Apostila_2013_Farmacia_e_Quimica

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUíMICA
SETOR DE BIOQUÍMICA
Bioquímica Experimental
Roteiros de Práticas e Fundamentos Teóricos
2013
ESPECTROFOTOMETRIA
INTRODUÇÃO:
A espectrofotometria é uma técnica analítica que avalia a capacidade dos solutos absorverem luz em comprimentos de onda específicos. A medida da luz absorvida permite, entre outras coisas, inferir sobre a concentração do soluto em determinada solução ou material biológico.
 
Radiação Eletromagnética - Uma radiação eletromagnética, como a luz visível, pode ser descrita (Figura 1):
Como uma onda constituída por um componente vetor elétrico e por um componente vetor magnético
Como uma série de pacotes discretos de energia (fótons) 
No primeiro caso, pode-se aplicar à radiação os parâmetros característicos de um movimento ondulatório (comprimento de onda, frequência e número de ondas). 
Figura 1: Representação esquemática de uma radiação eletromagnética. O campo elétrico e o campo magnético são perpendiculares entre si e ambos oscilam perpendicularmente à direção de propagação da onda, onde E é o campo elétrico e M o campo magnético.
A energia eletromagnética não precisa de um meio material para se propagar, sendo definida como uma energia que se move na forma de ondas eletromagnéticas à velocidade da luz (300.000 km/s). Dado que a velocidade de propagação das ondas eletromagnéticas é diretamente proporcional à sua frequência e comprimento de onda, esta pode ser expressa por: 
Onde:
c: velocidade da luz (m/s)
 f: frequência (ciclos/s ou Hz) 
λ: comprimento de onda (m)
Comprimento de onda (λ) é a distância linear entre dois picos de ondas. As unidades usadas para o comprimento de onda de uma radiação eletromagnética:
1 nanômetro (nm) = 10-9 m 
1 micrômetro (µm) = 10-6 m
1 angstrom (Å) = 10-10 m = 10-8 cm
Frequência (f) é o número de ondas completas (ciclos) que passam por um determinado ponto por segundo. Unidade: s-1
Número de ondas é o número de ciclos (ondas) por cm. Unidade: cm-1
Teoria de Planck e o espectro eletromagnético - A distribuição das radiações eletromagnético existentes na natureza pela ordem dos seus comprimentos de onda ou número de onda constitui o espectro eletromagnético. 
Em que h é a constante de Planck = 6,62 x 10-27 erg.s. Combinando (1) e (2), temos:
 
Assim a energia de cada fóton é proporcional à frequência e ao número de onda e inversamente proporcional ao comprimento de onda (Figura 2). 
Figura 2: Representação do espectro eletromagnético.
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA: 
Dosagens de espécies químicas mediante a absorção de luz e construção de curva padrão.
DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO:
Objetivo: 
Determinar o comprimento de onda ótimo (pico de absorção máximo) para o corante indicado.
Princípio do método:
A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz). 
Fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolve a medida de intensidade de absorção de luz monocromática de um composto químico em solução. Serve para identificar o comprimento de onda característico para cada composto e para quantificação do composto através de: 1) absorção direta e 2) através de método colorimétrico. 
As relações quantitativas nesta técnica são dadas pela combinação de duas leis (Lei de Lambert-Beer): 
Lei de Lambert: quando um feixe de luz passa através de um meio absorvente (sólido ou líquido), porções iguais deste meio irão absorver luz.
Lei de Beer: a absorção da luz é proporcional à concentração do soluto na solução.
Então, a intensidade de absorção depende: 
• do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o λmáx – onde o composto absorve mais luz);
• do percurso que o feixe de luz percorrerá na solução; 
• da concentração do composto nessa solução. 
A lei de Lambert-Beer relaciona esses três fatores e estabelece que: 
A = ε.l.c 
Onde: A = absorvância (definida pela reação seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma razão, não possui unidade (Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz transmitida); 
ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm)-1; 
l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm; 
c = concentração da substância em mol/L. 
Figura 3: Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz transmitida após percorrer o caminho óptico (l) pela solução da amostra.
Desta forma, mantendo-se o caminho óptico constante, a absorvância torna-se diretamente proporcional à concentração da substância no respectivo λmáx. A fração de luz que passa por uma amostra (a transmitância = It/I0) está relacionada logaritmicamente, e não linearmente, com a concentração da amostra (Figura 3). 
Então, estabelecendo a relação:
A = log Io/It	 log 100/It log 100 – log It A = 2 – log It
Ou seja: 
Quando Io = 100% 	A = 2 – log It
Quando It = 1 	A = 2
Quando It = 100% 	A = 0
Quando It = zero 	A = ∞
A intensidade da radiação transmitida por uma substância é utilizada para a sua determinação quantitativa. Essa é a base dos ensaios colorimétricos e espectrofotométricos. Para descontarmos a absorvância do meio em que o soluto está dissolvido (solventes como água, tampões, solventes apolares, etc) utiliza-se um branco (que vai conter tudo que se tem no meio a ser medido a absorvância menos o soluto).
•	Espectrofotômetros – instrumento utilizado para medir a quantidade de luz de um dado comprimento de onda que é transmitida por uma amostra (Figura 4).
Figura 4: Principais componentes de um espectrofotômetro. Uma fonte (lâmpada) emite a luz com uma grande faixa de espectro. Essa luz é selecionada por um monocromador que transmite em um comprimento de onda específico. A luz monocromática passa através da amostra em uma cubeta com caminho óptico l. Uma parte da luz é absorvida pela amostra dependendo da concentração (quanto maior é a concentração da amostra maior será a luz absorvida). A luz transmitida é medida por um detector.
Cubetas: uma vez selecionado o λ no qual se deseja fazer a análise, essa radiação específica atravessará um recipiente, com caminho ótico definido, que contem a amostra (cubeta). As cubetas de vidro são as mais baratas do que as de quartzo e por isso devem ser usadas sempre que possível. No entanto o vidro absorve radiação na faixa do UV e tem sua utilização limitada para a faixa de 360 a 800nm, enquanto as cubetas de quartzo podem ser usadas de 200 a 800nm.
Reagentes e preparo das soluções:
Azul de metileno, alaranjado de metila, violeta cristal e vermelho de metila, soluções 1 mg% (0,001%): 
Dissolver 0,001 g do corante em 100 mL de água destilada (usar um balão volumétrico).
Procedimento:
Branco: pipetar 3 mL do solvente (água) utilizado para solubilizar o corante na cubeta de vidro;
Realizar a leitura no espectrofotômetro (zerar a leitura - branco);
Pipetar 3 mL da solução contendo o corante designado na cubeta de vidro;
Realizar as leituras e anotar as absorvâncias nos comprimentos de onda relacionados abaixo:
CORANTE:
	λ (nm)
	400
	420
	440
	470
	500
	530
	570
	600
	630
	660
	690
	ABS
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO (DETERMINAÇÃO DA LEI DE LAMBERT-BEER):
Objetivo: 
Construir uma curva padrão e determinar a concentração de uma amostra de corante desconhecida.
Princípio do método:
Podemos utilizar uma solução de concentração conhecida do composto a ser analisado (ou outra substância de características químicas semelhantes) para construir um gráfico de absorvância em função da concentração da substância em questão. Com este gráfico, denominado curva padrão, podemos medir a quantidade da molécula (soluto) que absorve um determinado comprimento de luz em amostras de concentração desconhecida, desde que, estas estejam nas mesmo condições utilizadas para a construçãoda curva padrão (mesmos reagentes, mesma temperatura, etc) (Figura 5). 
Figura 5: Um exemplo de uma curva padrão. ABS x concentração (mol/L)
Reagentes e preparo das soluções:
	Idem a seção anterior.
Procedimento:
Identificar 7 tubos de ensaio e colocá-los em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo;
	Tubo
	B
	1
	2
	3
	4
	5
	D
	Corante 1mg% (mL)
	0
	1
	2
	3
	4
	5
	0
	Amostra (mL)
	0
	0
	0
	0
	0
	0
	5
	Água destilada (mL)
	5
	4
	3
	2
	1
	0
	0
	ABS
	
