICINA
RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA DE GENÉTICA
ACADÊMICOS: 
Leticia Barbosa
Manuela Maria B C Machado
Nicole do Casal Silveira
Silvia Couto
PORTO VELHO/RO
Novembro/2022
								 
RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS DE GENÉTICA
Relatório referente a avaliação bimestral das aulas práticas da disciplina de Genética. Sob responsabilidade da professora Doutora Deusilene Vieira.
Porto Velho/RO
2022
SUMÁRIO
1.Introdução	4
2. Aula 1 – Extração de DNA	5
3. Aula 2- Reação em cadeia da polimerase	7
4. Aula 3 – Eletroforese	8
5. Considerações Finais	9
6. Referências Bibliográficas	10
1. Introdução
Dentro do diagnóstico de predisposição hereditária ao câncer, a mutação na linhagem germinativa de vários genes supressores de tumor, como BRCA1, aumenta o risco do paciente para o desenvolvimento de certos tipos de câncer. Assim, a detecção desses alelos mutados pode permitir que o paciente e o médico planejem um protocolo agressivo de triagem, assim como uma oportunidade para a cirurgia profilática. Além disso, tal detecção permite o aconselhamento genético dos parentes em risco. (KUMAR et al,2013).
Entre as moléculas presentes no organismo, a proteína p53 recebe este nome devido ao seu peso molecular de 53 kDa, é composta por 393 aminoácidos e cinco domínios funcionais. Em células normais, esta proteína é sintetizada continuamente, mas o seu nível celular é rigidamente regulado, não permitindo o acúmulo em níveis significativos. Os principais genes envolvidos na carcinogênese são os proto-oncogenes, os genes supressores de tumor e os relacionados ao reparo do DNA (DANTAS et al., 2009)
O processo de regulação é realizado por modificação covalente da proteína ou por interação com diferentes fatores, o que causa ativação ou desativação da mesma, a ubiquitina ligase MDM2 é a responsável por esta regulação. Em resposta aos danos e outros sinais de estresse ao DNA, as proteínas quinases, ATM e CHK2, impedem a interação entre MDM2 e p53 por meio da fosforilação de ambas. Então, ocorre o aumento do nível de p53, que por sua vez sendo um ativador transcricional, passa a regular a expressão de genes alvos, impedindo a progressão do ciclo celular nas fases G1 e G2 ou início do processo de apoptose em caso de danos irreparáveis. (LEVINE; OREN, 2009, in DE PAULA, 2021)
Os proto-oncogenes estimulam a divisão celular, enquanto, os supressores inibem. As mutações envolvendo proto-oncogenes atuam de forma dominante, ou seja, a mutação de um único alelo pode conferir à célula ganho de função, transformando um proto-oncogene em um oncogênese com vantagem em termos de crescimento e/ou transformação. (KUMAR et al,2013).
A perda de função da p53 e a falha dos mecanismos de reparo, podem resultar na proliferação de células com DNA danificado, propagando mutações potencialmente oncogênicas. 
Nesta visita ao laboratório sob as designações da Professora Deusilene, pasta de Genética Medica, vamos observar o sequenciamento genômico em sua parte inicial, para o diagnostico molecular do marcador tumoral p53, para a partir disso, definir o tipo de mutação sofrida. 
2. Aula 1 – Extração de DNA
Passo 1. Para o isolamento dos ácidos nucleicos foi utilizado o sistema de extração de DNA
Extração – Lisado do soro
Foi adicionado amostra do soro (200μL) à um frasco estéril.
Em seguida foram adicionados 20μL de Proteína K (que tem a função de degradar as estruturas proteicas da célula); logo após adicionado 20μL de RNAse A à amostra (que vai degradar o RNA da amostra).
Após as adições a amostra foi encaminhada ao agitador de partículas o Vortex para que a amostra fique uma mistura homogênea, e assim tenha uma melhor ação dos produtos.
Um tampão de lise genômica é adicionado em seguida (para que haja lise das demais estruturas como lipídeos, carboidratos, outras proteínas, etc.), sendo levada ao Vortex por 5 segundos para que homogeneíze a amostra e tenha uma maior eficácia na ação do tampão.
Logo após realizamos a incubação térmica da amostra em “banho-maria” para que houvesse aceleração no processo de digestão das proteínas. Em seguida adicionamos o etanol ao composto já lisado, e levamos ao Vortex para que houvesse a mistura da amostra, e precipitação da molécula de DNA.
Extração - Ligação do DNA
Transferimos 400 μL para a coluna de sílica – uma membrana que possui a facilidade de se ligar ao hidrogênio da molécula de DNA, sendo a amostra levada para a centrifugação a qual vai separar os detritos e deixar a molécula de DNA livre.
Em seguida um tampão de lavagem 1 (guanidine de HCL) foi adicionado para retirar o restante do material degradado e deixar a fita de DNA mais livre na amostra. Descartamos o liquido residual do tubo com a membrana de sílica.
Adicionamos o segundo tampão de lavagem com HCL em teor mais elevado, para que haja degradação acentuada dos residuais da amostra.
A centrifugação da amostra acelera o processo de separação da molécula e dos resíduos.
Extração – Eluição
Colocamos a amostra centrifugada em um tubo estéril de 1,5 μL, a qual adicionamos um tampão de eluição do Kit da Genomic PureLink, que tem por finalidade de desligar o DNA da membrana de sílica, posteriormente centrifugamos com o objetivo de acelerar o processo de quebra de ligação do DNA com a sílica.
A partir desse ponto temos o DNA genômico purificado.
 
