Relatorio GENETICA extração de DNA de Cebola

Prévia do material em texto

Relatório 
Aula pratica: Extração do DNA de cebola
Parauapebas-PA
2018
Introdução
Nas ultimas décadas tem ficado cada vez mais evidente o uso e tecnologias utilizando o Ácido Desoxirribonucleico, que por sua vez é mais conhecido por DNA, encontrado nas células dos organismos em geral, seja contido no núcleo da celular ou em seu citoplasma, podendo está conjugado ou não a organelas, é um componente orgânico formado por bases nitrogenadas (Adenina, Timina, Citosina e Guanina), Pentose (Carboidrato) e um grupamento fosfato, disposto em duas cadeias de nucleotídeos que formam uma dupla fita com polaridade inversa. 
O DNA é responsável por carregar as informações genéticas presentes nos genes, que poderão ser herdadas, também é responsável pela síntese de proteínas, através da formação do RNA. As diferentes sequencias de DNA, formam os cromossomos que são os responsáveis por carregar toda a informação que as células necessitam para seu crescimento, desenvolvimento e reprodução, levando em seu material genético informações que serão passadas para as próximas gerações. Os seres humanos possuem 46 pares de cromossomos, sendo 23 herdados da mãe e 23 herdados pelo pai, em contra partida a cebola possui 16 cromossomos.
É Graças aos cromossomos, com seu conjunto de genes e o ácido desoxirribonucleico, que podemos falar a respeito de hereditariedade e herdabilidade, que é a capacidade de cada ser vivo receber ou transmitir informações, características e comportamentos. Levando em consideração a importância biológica do estudo do DNA, faz-se necessário uma analise para que possamos entender melhor este conteúdo. Sendo assim o objetivo da aula prática foi conhecer e entender o processo de extração do material genético, e extrair o DNA da cebola, afim de observar as suas estruturas.
Desenvolvimento
A aula prática ocorreu no dia 6 de agosto, das 13:00 h às 15:40 h, no Laboratório de Produção Vegetal da Universidade Federal Rural da Amazônia Campus Parauapebas-PA, os graduandos do sétimo período do curso de agronomia foram divididos em cinco equipes para um melhor aproveitamento didático. Sendo assim cada equipe fez o processo de extração de DNA sendo exigida a participação de todos os membros do grupo. 
Como e bem explicado por Hodson, D. (1992), durante a experimentação, os estudantes adquirem uma compreensão mais profunda da atividade científica, e as investigações tornam-se um método tanto para aprender Ciência como aprender sobre a Ciência.
O processo de extração de DNA da cebola foi simplificado, tendo em vista que extração convencional utiliza-se alguns reagentes tóxicos e pela segurança e comodidade optou-se por este método.
O processo de extração do DNA, e de extrema importância seja para aprender sobre o processo de formação de uma espécie como também para proteger ou melhorar determinados organismos. 
Materiais e Métodos
Material
-Água Mineral
-Álcool 70
-Banho Maria
-Béqueres
- Cebola
-Cloreto de sódio
-Colher de chá
-Detergente neutro
-Faca
-Funil
-Papel filtro (germitest) 
-Peneira
-Pote de vidro de 268 ml
-Tubo de ensaio
Métodos
O procedimento de extração se deu da seguinte forma:
1. Foi feita a retirada da casca da cebola e higienização.
2. Picou-se 1/2 de cebola e reservou em um pote de vidro
3. Adicionou-se uma colher de chá, de sal de cozinha Na+Cl-, na cebola picada e mexeu bem.
4. Colocou-se uma colher de chá, de detergente neutro no pote e homogeneizou.
5. Foram adicionados 150 ml de água mineral, medida a partir de um béquer.
6. Misturou-se bem a solução, até formar uma mistura homogênea.
7. Após este procedimento, colocou o pote com a mistura em Banho Maria com temperatura entre 65°C e 70°C, mexendo a cada 5 minutos, durante 20 minutos.
8. Ao retirar, o material foi peneirado e filtrado, nessa ordem respectivamente.
9. O material solido foi descartado, e a uma parte da solução foi colocada em um tubo de ensaio.
10. Após esse processo a mistura descansou durante 10 minutos no freezer.
11. Sucedendo ao descanso foi adicionado junto à solução, álcool 70% congelado, onde foi possível verificar a suspensão das moléculas de DNA em meio a solução.
12. O material voltou para o congelador, e após 10 minutos se observou um rearranjo do material genético precipitado.
Resultados e Discussão
O processo de picar a cebola, mostrado na (Figura 1.), pode ser substituído pela trituração usando um liquidificador, no entanto este procedimento é limitado, podendo ser usado no máximo durante 5 segundos, para que não aja a degradação das moléculas de DNA. Este processo e realizado com o intuito de quebrar a parede celular, e fazer o extravasamento do sulco celular presente no interior das células, expondo assim o citoplasma e as organelas.
A importância da adição do NaCl, representado na (Figura 2.) se da pela dissociação em íons Na+ Cl-, quando misturados a solução. Estes íons iram interagir com os fosfatos e histonas das moléculas de DNA, neutralizando e estabilizando-as, possibilitando assim que as moléculas de DNA fiquem menos solúveis em contato com a água. 
	