	
	
	
	
	
	
	Concentração (mg%)
	
	
	
	
	
	
	
Realizar as leituras no espectrofotômetro (tubos 1-5 e D) no comprimento de onda ideal para o seu corante (volumes e procedimento similares ao efetuado na prática anterior) e anotar os valores obtidos;
Regressão Linear e construção dos gráficos
Após a construção da curva padrão temos as absorvâncias para diferentes diluições de uma solução de concentração conhecida (solução padrão). A absorvância de uma solução é proporcional à concentração da solução e a distância percorrida pelo feixe de luz através da solução (Lei de Lambert-Beer). Então, ao se construir o gráfico com os dados obtidos acima (curva padrão), temos: 
C1 = A1
C2 = A2
C3 = A3
...
CN = AN
Teoricamente, A1/C1 = A2/C2 = A3/C3 = AN/CN
No entanto, há dispersão dos pontos na prática, então, se traça a melhor reta, ou se determina o coeficiente angular médio:
Segundo a equação da reta:
y = ax + b
(sendo a o coeficiente angular da reta e b o coeficiente linear)
Ou seja:
A =  . C + b (b = 0) ou  = A/ C
Calcula-se o  para cada concentração (1 = A1/C1; 2 = A2/C2 ....)
O médio é obtido a partir do somatório de todos os calculados e representa a inclinação da reta.
Então: 
Se  = A/ C
C = A/ 
Pode-se calcular a Cd (desconhecida) com os seguintes dados:
Cd = Ad/ m
REFERÊNCIAS:
PETKOWICZ, C.L.O. Bioquímica. 7. ed. Curitiba: Ed. UFPR, 2007.
CISTERNAS, J.R.; VARGA, J.; MONTE, O. Fundamentos de bioquímica experimental. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 2005.
MASTROENI, M.F.; GERN, R.M.M. Bioquímica: práticas adaptadas. São Paulo: Atheneu, 2008.
NARDY, M. B.C.; STELLA, M.B.; OLIVEIRA, C. Práticas de laboratório de bioquímica e biofísica: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009.
MÉTODOS QUALITATIVOS DE ANÁLISE DE BIOMOLÉCULAS
INTRODUÇÃO:
Muitas moléculas biológicas são macromoléculas, que são polímeros de alto peso molecular constituídos pela repetição de unidades menores, chamados monômeros. Estas macromoléculas se apresentam em grande variedade quanto ao tamanho e também quanto aos seus monômeros constituintes. Entre as macromoléculas de maior importância estão as proteínas, formadas por aminoácidos; os polissacarídeos (carboidratos), polímeros de açúcares simples, como a glicose; e os ácidos nucléicos (DNA e RNA), constituídos por nucleotídeos. Além destas macromoléculas, moléculas menores como lipídios, água, sais minerais e vitaminas também possuem um importante papel na constituição e função celular. Embora moléculas individuais de lipídios sejam muito menores do que proteínas, ácidos nucléicos e carboidratos, estes também apresentam unidades monoméricas e muitos podem se associar não covalentemente formando agregados maiores. A bioquímica preocupa-se com o estudo tanto da constituição destas biomoléculas como a importância biológica dos processos e interações destas. A identificação destas biomoléculas, assim como o conhecimento de suas características e propriedades é um passo essencial para o entendimento destes processos.
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA: 
Identificar a presença de diferentes biomoléculas (proteínas, lipídios, ácidos nucleicos, carboidratos e também aminoácidos) em amostras biológicas através de reações específicas.
Nesta prática cada grupo irá receber um conjunto com 6 amostras e deverá identificar para cada amostra se esta é um lipídio, uma proteína, um aminoácido, um carboidrato ou um ácido nucléico. Para atingir este objetivo serão realizados os testes qualitativos descritos abaixo. 
TESTE PARA LIPÍDIOS (TESTE DE SOLUBILIDADE EM ÁGUA):
Objetivo: 
Identificação da presença de lipídios nas amostras desconhecidas.
Princípio do método: 
Os lipídios são moléculas com grande variedade estrutural e funcional, no entanto, estas substâncias são caracterizadas pela baixa solubilidade em água e outros solventes polares, e alta solubilidade em solventes apolares.
Procedimento:
Identificar 7 tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “controle positivo do teste” usando uma amostra de óleo.
	Tubo
	Lipídio
(mL)
	Amostra 
(mL)
	Água
	Resultados
	CP
	1,0
	-
	2,0
	
	A no__
	-
	1,0
	2,0
	
	A no__
	-
	1,0
	2,0
	
	A no__
	-
	1,0
	2,0
	
	A no__
	-
	1,0
	2,0
	
Legenda: CP (controle positivo); A (amostra).
No teste é considerado positivo para a presença de lipídios quando houver a formação de duas fases.
TESTE PARA PROTEÍNAS (REAÇÃO DO BIURETO)
Objetivo:
Identificar a presença de proteínas nas amostras desconhecidas.
Princípio do método:
Proteínas e peptídeos com no mínimo três aminoácidos, na presença do “Reativo de Biureto” desenvolvem uma coloração púrpura. Este método é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de Biureto) com proteínas e peptídeos. O nome do método provém do fato de que a uréia aquecida a 180oC forma um composto chamado Biureto. Este composto na presença de íons de cobre em meio fortemente alcalino formará um composto de cor azul. 
Figura 14: Reação do Biureto.
Quando o composto contém duas ou mais ligações peptídicas, produz um complexo cobre-proteína ou cobre-peptídeo de cor púrpura ou azul-violeta, que absorve luz a 545 nm. A intensidade de cor produzida é proporcional ao número de ligações peptídicas que estão reagindo, portanto, a quantidade de proteínas presentes pode ser determinada. Quando a solução possuir elevada concentração de peptídeos (tri-, oligo- e polipeptídeos) a coloração desenvolvida será rosa a avermelhada. A sensibilidade do método é de 0,5 a 5 mg/mL. 
Reagentes e preparo das soluções:
Reagente de Biureto:
Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sódio e potássio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de água;
Adicionar 300 mL de NaOH 10%;
Adicionar água destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de solução. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.
Solução padrão de caseína 1%:
Dissolver 2 g de caseína em 200 mL de água destilada. Aliquotar em frações de 10 mL e conservar a –20oC. 
Procedimento:
Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle positivo do teste” usando caseína (uma proteína encontrada no leite).
	TUBO
	Àgua
(mL)
	Caseína
10 mg/mL
(mL)
	Amostra
(mL)
	Reativo do
Biureto
(mL)
	Resultados
	 B 
	1,0
	-
	-
	4,0
	
