PCR: Amplificação de DNA

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ELETROFORESE PT.2 
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 
 Reação em cadeia da Polimerase ou Reação de 
polimerização em cadeia ou Polimerização em 
cadeia do DNA. 
 Técnica de biologia molecular empregada para 
obter-se amplificação exponencial de pequenas 
quantidades de DNA in vitro, empregando 
elementos do processo natural de replicação do 
DNA. 
 O conceito de amplificação do DNA não é novo e 
sempre foi utilizado, entretanto, a amplificação era 
feita in vivo e não in vitro como na PCR. 
DNA ALVO 
 O número de bases nos alvos podem variar. 
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA 
 O . . . . representa o meio da sequência de DNA, e 
não há problemas em não conhecê-la para poder 
amplificá-la. 
MIX 
1. Dna alvo: Extraído de uma amostra (sangue, pelo, 
sêmen) ou de um RNA, convertida para cDNA; 
2. Primers: Sequência de DNA que serve como 
ponto de início de replicação. 
3. Dntp (DATP, DTTP, DGTP, DCTP) : Nucleotídeos livres 
que irão formar as novas sequências de DNA 
4. Tampão: (evitar variações de ph) +MgCl2 
5. DNA polimerase (enzima que multiplica o dna) 
 
DISTRIBUIÇÃO DO MIX 
 MIX+DNA 
CICLOS 
 DESNATURAÇÃO: Do DNA molde (template) por 
aquecimento ~95 graus 
 PAREAMENTO: Dos primers á sequência alvo fita 
simples ~ 55 graus 
 EXTENSÃO: Dos iniciadores pela dna 
polimerase~72graus 
TAQ DNA POLIMERASE 
 O nome Taq vem de Thermus aquaticus, uma 
bactéria extremófila encontrada sobrevivendo a 
altas temperaturas (~ 117ºC) em gêiser no Yellow 
Stone National Park - EUA. 
CICLOS 
 Número de cópias da região alvo de 
 DNA: Cópias = 2n 
 n = número de ciclos 
 (n < 40) 
CONDIÇÕES DE CICLAGEM 
 A duração da etapa de extensão (72ºC) deve ser 
calculada em função do tamanho do produto que 
se deseja amplificar 
 Em geral utiliza-se 1 min/kb de produto – mais do 
que suficiente pois a extensão terá início durante a 
etapa de pareamento e durante a elevação da 
temperatura até 72ºC (Taq). 
OTIMIZAÇÃO DA PCR 
 Aumentar a quantidade de produto final 
(eficiência) 
 Aumentar a especificidade, principalmente 
quando há grande background 
 Melhorar a reprodutibilidade (de tubo para tubo e 
de reação para reação) 
 Parâmetros a serem considerados na otimização: 
→ Desenho dos primers 
→ Condições de ciclagem 
→ Concentração dos reagentes 
→ Composição do tampão 
TIPOS DE PCR 
→ RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): 
 Parte de uma amostra de RNA (cDNA). Primer 
inespecífico. 
 É fundamental nos estudos de expressão gênica. 
 Diagnóstico de vírus de RNA. 
→ Multiplex PCR: 
 Mais de um segmento genômico é amplificado 
numa única reação, cada um com seu par de 
primers específico. 
 Testes de paternidade, diagnósticos a múltiplos 
patógenos. 
→ PCR em tempo real, qPCR (Real Time Quantitative 
PCR): 
 Variação da técnica de PCR, que permite 
a amplificação e a detecção simultânea. 
 O resultado é visualizado em Tempo Real 
durante a amplificação da sequência de 
interesse. 
 Capacidade de gerar resultados 
quantitativos com maior precisão. 
 Utiliza um equipamento com sistema de 
monitoramento da emissão da 
fluorescência. 
PCR EM TEMPO REAL 
 Aplicações: 
 Determinação do sexo fetal a partir de 7 semanas; 
 Febre Maculosa; 
 Leucemia Mielóide Crônica (LMC); 
 Hepatites; 
 HIV; 
 Zica - Kit XGEN Master Zika – produto com registro 
na ANVISA sob o número 80502070033; 
 Dengue e chikungunya - Kit XGEN Multi DC – 
produto com registro na ANVISA sob o número 
80502070030. 
 COVID-19.