	
	
	Figura 1. Processo de picagem da cebola.
Fonte: Ruanis S. Araujo
	
	Figura 2. Adição de NaCl no pote com cebola picada.
Fonte: Ruanis S. Araujo
Por outro lado a função do detergente neutro evidente na (Figura 3.) é emulsificar os fosfolipídios presentes nas membranas plasmáticas da célula e de suas organelas, o seu alto grau de interação faz com que aja a exposição das moléculas de DNA presente no núcleo celular assim como das organelas como mitocôndrias e cloroplastos.
O Banho Maria realizado conforme a (Figura4), expõe a solução a uma temperatura media de 65 ºC por 20 minutos tem a função de desnaturar as proteínas e enzimas, entre elas as DNases, além de degradar alguns constituintes das células. O processo de filtragem descrito nas (Figuras 5.1 e 5.2) tem como função retirar os materiais indesejados assim como manter uma solução homogenia, contendo uma grande quantidade de material genético e facilitando a visualização.
	
	
	
	Figura 3. Medição e adição de Detergente Neutro.
Fonte: Ruanis S. Araujo
	
	Figura 4. Momento em que o tratamento e colocado em Banho Maria.
Fonte: Ruanis S. Araujo
 A submissão da solução ao congelador posteriormente ao aquecimento, é utilizada para diminuir a quebra das moléculas de DNA. Por fim a adição de álcool etílico 70% congelado permite uma maior desidratação das moléculas, fazendo com que seja possível a observação das moléculas de DNA em suspensão, notada como pequenos filamentos esbranquiçados se reorganizando conforme podemos observa na (Figura 6.), sobre tudo para fazer a observação das hélices é necessário o uso de microscopia.
	
	
	