	CP
	-
	1,0
	-
	4,0
	
	A no__
	-
	-
	1,0
	4,0
	
	A no__
	-
	-
	1,0
	4,0
	
	A no__
	-
	-
	1,0
	4,0
	
Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra).
Após a adição do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos;
No teste é considerado positivo se a amostra desenvolver uma coloração púrpura de forma semelhante ao controle positivo (porém a intensidade depende da concentração de proteína, como veremos em práticas posteriores. 
TESTE PARA AMINOÁCIDOS (REAÇÃO DA NIHNIDRINA)
Objetivo: 
	Identificar a presença de aminoácidos nas amostras desconhecidas.
Princípio do método:
O grupo amino dos aminoácidos é muito resistente à hidrólise, porém pode ser removido facilmente por oxidação. A ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) é um poderoso agente oxidante causando a desaminação oxidativa de (-aminoácidos produzindo CO2, NH3 e um aldeído com um carbono a menos que o aminoácido inicial (Figura 6). Então, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH3 liberado e outramolécula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta absorção máxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condições padrão, é a base para um teste quantitativo extremamente útil. Outras aminas, além dos (-aminoácidos, também reagem com a ninhidrina dando uma coloração azul, mas sem a liberação de CO2. 
Cabe ressaltar que o produto da reação de iminoácidos, como a prolina e hidroxiprolina, com ninhidrina apresenta coloração amarela ao invés de roxa, cujo máximo de absorção ocorre em  = 440 nm. Neste caso não há liberação de NH3, porém há produção de teores quantitativos de CO2.
Figura 6: Esquema geral da reação de aminoácidos com ninhidrina.
Reagentes e preparo de soluções
Ninhidrina 0,25%
Pesar 0,25 g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.
Alanina 0,1 M
Pesar 0,890 g de L-alanina dissolver em água destilada e avolumar para um balão volumétrico de 100 mL
Prolina 0,1M
Pesar 2,30 g de L-prolina, dissolver em água destilada e avolumar para um balão de 200 mL.
Procedimento: 
Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle positivo do teste” usando o aminoácido alanina e um controle positivo para prolina ou alanina que resultam em uma coloração amarela.
	Tubo
	Água
(mL)
	Alanina 0,1 M
(mL)
	Prolina 0,1 M (mL)
	Amostra
(mL)
	Ninhidrina 0,25% (gotas)
	Resultados
	B
	1,0
	-
	-
	-
	5
	
	CP1
	-
	1,0
	-
	-
	5
	
	CP2
	-
	-
	1,0
	-
	5
	
	A no__
	-
	-
	-
	1,0
	5
	
	A no__
	-
	-
	-
	1,0
	5
	
Após a adição da ninhidrina, aquecê-los em banho-maria a 100º C por 3 minutos;
No teste é considerado positivo para a presença de aminoácidos quando ocorre a formação de uma coloração rosa (no caso da maioria dos aminoácidos) e para iminoácidos (prolina) ou cisteína coloração amarela.
TESTE PARA CARBOIDRATOS (REAÇÃO DA ANTRONA):
Objetivo: 
	Identificar a presença de carboidratos nas amostras desconhecidas.
Princípio do método:
O reagente de antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor liberado pela diluição do H2SO4 é suficiente para que a reação ocorra. No caso de oligo e polissacarídeos, o ácido atua como catalisador de hidrólise convertendo-se a monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também como agente desidratante levando à formação de hidroximetilfurfural e furfural que, na presença de antranol, dão produtos de condensação coloridos.
Figura 7: Reação de Antrona.
O hidroximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses produz uma substância de coloração verde musgo relativamente estável enquanto que o furfural proveniente da desidratação de pentoses fornece um produto de cor análoga, mas que em alguns minutos se torna vermelho-amarelada ou rubi.
Reagentes e preparo das soluções:
Reativo Antrona
Pesar 0,2 g de antrona (C14H10O) e dissolver em 100 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) 95%.
Glicose 2 mg/mL
Pesar 0,2 g de glicose dissolver em água destilada e avolumar para um balão volumétrico de 100 mL.
Procedimento:
Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle positivo do teste” usando glicose.
	Tubo
	Água
(mL)
	Glicose 
2 mg/mL
(mL)
	Amostra
(mL)
	Reagente de Antrona
(mL)
	Resultados
	b
	0,1
	-
	-
	0,5
	