Figura 1- Roteiro de procedimento para Extração de DNA Figura 2- Pipetagem das amostras
 
 Figura 4- Material a ser utilizado e roteiro
Materiais utilizados:
Utilizaram-se amostras de soro humano (nosso grupo amostra PGEM 291)
O DNA genômico está presente no núcleo da célula, e expor essa molécula de DNA será necessário a degradação das estruturas celulares, para isolar o material genético. 
Para observar o perfil da molécula p53 in vitro.
Dentre os materiais: Kit PureLink Genomic Wash Buffer 1 e PureLink Genomic Wash Buffer 2.
- EPIs (luvas, jaleco, touca, mascara), tubos de ensaio, pipetas de 2, 5, 6, 9 200 μL.
3. Aula 2 – Reação em cadeia da polimerase
Passo 2. Reação em cadeia da polimerase – divididas em três seguimentos (desnaturação, anelamento e extensão) 
Foram separadas 5 tubos estéreis identificados como: 
1- Amostra original do soro – 291 (add 22 μL reagente + 5 μL amostra)
2- Amostra original do soro – 291.
3- Amostra x – 287.
4- Amostra Controle +
5- Amostra CB (add 22 μL reagente + 5 μL de água)
Para este procedimento realizou-se a adição de água ultrapura (99,75μL), prime 1(6μL), prime 2(6μL), tampão T10x(9μL), dNTPs(6μL), o cofator de Cloreto de magnésio (4,5μL), enzimaTaq (0,75 μL), mais a amostra.
Separar as fitas (desnaturação) elevando a temperatura à 90ºC/98ºC
Neste sentido, a proteína p53 é reconhecida (anelamento) e se liga à região 358pb – gene p53 agora à uma temperatura de 56ºC.
A partir desse ponto, realizamos a (Extensão) – ou seja a duplicação do DNA novamente, pela TaqDNA polimerase (que realiza o papel de mimetizar as fitas de DNA) à uma temperatura de 76ºC.
A partir deste etapa a quantidade e a pureza do DNA genômico foram determinadas pela espectrofotometria (com alíquotas de 1 µL do DNA extraído. Para garantir a pureza do DNA, avaliou-se os parâmetros de absorbância). – Este procedimento não foi realizada no Lab. da faculdade por não ter o aparelho no local, mas sim no laboratório da FioCruz. 
Figura 5- Fotômetro
4. Aula 3 – Eletroforese
 As amostras foram transportadas para o Laboratório da FioCruz (localizado no espaço físico do Hospital Cemetron), a qual realizou-se uma visita técnica.
A etapa de Eletroforese - A eletroforese teve por objetivo a purificação da amostra, separando os ácidos nucleicos. A qual as moléculas são submetidas a um campo elétrico, na qual migram para um polo positivo ou negativo de acordo com sua carga. 
No caso em quentão de nosso experimento, a molécula de DNA possui carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente,quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo. 
Os produtos de PCR tiveram suas amplificações confirmadas por meio da visualização dos fragmentos por eletroforese em gel (agarose ou poliacrilamida). A corrida eletroforética foi realizada em uma cuba horizontal com tampão. No gel foi aplicado 3 µL de produto de PCR misturado. A visualização do gel foi realizada em transluminador. O método mais usual para se visualizar o DNA em géis de agarose é por coloração com brometo de etídeo (EtBr), Esse corante se intercala entre as bases dos ácidos nucléicos e, na presença de luz Ultra Violeta, que florescem em vermelho alaranjado. Com este método pode-se detectar uma quantidade igual ou maior que 10 ng de DNA e a intensidade de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra. 
 
Figura 6- Eletroforese- preparo da linha de avaliação Figura 7- Eletroforese correndo linha de avaliação
Figura 8- Poço de analise sob ação de luz ultra violeta.
5. Considerações Finais
Os estudos realizados em bancada e a visita técnica, nos proporcionou conhecer e salientar que as variantes de TP53 são as mais frequentes encontradas em tumores e apresentam desafios na interpretação da linha germinativa. Este estudo demonstrou a importância da análise de variações genéticas em diferentes bancos de dados, uma vez que podem apresentar dados discrepantes. 
Uma vez encontradas mutações de origem germinativa no gene TP53, recomenda-se teste molecular dos familiares para determinar se a variante patogênica foi transmitida. É importante ressaltar que, para a confirmação dos achados, será necessário estudo subsequentes de tecidos auxiliares, como por exemplo análise de tecidos por biopsias. 
6. Referências Bibliográficas
DE PAULA, Patricia Oliveira. ANÁLISE DE ALTERAÇÕES NO GENE TP53 EM PORTADORES DE CÂNCER DE MAMA NA POPULAÇÃO DE MISSAL-PR, 2021. Acesso em https://dspace.unila.edu.br/bitstream/handle/123456789/6235/An%C3%A1lise%20de%20Altera%C3%A7%C3%B5es%20no%20Gene%20TP53%20em%20Portadores%20de%20C%C3%A2ncer%20de%20Mama%20na%20Popula%C3%A7%C3%A3o%20de%20Missal-PR?sequence=1&isAllowed=y 
DANTAS et al., 2009. Genética do Câncer Hereditário. 2009. Acesso em https://rbc.inca.gov.br/index.php/revista/article/view/1619/963 
KUMAR, Vinay. et al. Robbins, patologia básica. Rio de Janeiro: Elsevier, 2013.
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