	Figura 5.1. Primeira filtragem, utilizando peneira.
 Fonte: Ruanis S. Araujo
	Figura 5.2. Segunda filtragem com papel Germitest.
Fonte: Ruanis S. Araujo
	Figura 6. Visualização de filamentos de DNA.
Fonte: Ruanis S. Araujo
Conclusão
O material genético faz parte dos mais diversos tipos de organismos, e seu, armazenamento e transferência de informações genéticas, são de extrema importância para a manutenção da vida. A compreensão do mesmo é muito importante para que possamos fazer a preservação de espécies, identificação e controle de doenças, realizar o melhoramento genético de um dado organismo visando uma maior produtividade entre outras funcionalidades. 
Questionário Avaliativo 
Qual a função de cada reagente usado na extração simplificada do DNA explanada na aula prática?
O sal de cozinha é um estabilizante da solução, ele se dissocia em cargas positivas Na+ e negativas Cl-, estas cargas neutralizam o DNA, uma vez que, o esqueleto do DNA é formado por grupos fosfatados que são carregados negativamente, e o DNA é enrolado por octâmeros histonas, e as histonas possuem cargas positivas. Facilitando assim o processo de precipitação do DNA na presença do álcool, evitando a desintegração do mesmo. O detergenteneutro tanto vai interagir com a agua como também realizar a quebrar as moléculas de lipídios como fosfolipídios e colesterol que são moléculas que atrapalhas a visualização do DNA, quebrando esses ácidos graxos em moléculas menores o detergente acaba facilitando a dispersão do DNA na solução, até pelo simples fato de todas as organelas assim como o núcleo serem envoltas por uma membrana plasmática formada de um mosaico de lipídeos e proteínas. A água vai ajudar no processo de homogeneização, das substancias e das moléculas da solução. O álcool permite fazer a suspensão do DNA, uma vez que o DNA é solúvel em água e insolúvel no álcool, é ideal que o álcool esteja o mais gelado possível, pois a baixa temperatura do mesmo facilita o processo de precipitação.
O que se consegue visualizar seria o DNA puro?
Não, o que visualizamos é uma substancia formada por proteínas, sais minerais e um emaranhado de moléculas de DNA em suspensão. É possível a observação do DNA puro com o uso de aparelhos de microscopia.
Como se sabe que os filamentos são moléculas de DNA?
As Moléculas de DNA são insolúveis em álcool, o álcool permite ressuspender a molécula de DNA , pois o álcool desidrata o DNA, de forma que este não mais fica dissolvido no meio aquoso, e podemos observa a formação de estruturas espiraladas que são menos densas que a solução e podemos observa sua precipitação.
Se fosse RNA, de forma poderia ser visualizado?
O RNA é formado por fitas simples de nucleotídeos, e seu processo de extração é bem parecido com a extração do DNA. No entanto existe uma grande problemática no seu processo de extração que é a presença de uma grande quantidade de ribonucleases (RNAses) estáveis e ativas nos tecidos, que permitem que o RNA que é altamente instável seja rapidamente degradado. Sendo assim, a primeira etapa em todos os métodos de isolamento de RNA após a pulverização dos tecidos, é a exposição deste material a tampões de extração. Estes apresentam substâncias como o cloreto de lítio que auxilia a precipitação do RNA e isotiocianato de guanidina que permite a manutenção do RNA intacto nas etapas posteriores da extração, através da degradação das ribonucleases endógenas (Sambrook,2002).
Atualmente, há vários reagentes comerciais como, por exemplo, Trizol (Invitrogen) e Brazol (Lab Trade do Brasil) que possuem em sua composição
reagentes combinados, como isotiocianato de guanidina e fenol, que possibilitam uma extração mais rápida, conservando o material, e possibilitando a sua visualização.
Pesquisa: qual a função dos seguintes componentes químicos:
CTAB- Brometo de cetiltrimetilamônio é um detergente que faz com que as membranas celulares sejam rompidas para liberação do DNA, e como todo detergente tem um alto poder de interação com a agua e lipídios. 
EDTA- Ácido etilenodiaminotetracético é uma substância anticoagulante o EDTA age quelando íons Mg 2+ e Ca 2+ (que são cofatores de diversas enzimas nucleares como as DNases) e a proteinase K hidrolisa as proteínas.
Tris HCl- Cloridrato de TRIS, trishidroximetilaminometano é extremamente usada em bioquímica e biologia molecular. Em bioquímica, tris é largamente usada como um componente de soluções tampão, tais como nos tampões TAE e TBE, especialmente para soluções de ácidos nucléicos.
PVP- Ou polivinilpirrolidona, faz com que haja desnaturação de proteínas, eliminação de polifenóis oxidantes e compostos fenólicos como taninos e quinonas da molécula de DNA, e também possui efeito antioxidante, assim como faz a eliminação de polissacarídeos.
NaCl- O cloreto de sódio é um estabilizante, utilizado na solução de extração de DNA, ele se dissocia em cargas positivas Na+ e negativas Cl-, estas cargas neutralizam o DNA, uma vez que, o esqueleto do DNA é formado por grupos fosfatados que são carregados negativamente, e o DNA é enrolado por octâmeros histonas, e as histonas possuem cargas positivas. Facilitando assim o processo de precipitação do DNA na presença do álcool, evitando a desintegração do mesmo.