	CP
	-
	0,1
	-
	0,5
	
	A no__
	-
	-
	0,1
	0,5
	
	A no__
	-
	-
	0,1
	0,5
	
Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra).
Em banho de gelo, adicionar o reagente de Antrona e deixar por 5 minutos;
Aquecer em banho fervente (100oC) por 10 minutos;
No teste é considerado positivo para a presença de carboidratos quando ocorre a formação de uma coloração verde.
REFERÊNCIAS:
MASTROENI, M.F.; GERN, R.M.M. Bioquímica: práticas adaptadas. São Paulo: Atheneu, 2008.
David L. Nelson & Michael M. Cox. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª Edition. W. H. Freeman and Company. New York.
ANÁLISE QUALITATIVA DE AMINOÁCIDOS
Objetivo: 
	Identificar a presença de aminoácidos nas amostras desconhecidas.
Princípio do método:
O grupo amino dos aminoácidos é muito resistente à hidrólise, porém pode ser removido facilmente por oxidação. A ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) é um poderoso agente oxidante causando a desaminação oxidativa de (-aminoácidos produzindo CO2, NH3 e um aldeído com um carbono a menos que o aminoácido inicial (Figura abaixo). Então, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH3 liberado e outra molécula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta absorção máxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condições padrão, é a base para um teste quantitativo extremamente útil. Outras aminas, além dos (-aminoácidos, também reagem com a ninhidrina dando uma coloração azul, mas sem a liberação de CO2. 
Cabe ressaltar que o produto da reação de iminoácidos, como a prolina e hidroxiprolina, com ninhidrina apresenta coloração amarela ao invés de roxa, cujo máximo de absorção ocorre em  = 440 nm. Neste caso não há liberação de NH3, porém há produção de teores quantitativos de CO2.
Reagentes e preparo de soluções
Ninhidrina 0,25%
Pesar 0,25 g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.
Alanina 0,1 M
Pesar 0,890 g de L-alanina dissolver em água destilada e avolumar para um balão volumétrico de 100 mL
Glicina 0,1M
Pesar 2,30 g de L-glicina, dissolver em água destilada e avolumar para um balão de 200 mL.
Procedimento: 
Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água 
	Tubo
	Amostra/Concentração
	Volume - mL
	Ninhidrina 0,25% - (gotas)
	1
	Água
	1,0
	5
	2
	Triptofano 0,1 M
	1,0
	5
	3
	Alanina 0,1 M
	1,0
	5
	4
	Leucina 0,1 M
	1,0
	5
	5
	Aspartame 4 %*
	1,0
	5
	6
	Solução protéica
	1,0
	5
* Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil éster), adoçante 200 vezes mais potente do que o açúcar. Dissolver o conteúdo de um envelope em 20 mL de água destilada.
Após a adição da ninhidrina, aquecê-los em banho-maria a 100º C por 3 minutos;
No teste é considerado positivo para a presença de aminoácidos quando ocorre a formação de uma coloração rosa (no caso da maioria dos aminoácidos) e para iminoácidos (prolina) ou cisteína coloração amarela.
CROMATOGRAFIA EM PAPEL 
Objetivo: 
	No caso desta aula prática confirmar a identidade do aminoácido presente na amostra dada ao grupo. Porém, cabe ressaltar que esta técnica pode ser usada para separação e detecção de aminoácidos presentes em misturas.
Princípio do método:
As técnicas de cromatografia em geral são utilizadas para separação e purificação de várias classes de biomoléculas, porém o tipo de cromatografia e o protocolo variam com o objetivo e características/tipo de amostra. No entanto, todos os tipos de cromatografia baseiam-se na interação da amostra a ser analisada (soluto) com duas entidades físicas distintas: a fase móvel (que pode ser gasosa ou líquida), e a fase estacionária. A fase móvel move a amostra pela fase estacionária e a separação dos componentes depende da sua distribuição e interação diferencial com a fase móvel e/ou com a fase estacionária.
Na presente aula prática, usaremos cromatografia em papel (CP), técnica usada para separação, detecção e caracterização de aminoácidos e que constitui uma das técnicas cromatográficas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em termos analíticos. 
Para iniciar o processo a(s) amostra(s) contendo o(s) aminoácido(s) é(são) aplicada(s) em uma fase estacionária (no caso, o papel) na parte inferior marcada por uma linha à lápis (origem). Os pontos de aplicação de cada amostra são secos e aplica-se novamente a respectiva amostra a cada ponto várias vezes, secandosempre o papel antes da próxima aplicação (Figura 3). Finalmente, o papel com as amostras secas é posto em uma câmara tendo a extremidade inferior em contato com o solvente (que pode ser uma mistura de solventes e água), porém sem permitir que os pontos onde as amostras foram aplicadas tenha contato direto ou seja submerso pelo solvente contido no recipiente. Assim, o solvente se difunde pelo papel por capilaridade, os componentes da amostra se distribuem pelas fases móvel (solvente) e estacionária (papel) de acordo com sua solubilidade (Figura 11). 
O papel é composto por moléculas de celulose que possuem uma forte afinidade pela água presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgânica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionária aquosa (polar). A medida que o solvente contendo o soluto flui através do papel, uma partição deste composto ocorre entre a fase móvel orgânica (pouco polar) e a fase estacionária aquosa. Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase móvel. 
Quando a fase móvel alcança uma seção do papel que não contém soluto, o fenômeno de partição ocorre novamente, só que agora o soluto é transferido da fase móvel para a fase estacionária. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta partição entre as fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do seu ponto de aplicação no papel, para outro ponto localizado a alguma distância do local de aplicação no sentido do fluxo de solvente.
Como os aminoácidos diferem no grupamento R, possuem diferentes solubilidades, propriedade usada para sua separação no presente método, apresentando portanto diferentes taxas de migração (Rf). A detecção (Figura 3) se dá através de agentes capazes de revelar os aminoácidos em geral (como ninhidrina) ou específicos para determinados aminoácidos (como Sakaguchi para arginina, Pauly para histidina e Nitroprussiato para cisteína).
Reagentes e preparo das soluções:
Solvente de Partridge (n-butanol/ácido acético glacial/água 4:1:1)
Misturar 400 mL de n-butanol com 100 mL de ácido acético glacial e 100 mL de água
Ninhidrina 0,25%
Pesar 0,25g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.
Procedimento:
Traçar linhas (bem leves) de lápis, a 2 cm da borda inferior e 1,0 cm da borda superior do papel de filtro. Evitar tocar no papel durante toda a operação. As amostras devem ser aplicadas (com tubos capilares) nos pontos numerados de tal modo que a mancha formada sobre o papel seja a menor possível.
Aplique a amostra em um ponto do papel conforme o desenho:
			 P1 P2 P3 M
 2,0 cm
Seque as amostras (pode ser usado um secador). 
Colocar o papel em uma cuba apropriada contendo o solvente de Partridge. Tome o cuidado de não tocá-lo com os dedos e não encostar na parede da cuba.
Fechar a cuba. Deixar o solvente migrar até 1,0 cm da borda superior. 
Retirar o papel. Deixar secar à temperatura ambiente.
Pulverizar a tira de papel com a solução reveladora de Ninhidrina e levar à estufa (60°C) por 15 minutos. 
Após revelação, calcular o RF dos padrões e da mistura, para sua identificação.
Determinação da concentração de proteínas em uma amostra biológica pelo método do Biureto
Métodos de determinação da concentração de proteínas
A determinação da concentração de proteínas em materiais biológicos é necessária em diversas situações, como na purificação de uma determinada proteína a partir de um extrato de material biológico para o estudo de suas propriedades e funções, ou na avaliação dos níveis de certas proteínas que têm suas quantidades alteradas em determinadas situações patológicas.
Existem diversos métodos para a determinação do conteúdo total de proteínas em uma amostra. Suspensões puras de proteínas apresentam absorção de luz de comprimento de onda abaixo de 230 nm com absorção máxima a 220 nm, correspondente principalmente às ligações peptídicas. Entretanto, já que outros compostos como ácidos carboxílicos, íons de tampão, alcoóis, bicarbonato e substâncias aromáticas também absorvem nesta região, os resultados obtidos devem ser interpretados com cuidado. As proteínas também absorvem luz ultravioleta em comprimentos de onda próximos a 280 nm que correspondem a presença de tirosina (275 nm), triptofano (280 nm) e fenilalanina (260 nm) nas moléculas. Como o teor destes aminoácidos varia entre diferentes proteínas, a absorção a 280 nm será particular de cada grupo de proteínas. A quantificação de proteínas através da absorção a 280 nm é uma técnica rápida e eficiente, entretanto ela está sujeita a interferências, particularmente de ácidos nucléicos que exibem absorção máxima a 260 nm. Outros métodos bastante comuns baseiam-se no conteúdo de nitrogênio de proteínas (todas as proteínas possuem um conteúdo médio de nitrogênio de 16%), como o “método de Kjeldahl”, ou na reação de sulfato de cobre em meio alcalino com proteínas, que fornece um produto de coloração púrpura, como no “método do Biureto”. Também bastante utilizado, o “método de Folin-Lowry” apresenta modificações ao método do Biureto. Neste método, após a realização do método do Biureto é adicionado à reação o reagente de Ciocalteau (ácido fosfotúngstico fosfomobilídico) que é reduzido pela tirosina presente nas moléculas de proteínas. Nesta reação a coloração desenvolvida é mais muito mais intensa, tornando o método 100 vezes mais sensível do que o método do Biureto, sendo este bastante útil para amostras muito diluídas.
Todos os métodos possuem vantagens e limitações, portanto a escolha deve ser cautelosa e levar em consideração os diversos fatores relativos aquela analise, como, por exemplo, as características da amostra e a disponibilidade de recursos como equipamentos e reagentes.
Nesta prática será realizado o método do Biureto, que será descrito em maiores detalhes a seguir.
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA: 
Construir uma curva padrão de proteínas e determinar a concentração de proteínas totais em uma amostra biológica desconhecida pelo método do Biureto.
CONSTRUÇÃO DE UMA CURVA PADRÃO E DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA:
Objetivo: 
Determinação da concentração de proteínas através da formação de produtos com coloração que poderão ser quantificados por espectrofotometria.
Princípio do método:
Este método é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de Biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos). Maiores detalhes podem ser encontrados no roteiro da aula “Análise Qualitativa de Biomoléculas”.
Reagentes e preparo das soluções:
Reagente de Biureto:
Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sódio e potássio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de água;
Adicionar 300 mL de NaOH 10%;
Adicionar água destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de solução. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.
Solução padrão de caseína 1% (10 mg/mL):
Pesar 1g de caseína, dissolver com aproximadamente 70mL de água destilada e depois adicionar hidróxido de sódio 1M até a solução tornar-se límpida e completar o volume para 100mL. Aliquotar em frações de 10 mL e conservar a –20oC.
Procedimento:
A) Construção da curva padrão (ou curva de calibração) e determinação da concentração de proteínas em uma amostra biológica de concentração desconhecida
Identificar 7 tubos de ensaio e colocar em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela seguinte:
	Tubo (No)
	H2O
(mL)
	Caseína 
10 mg/mL
(mL)
	Amostra 
	Reativo de Biureto
(mL)
	Abs.
540 nm
	B
	1,0
	0
	-
	4,0
	
	1
	0,8
	0,2
	-
	4,0
	
	2
	0,6
	0,4
	-
	4,0
	
	4
	0,4
	0,6
	-
	4,0
	
	5
	0,2
	0,8
	-
	4,0
	
	6
	-
	1,0
	-
	4,0
	
	7
	-
	-
	1,0
	4,0
	
Após a adição do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos (a coloração púrpura formada é indicativa da presença de proteínas); 
Neste momento, inicie a realização do protocolo seguinte(abaixo) para a determinação da concentração de proteínas na amostra de concentração desconhecida que seu grupo recebeu no inicio desta aula;
REFERÊNCIAS:
PETKOWICZ, C.L.O. Bioquímica. 7. ed. Curitiba: Ed. UFPR, 2007.
NARDY, M. B.C.; STELLA, M.B.; OLIVEIRA, C. Práticas de laboratório de bioquímica e biofísica: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009. 
DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª Edition. W. H. Freeman and Company. New York.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA: 
Determinação da atividade enzimática da invertase de levedura. 
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE AÇUCAR REDUTOR:
Objetivo: 
	A construção da curva padrão de açúcar redutor (glicose) servirá para determinar a concentração de glicose produzida pela reação da invertase.
Princípio do experimento:
As reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são, na sua grande maioria, catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatíveis com as exigências metabólicas.
 A enzima escolhida para este estudo é justamente a invertase da levedura que catalisa a hidrólise da sacarose para produzir glicose e frutose:
 Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (µg) de açúcar redutor formado, por um cálculo estequiométrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (µg) sacarose hidrolisada. 
 Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo substrato da reação que catalisa utilizando um valor KM, que é a concentração de substrato necessária para se atingir metade da velocidade máxima da reação catalisada pela enzima em questão. Um modelo da reação onde a enzima interage com o substrato está fornecido abaixo:
 
onde E é a enzima, S é o substrato, ES é o complexo enzima-substrato e P é o produto da reação. Observe que a enzima é devolvida ao meio na mesma proporção em que foi utilizada na reação à esquerda.
 Michaelis e Menten, com essas considerações, desenvolveram a expressão de velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e desta forma puderam descrever o comportamento de diversas enzimas.
 onde [S] é a concentração do substrato e Vmáx é a velocidade máxima da reação, em mol (de produto formado) por unidade de tempo.
	Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermédio da "invertase" hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose, açúcares esses que são absorvidos pela célula. A membrana plasmática é impermeável à sacarose, e a levedura acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma exoenzima) para a hidrólise ocorrer fora da célula de levedura.
Hidrólise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose são açúcares redutores.
	No presente experimento a invertase será obtida de levedura de panificação (fermento Fleischmann) e adicionada à sacarose (açúcar não redutor), cuja hidrólise resulta na formação de açúcares redutores (glicose e frutose) que serão estimados pela reação de Somogyi-Nelson.
	Para tal se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de substrato (sacarose), resultando em diferentes velocidades de reação enzimática, permitindo, mediante um tratamento matemático adequado, determinar graficamente os valores de Km e Vm para a reação enzimática da levedura.
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE AÇUCAR REDUTOR:
Objetivo: 
	A construção da curva padrão de açúcar redutor (glicose) servirá para determinar a concentração de glicose produzida pela reação da invertase.
Princípio do experimento:
A invertase é uma enzima hidrolítica que catalisa a hidrólise da sacarose, dando como produto a glicose e a frutose. A sacarose é um dissacarídeo não-redutor assim para cada molécula de sacarose hidrolisada, duas moléculas redutoras são formadas.
Figura 19: Esquema geral da reação da invertase.
O nome da invertase foi dado a esta enzima porque ao hidrolisar a sacarose liberando glicose e frutose, ocorre uma inversão do sinal da rotação óptica de positivo para negativo sendo denominado açúcar invertido. A sacarose tem um desvio de +66,5(, a glicose de +52,7( enquanto o desvio da frutose é de -92(, portanto após a hidrólise, a rotação óptica que era de 66,5( passa a ser -39,3(.
As propriedades químicas da sacarose e do açúcar invertido são bem diferentes quanto ao poder edulcorante, solubilidade, poder redutor.
As enzimas que catalisam a hidrólise da sacarose são largamente distribuídas. As mais conhecidas são a invertase de leveduras e a sacarase intestinal.
Sendo um açúcar não redutor, pode-se medir a atividade hidrolítica da enzima pelo aparecimento de açúcar redutor (glicose mais frutose) após a incubação com a enzima. Para determinar a quantidade de açúcar redutor formado, basta utilizar uma curva-padrão de açúcar redutor elaborado nas mesmas condições.
Reagentes e preparo das soluções:
Reativo de Somoggy
Dissolver 28 g de fosfato dissódico anidro (Na2HPO4) e 40 g de tartarato duplo de sódio e potássio (C4H4O6NaK) em 500 mL de água destilada; adicionar 100 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M, dissolver 8 g de sulfato de cobre cristalizado em 80 mL de água destilada e adicionar lentamente com agitação. Após, acrescentar 180 g de sulfato de sódio anidro (Na2SO4), homogeneizar e completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar se necessário. Manter em frasco âmbar.
Reativo de Nelson
Dissolver 50 g de molibdato de amônio [(NH4) MoO4] em 800 mL de água destilada; adicionar 52 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado lentamente com agitação. Após, dissolver 3 g de arseniato de sódio (Na2HAsO4.7H2O) em 50 mL de água destilada, adicionar à solução acima e homogeneizar. Completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias, manter em frasco âmbar.
Glicose 0,02% (0,2 mg/mL)
Pesar 0,02 g de glicose, dissolver em água destilada e completar o volume para 100 mL em um balão volumétrico.
Procedimento:
Identificar 6 tubos de ensaio, colocar em uma estante e adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
	Tubos
	H2O
(mL)
	Glicose
0,2 mg/mL
(mL)
	Reativo de Somoggy
(mL)
	