β2-mercaptoetanol- É usado para reduzir as ligações dissulfeto e pode atuar como um antioxidante biológico através da remoção de radicais hidroxila entre outras funções ele também é usado em alguns procedimentos de isolamento de RNA para eliminar a ribonuclease liberada durante a lise celular, ou seja, ruptura das membranas celulares. Posssuindo um grande numero de ligações dissulfureto as ribonucleases são enzimas muito estáveis, o 2-mercaptoetanol é usado para reduzir estas ligações dissulfureto e desnatura-las irreversivelmente, isto impede que elas degradem o RNA durante o procedimento de extração. É uma substancia considerada tóxica, podendo causar desde simples irritações ate a morte em alguns casos.
Clorofórmio-álcool isoamílico – Faz com que haja separação da fase orgânica e aquosa durante a centrifugação. De forma que lipídios, proteínas e a maioria dos polissacarídeos são retidos na fase orgânica inferior, enquanto que o DNA, RNA e alguns polissacarídeos permanecem na fase aquosa superior.
Etanol absoluto- Adicionado à fase aquosa, o álcool (isopropanol ou etanol), na presença de um sal, precipita o DNA, que pode ser extraído O etanol anidro ou álcool absoluto possui pelo menos 99,6% de graduação alcoólica, isso faz com que precipitem muitos sais juntamente com o DNA, além de dificultar a ressuspensão do DNA, por isso utiliza-se uma “lavagem” com álcool 70%.
.
Tampão TE- TBE ou Tris/Borato/EDTA, é uma solução tampão contendo uma mistura de base T (Tris), ácido Bórico e EDTA. São frequentemente usados em procedimentos de extração do DNA. Os tampões estabilizam as modificações de pH que acompanham a morte celular, cuja finalidade é manter o pH constante, o pH do tampão é entre 7.5 e 8.0. Isto é Muito importante para evitar a degradação do DNA por ataque de enzimas, como: as lipolíticas e lipoxigenases que têm pH ótimo entre 5.0 e 6.0, enquanto as DNAses nucleares, tem pH ótimo em torno de 7.0.
RNAse- Ribonuclease é um tipo de enzima nuclear que catalisa a degradação do RNA em componentes menores. A adição desse componente contribui para aumentar a pureza da sua amostra no processo de extração de DNA.
Álcool isopropílico- Ou também conhecido como álcool isopropanol, possui a formula química C3H8O. É utilizado após separar o DNA dos outros componentes celulares, afim de garantir a máxima pureza do material, esta precipitação geralmente faz-se utilizando álcool isopropilico gelado que, em presença de cátions monovalentes, promove uma transição estrutural na molécula de ácido nucléico, resultando em agregação e precipitação do DNA.
Como é processada água Milli-Q, como é produzida e para que é utilizada?
O sistema Advantage Milli-Q foi projetado para fornecer água ultrapura de alta qualidade adaptado às necessidades de cada usuário de laboratório, sendo possível seu uso nos mais diversos tipos de experimentos incluindo a extração de DNA.
Como é feita a purificação:
A qualidade da água ultrapura mais confiável depende da construção de uma sequência de purificação otimizada.
A água pura, de preferência a partir de um sistema de purificação de Elix, entra no pacote de pré-tratamento Q-Gard, que é escolhido com base na fonte de alimentação de água.
Água pré-tratada, em seguida, passa para uma lâmpada de UV de comprimento de onda duplo, que assegura oxidação da molécula orgânica e destruição de bactérias.
Em seguida, o cartucho de polimento Quantum remove os contaminantes iônicos e orgânicos abaixo dos níveis de rastreamento para coincidir com a qualidade da água necessária para o laboratório.
Finalmente, a água ultrapura produzida pelo sistema de recircula através de um circuito para a unidade Q-POD, onde os filtros finais asseguram a purificação final para todas as aplicações.
Cartuchos Q-Gard e Quantum incorporar a tecnologia eSure da Millipore, que permite total rastreabilidade.
Informações obtidas pela rede PRÓ-ANALISE Produtos e equipamentos para laboratório.
Referências 
BARBIERI, R.L.; MEDEIROS, A.R.M. A cebola aolongo da história. Embrapa Clima Temperado, 2005. p.13-20.
GOUVEIA, J. J. de S. et al. Protocolos em biologia molecular aplicada à produção animal. São Carlos: Embrapa Pecuária Sudeste, 2007.
HODSON, D. In search of a meaningful relationship: an a exploration of
some issues realing to integration in science and a science education.
International Jounal of Science Education, v.14, n.5, p.541-562, 1992.
PRO-ANALISE, Produtos e equipamentos para laboratório. MILLI-Q ADVANTAGE A10 SISTEMA ULTRAPURIFICAÇÃO ÁGUA MILLIPORE. Disponível em: https://www.pro-analise.com.br/produto/milli-q-advantage-a10-sistema-ultrapurificac-o-agua-millipore-813. Acesso em 20 de Agosto de 2018
RODRIGUES C.D.N. et al. DNA vegetal na sala de aula. Departamento de Botânica – IBUSP. São Paulo, 2008.
SAMBROOK, J. E.; RUSSEL, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002. 
SANTOS, S. et al. An efficient protocol for genomic DNA extraction from formalin-fixed paraffinembedded tissues. Res Vet Sci, 2008.
.