Agitar bem e levar ao banho-maria fervente (100(C) por 10 min
	Reativo de Nelson
(mL)
	H2O
(mL)
	Glicose (mg)
	ABS
(530 nm)
	B
	1,0
	0
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	
	1
	0,8
	0,2
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	
	2
	0,6
	0,4
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	
	3
	0,4
	0,6
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	
	4
	0,2
	0,8
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	
	5
	0
	1,0
	1,0
	
	1,0
	7,0
	
	
Esta curva servirá para determinar a concentração do açúcar redutor produzido a partir da sacarose por ação da invertase;
Com os dados obtidos construir a curva-padrão (absorvância x concentração de glicose).
Construção da curva de Michaelis-Menten e cálculo do gráfico de Lineweaver-Burk:
Objetivo: 
	Determinação dos parâmetros cinéticos Km (constante de Michaelis) e Vmáx (velocidade máxima) através da construção dos gráficos de Michaelis-Menten e de Lineweaver-Burk.
.
Reagentes e preparo das soluções:
Os mesmos utilizados nos experimentos anteriores.
Procedimento:
Adicionar os reagentes em tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
	
	Tampão*
 (mL)
	Sacarose
0,4 M
(mL)
	
Enzima
 (mL)
	
Agitar bem e levar ao banho-maria por 15 min.
A 37oC
	Reativo de Somoggy
(mL)
	
Agitar bem e levar ao banho-maria fervente (100(C) por 10 min
	Reativo de Nelson
(mL)
	H2O
(mL)
	Absorvância a 530 nm
	B1
	2,3
	0,2
	-
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	1
	1,8
	0,2
	0,5
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	B2
	2,1
	0,4
	-
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	2
	1,6
	0,4
	0,5
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	B3
	1,7
	0,8
	-
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	3
	1,2
	0,8
	0,5
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	B4
	0,9
	1,6
	-
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	4
	0,4
	1,6
	0,5
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	B5
	0,5
	2,0
	-
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
	5
	0
	2,0
	0,5
	
	1,0
	
	1,0
	5,5
	
Construir os gráficos: velocidade x concentração de sacarose (Gráfico de Michaelis-Menten) e 1/V x 1/S (Gráfico de Lineweaver-Burk ou duplo-recíproco).
Agora com seus dados experimentais complete a tabela abaixo:
	tubo
	[sacarose](M)
	Atividade
(g/mL/min)
	1
	
	
	2
	
	
	3
	
	
	4
	
	
	5
	
	
2 Construa o gráfico de Michaelis-Menten (curva de sbstrato) em papel milimetrado.
3. Calcule os inversos e complete a tabela abaixo
	tubo
	1/[sacarose]
	1/atividade
	1
	
	
	2
	
	
	3
	
	
	4
	
	
	5
	
	
4. Construa o gráfico de Lineweaver-Burk (duplo recíproco) em papel milimetrado.
5. Calcule a constante de Michaelis e a velocidade máxima da enzima
ANÁLISE QUALITATIVA DE Carboidratos
Propriedades Químicas dos carboidratos
Diferentemente dos aminoácidos que apresentam reações específicas baseadas principalmente na natureza química de seu radical, os carboidratos apresentam estruturas muito parecidas entre si o que os torna quase impossíveis de identificá-los.
Neste caso o que se faz é caracterizar grupos de carboidratos utilizando suas propriedades químicas comuns.
As reações mais utilizadas na prática estão baseadas em 2 dessas propriedades:
Desidratação de carboidratos por ácidos fortes
Hexoses e pentoses colocadas nestas condições são desidratadas, respectivamente a hidroximetilfurfural e furfural; estes compostos são capazes de se condensar com substâncias fenólicas, com aminas aromáticas, tiocompostos, uréia. Os complexos formados são, algumas vezes, coloridos e utilizados para a caracterização de certos grupos glicídicos. Neste caso, situam-se:
Reação de antrona
Teste geral de glicídios
O reagente de antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor liberado pela diluição do H2SO4 é suficiente para que a reação ocorra. No caso de oligo e polissacarídeos, o ácido atua como catalisador de hidrólise convertendo-se a monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também como agente desidratante levando a formação de hidroximetilfurfural e furfural que, em presença de antranol, dão produtos de condensação coloridos.
O hidroximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses produz uma substância de coloração verde azulada realtivamente estável enquanto que o furfural proveniente da desidratação de pentoses fornece um produto de cor análoga, mas que em alguns inutos se torna vermelho-amarelada ou rubi.
O teste de antrona é muito sensível e pode ser usado, quando modificado, para a quantificação de glicídios. 
Reação de Seliwanoff
Teste de diferenciação entre aldoses e cetose
A reação é feita com resorcinol em meio de HCl à quente. As cetohexoses dão um produto de coloração vermelha que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses correspondentes reagem mais lentamente. Durante o tempo em que cetohexoses são desidratadas e reagem com o resorcinol fornecendo o produto, as aldohexoses fornecem apenas um produto levemente rosa.
Reação de Bial 
Teste para a identificação de pentoses e certos ácidos urônicos (galacturônico, glicurônico e outros) que se decompõem durante o aquecimento em presença de H+, formando pentoses.
O reagente consiste de orcinol em meio de HCl concentrado e em presença de íons Fe+3. O furfural proveniente da desidratação de pentoses quando aquecido em presença do reagente de Bial fornece uma cor verde. O hidroximetilfurfural (hexoses) reage formando um produto diferente que oscila entre amarelo e marrom.
O teste de Bial foi modificado a permitir quantificar pentoses, trioses e o ácio 5-cetoaldônico. As cetoheptoses fornecem produtos de coloração púrpura, as cetohexoses e metilpentoses formam inicialmente um produto de cor laranja que em repouso, posteriormente, precipita apresentando uma cor verde.
Poder redutor
Os açucares contêm grupos aldeídos e cetonas capazes de reduzir sais de metais pesados; desses os sais mais usados são dos de Cu+2.
O princípio fundamental de todos os procedimentos analíticos que utilizam Cu+2 é sua dissolução em meio alcalino em presença de ácidos orgânicos (como ácido c´trico e o ácido tartárico) capazes de formarem complexos. Também podem ser empregados outros ácidos orgânicos como EDTA, ácido láctico, ácido trihidroxiglutárico ou ácido sacárico. 
A reação de formação do complexo ocorre em geral em meio fortemente alcalino e isto promove profundas modificações na estrutura do açúcar. Os açucares apresentam um poder redutor diferente sobre o íon Cu+2. Isso significa que dois tipos de hexoses em uma mesma concentração fornecem quantidades diferentes de óxido cuproso (produto final da reação). A quantidade de íons cobre reduzida pelos diferentes glicídios é função do pH, da temperatura, da concentração e dos tipos de glicídios e íons orgânicos complexantes.
Há diversos métodos para a determinação de teor de Cu2O, os mais utilizados para a determinação em material biológico, são os colorimétricos que utilizam o Cu2O dissolvido em excesso de reagentes como fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsênio-molibdato, formando um complexo azul. Dentre os testes baseados em poder redutor de glicídio destacam-se:
Teste de Benedict
Teste geral de glicídio redutores.
O reagente consiste de uma única solução onde estão presentes íons Cu+2, citrato e carbonato de sódio. A reação é complexa e influenciada por uma série de fatores podendo ser esquematizada por:
Teste de Barfoed modificado
Teste de diferenciação entre monossacarídeos e dissacarídeos redutores
A reação é feita usando-se acetato de cobre em meio de ácido láctico (reagente de Barfoed) a quente e por 30 segundos; o produto formado nesta primeira etapa é posteriormente revelado com solução de fosfomolibdato. Só monossacarídeos formam produto de cor azul. A adição de ácido fosfomolíbdico leva a formação de um complexo corado de azul intenso.
 
Objetivo geral da prática
Identificar os carboidratos presentes em diferentes amostras dadas. Determinar algumas de suas propriedades químicas. 
Teste de Benedict:
Objetivo:
Identificar se amostra apresenta açúcar redutor (monossacarídeos e dissacarídeos) em sua composição.
Reagentes e preparo das soluções:
Reativo Benedict
Pesar 17,3 g de sulfato de cobre (CuSO4 . 5H2O), 173 g de citrato de sódio (Na3C6H5O7), 100 g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3), dissolver em água destilada e completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico.
Procedimento:
Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo:
Obs. Note que você irá fazer um controle positivo do teste usando uma solução de glicose.
	Tubos
	H2O (mL)
	Amostras (mL)
	Reagente de Benedict (mL)
	Resultados
	B
	0,2
	-----
	1,0
	
	CP
	-----
	0,2
	1,0
	
	CN
	-----
	0,2
	1,0
	
	A
	-----
	0,2
	1,0
	
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - açúcar redutor); CN (Controle Negativo – açúcar não redutor) e A (Amostra).
Aquecer os tubos em banho fervente (100oC) por 5 minutos;
O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração vermelha tijolo.
Teste de Barfoed modificado:
Objetivos:
Diferenciar monossacarídeos redutores de dissacarídeos redutores.
Reagentes e preparo das soluções:
Reativo Barfoed Modificado:
Dissolver 48 g de acetato cúprico ((CH3COO)2 Cu.H2O) em 900 mL de água destilada quente, adicionar lentamente 50 mL de ácido lático (C3H6O3) 8,5%. Resfriar e completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico. Filtrar se necessário.
Reagente Fosfomolídico:
Dissolver 150 g de ácido molíbdico (H2MoO4) e 75 g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3) em 500 mL de água destilada quente com agitação. Aquecer até ebulição. Filtrar.
Adicionar 300 mL de ácido fosfórico (H3PO4) 85%. Completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico.
Procedimento:
Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo:
	Tubos
	H2O
(mL)
	Amostras
(mL)
	Reagente de Barfoed
(mL)
	Aquecer os tubos em banho fervente (100oC) por 30 segundos
	Reagente Fosfomobdílico
(mL)
	
Resultados
	B
	0,2
	-----
	1,0
	
	0,5
	
	CP
	-----
	0,2
	1,0
	
	0,5
	
	CN
	-----
	0,2
	1,0
	
	0,5
	
	A
	-----
	0,2
	1,0
	
	0,5
	
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo – monossacarídeo redutor); CN (Controle negativo – dissacarídeo redutor); A (Amostra).
O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração azul escuro.
Teste do Iodo
Objetivos:
O objetivo do teste épermitir que o aluno seja capaz de identificar uma amostra contendo o polissacarídeo amido.
 
Princípio do método:
Reagentes e preparo das soluções:
Lugol (KI -I2)
Pesar 5 g de iodo (I2) e 10 g de iodeto de potássio (KI), dissolver em água destilada e completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico.
Procedimento:
Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo:
	Tubos
	H2O
(mL)
	Amostras
(mL)
	LUGOL
(gotas)
	Resultados
	B
	2,0
	-----
	2
	
	CP
	-----
	2,0
	2
	
	CN
	-----
	2,0
	2
	
	A
	-----
	2,0
	2
	
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - amido); CN (Controle negativo – glicose); A (Amostra).
Aguardar 30 segundos à temperatura ambiente;
O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração verde azulada.
REFERÊNCIAS: 
David L. Nelson & Michael M. Cox. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª Edition. W. H. Freeman and Company. New York.
ANÁLISE QUANTITATIVA DE COLESTEROL
(Reação de Liebermann-Buchard)
Objetivos:
Determinar concentração de colesterol em uma amostra biológica desconhecida.
Princípio do método:
Os esteróides, incluindo o colesterol, apresentam em sua estrutura o ciclopentanoperidrofenantreno que é representado por quatro anéis fundidos (A, B, C, D). O colesterol, que é um álcool esteróide ou esterol, apresenta uma função alcoólica na posição C3, uma insaturação entre os carbonos C5 e C6 e uma cadeia alquila em C17. Embora as propriedades de solubilidade sejam análogas as dos lipídios, esteróides como colesterol, possuem estrutura e propriedades químicas diferentes, podendo ser evidenciados através de reações de coloração específicas:
O ácido sulfúrico concentrado causa a desidratação da molécula de colesterol no grupo hidroxila C3 , fornecendo como produto o 3,5-colestadieno. O derivado desidratado na presença do reativo cromogênico produz o ácido bis-3,5-colestadienil-mono-sulfônico de coloração verde. 
Procedimento:
Construção de uma curva padrão e determinação da concentração de colesterol em uma amostra desconhecida:
Em tubos de ensaios, adicione os reagentes seguindo a ordem da tabela:
	TUBO
	Padrão de colesterol
(0,3 mg/ mL)
(mL)
	Amostra
(mL)
	Clorofórmio (mL)
	Anidrido Acético
(mL)
	H2SO4
Conc
(mL)
	Colesterol
(mg)
	ABS
	Branco
	-
	-
	5,0
	1,0
	0,1
	
	
	1
	0,1
	-
	4,9
	1,0
	0,1
	
	
	2
	0,2
	-
	4,8
	1,0
	0,1
	
	
	3
	0,4
	-
	4,6
	1,0
	0,1
	
	
	4
	0,8
	-
	4,2
	1,0
	0,1
	
	
	5
	1,0
	-
	4,0
	1,0
	0,1
	
	
	A
	
	1,0 
	4,0
	1,0
	0,1
	
	
Misturar e deixar em repouso por 10 minutos no escuro (em caso de presença de colesterol desenvolve-se uma coloração verde);
Realizar a leitura em espectrofotômetro a 650 nm.
REFERÊNCIAS: 
David L. Nelson & Michael M. Cox. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª Edition. W. H. Freeman and Company. New York.
ANÁLISE QUALITATIVA DE ÁCIDOS NUCLEICOS
(Extração e caracterização de DNA de cebola)
INTRODUÇÃO:
Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) são macromoléculas formadas por subunidades repetidas chamadas nucleotídeos, os quais são unidos através de ligações fosfodiéster, formando uma fita de comprimento variado (Figura 1). Os nucleotídeos, que possuem as características de serem estáveis em uma ampla faixa de pH, são constituídos por três estruturas:
• uma base nitrogenada: existem duas classes de bases nitrogenadas: as purinas e as pirimidinas. As principais purinas são guanina e adenina; e as principais pirimidinas são citosina, uracila e timina. Uracila é, geralmente, encontrada só em RNA e timina, só em DNA;
• um açúcar do tipo pentose: as pentoses podem ser de dois tipos: ribose, presente apenas nas moléculas de RNA e desoxirribose, presente apenas nas moléculas de DNA;
• um grupo fosfato: PO43-.
Figura 1. Estrutura do DNA.
O DNA é relativamente estável em soluções aquosas próximas do pH neutro, o que o torna adequado para o armazenamento da informação genética ao longo do tempo. Ao contrario, o RNA é mais instável (é mais suscetível à hidrólise). A separação das fitas de DNA pode ser estudada elevando-se a temperatura de uma solução. Em temperaturas relativamente baixas, poucos pares de bases são rompidos. Em temperaturas elevadas, as fitas de DNA se separam e adquirem uma conformação em espiral aleatória. A esse fenômeno dá-se o nome de desnaturação.
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA: 
Realizar a extração e a caracterização de DNA de uma amostra biológica.
EXTRAÇÃO DE DNA:
Objetivo:
Extrair DNA de uma amostra biológica (cebola).
Princípio do método:
Os métodos utilizados para a extração e dosagem do DNA celular nuclear de eucariontes implicam no rompimento das membranas citoplasmática e nuclear. Neste experimento, o rompimento das membranas plasmática e nuclear será realizado com o tratamento de um detergente comum. Os tratamentos com detergentes, iônicos ou não, são largamente utilizados na solubilização de proteínas e lipídeos de membrana. Nestes processos de solubilização por detergentes, são formadas micelas, que consistem de proteínas, lipídios e detergentes. O tratamento das células com uma concentração relativamente alta de detergente resulta no rompimento das membranas celulares e subsequente liberação das nucleoproteínas. A atividade da enzima digestiva (DNAase) será inibida pela ação do EDTA em meio alcalino − que altera pH e quela os íons divalentes necessários à ação da DNAase. A solução salina (NaCl) no início da experiência diminui a agregação proteica e minimiza a formação de precipitados (nucleoproteínas). A adição de etanol sobre a fase aquosa, contendo os ácidos nucleicos dissolvidos, resultará na precipitação destes, uma vez que o etanol diminui a constante dielétrica da água, promovendo uma menor solubilização das moléculas de DNA.
Reagentes e preparo das soluções:
Amostra: cebola 
Água destilada
Solução salina concentrada
Etanol absoluto 95% 
Detergente (solução de lise – SDS 0,1 % + EDTA 25 mM, pH 8,0)
Reativo de difenilamina
Procedimento:
Descascar 1/2 cebola de tamanho médio;
Ralar a cebola em ralador comum ou processador de alimentos (é importante que não haja grandes pedaços de cebola);
Homogeneizar em água destilada (20 mL aproximadamente); 
Acrescentar ao homogeneizado, ½ colher de cloreto de sódio e 3 mL de detergente;
Misturar evitando a formação de espuma;
Filtrar a suspensão em um funil com filtro de papel, perfex, algodão ou gase, recolhendo o filtrado em uma proveta;
Adicionar ao filtrado 20 mL de etanol 95% com auxílio do bastão de vidro. Não misturar! Observar na interfase a formação de um material insolúvel filamentoso (Figura 2).
Com auxílio do bastão de vidro, transferir o material insolúvel para um recipiente contento 1 mL de H2O destilada. 
Figura 2: Formação do material insolúvel filamentoso (novelo) após adição de álcool à solução.
REAÇÃO DE DIFENILAMINA:
Objetivo: 
Detectar a presença de desoxirribose.
Princípio do método:
Em meio ácido, as desoxirriboses livres de bases nitrogenadas geram grupamentos aldeídicos livres, que por sua vez sofrem desidratação, originando como produto aldeídos -hidroxilevulínicos (Figura 3). Estes aldeídos formados reagem com a difenilamina, gerando um produto de coloração azul (com absorvância máxima em 595 nm). Assim a reação da difenilamina é útil para caracterizar, indiretamente, a presença de DNA.
Figura 3: Reação da desoxirribose com difenilamina em meio ácido.
Reagentes e preparo das soluções:
Reativo de difenilamina: 
Pesar 1 g de difenilamina, dissolver em 100 mL de ácido acético P.A e adicionar 2,75 mL ácido sulfúrico P.A.
Procedimento:
Identificar 2 tubos de ensaio e colocar em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo.
	Tubo
	Amostra
	Volume de (mL)
	Reativo de Difenilamina (mL)
	HCl 37% (GOTAS)
	B 
	Água
	1,0
	1
	2
	D
	DNA de cebola
	1,0
	1
	2
Legenda: B (branco) e D (DNA).
Misturar e manter os tubos em banho fervente (100oC) por 10 min;
Retirar os tubos do banho-maria e resfriá-los;
Identificar a formação de uma coloração azul na tubo contendo a amostra de DNA (realizar a leiturano espectrofotômetro a 595 nm no caso de quantificação).
(1)
c = f X 
Lâmpada
Monocromador
Cubeta com amostra com c moles/litros da espécie a ser analisada
Intensidade da luz incidente 
I0
Intensidade da luz transmitida
 I
Detector




CN
AN
A3
A2
A1
C1
C3
C2
Onde:
A = absorvância;
C = concentração conhecida do padrão
Complexo com cobre
Biureto
Uréia
hidroximetilfurfural
antranol
Complexo verde musgo
Front
+
antranol
hidroximetilfurfural
Complexo verde azulado
+
H2O
hidroximetilfurfural
resorcinol
cetohexose
Produto de coloração vermelha
Produto de coloração verde
pentose
furfural
2H2O
+
orcinol
(precipitado
vermelho)
Composto oxidado + Cu2O 
Cu+2 + glicídio
Composto oxidado + Cu2O 
Cu+2 + glicídio
H3PO4 . 12 MoO3
Complexo de cor azul
Depois 
Antes 
Ácido Nucleico
+
+ H+
Difenilamina
H2O
Aldeído 
-hidroxilevulínico
2-desoxirribose
Complexo de cor azul