ROTEIROS AULAS DE MICRO 2022-02 (1)

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Manual de Estágio
	
Curso de Farmácia
	Disciplina: Microbiologia Geral e Clinica
Título da Aula: Preparo de Meio de Cultura: Meio Sólido
	
AULA 1
Objetivo: aprender sobre os cuidados no preparo e na esterilização de meios de cultura.
	Materiais
	Quantidades
	Meio de ágar nutriente, Mac Conckey,
Sabouraud, Manitol (qualquer um que esteja disponível)
	
Frasco sobre a bancada
	Placas de Petri estéreis (médias – com
capacidade para 25 mL cada)
	5 por grupo
	Balão volumétrico
	1 por grupo
	Tripé e tela de amianto
	1 conjunto por grupo
	Papel-kraft, fita de autoclave, algodão
hidrofóbico, barbante
	qsp
	Balança de precisão
	Bancada
Procedimento para o preparo de meios de cultura solidificados
1. Pesar a quantidade do meio de cultura desidratado indicado no rótulo do frasco, o suficiente para o preparo de 130 mL de meio.
2. Medir a quantidade de água destilada indicada no rótulo em uma proveta;
3. Em um balão volumétrico, dissolver o pó nos 100 mL de água destilada;
4. Deixar descansar por 10 minutos para que ocorra a hidratação do pó, facilitando a dissolução;
5. Aquecer o meio em uma chapa aquecedora até que ocorra a total dissolução do ágar, ou seja, quando o ágar “chorar” (as partículas de ágar escorrem pela parede do balão), o aquecimento deverá ser associado com agitação constante;
6. Esterilizar em autoclave o meio de cultura;
7. Fazer o plaqueamento do meio de cultura: Verter – uma pequena quantidade do meio de cultura em placas de Petri esterilizadas, ao redor do bico de bunsen; deixar que ocorra a solidificação do meio;
8. Efetuar o controle de qualidade dos meios de cultura: colocar as placas de Petri com o meio de cultura em uma estufa a 37 °C. Após 24h, observar se houve o crescimento de alguma colônia. Se houve, é porque ocorreu contaminação desse meio e ele não está esterilizado, não podendo ser utilizado – deve-se descartá-lo. Se não houve o crescimento de nenhuma colônia é porque o meio está realmente esterilizado, podendo ser utilizado;
9. Os meios que passaram no teste de esterilização devem ser armazenados na geladeira para posterior uso.
Atividade de fixação
1. Por que os microrganismos utilizam meios quimicamente definidos?
2. Por que o ágar é o agente solidificante ideal para uso em microbiologia?
3. Qual é a constituição do ágar? Qual é a finalidade de sua incorporação no meio de cultura?
4. Quando um microbiologista utiliza um meio de enriquecimento para o cultivo de microrganismos?
5. Como são preparados os meios de cultura? Descreva o procedimento.
	
Curso de Farmácia
	Disciplina: Microbiologia Geral e Clínica
Título da Aula: Semeadura Bacteriana
	
AULA 2
Roteiro 1
Objetivo: o procedimento de semeadura bacteriana é importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A aula também deve abordar a questão da seletividade dos meios de cultura.
Semeadura em meios sólidos
1.1 Semeadura em tubos de ensaio: esgotamento de alça: técnica utilizada para obtenção de crescimento bacteriano e/ou para a observação de propriedades bioquímicas da bactéria. A semeadura é, geralmente, feita da base do meio para a extremidade dele (pode também ser chamada de estriamento).
A semeadura também pode ser realizada da base para a extremidade do meio, de forma uniforme. Essa técnica é realizada para que haja crescimento bacteriano, bem como podemos utilizá-la para observar funções metabólicas de algumas bactérias.
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Em picada: essa técnica de semeadura é utilizada para que se possa observar funções metabólicas de alguns microrganismos (bactérias) que são submetidas a análise microbiológica.
1.2 Semeadura em placas de Petri: o material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos, porque o inóculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o número, menor a possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento adequada. Estrias múltiplas para isolamento: consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do
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material, de modo a se obter um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra. Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. A semeadura poderá ser realizada em um sentido ou em vários, de acordo com a pessoa que realizará a técnica, lembrando-se sempre que o objetivo principal dessa técnica de semeadura é a obtenção do isolamento bacteriano.
Alternativamente, para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano ou colônias isoladas (após diluição), utiliza-se o método de “espalhamento” em placa. Consiste em espalhar o material (suspensão bacteriana na maioria das vezes) com o auxílio de um swab (para obtenção de tapete uniforme) ou alça de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas após diluição), fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de Petri a ser utilizada nessa técnica. Deve-se ter o cuidado para que toda a superfície da placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura. Recomenda-se que faça o procedimento de semeadura com o swab em três direções distintas, com a alça em toda a superfície rodando a placa.
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Em profundidade ou incorporação: Pour-Plate – técnica que consiste em se adicionar 1 mL de uma suspensão bacteriana que esteja sendo estudada (analisada) a 20 mL de um meio de cultura fundido e resfriado, com posterior homogeneização com movimentos circulares. É utilizada por alguns microbiologistas para quantificar microrganismos.
Técnica para semeadura em superfície (meios sólidos)
· Retira-se uma alíquota microbiana (o inóculo) do tubo com a alça já flambada e fria;
· Abre-se a placa, de modo que a tampa forme um chapéu com a placa;
· Coloca-se o inóculo junto à parte superior da placa, procede-se então a técnica de semeadura escolhida;
· A seguir, a alça deve ser flambada ao rubro esfriada e acondicionada no suporte apropriado, ou a alça de Drigalski ou o swab devem ser desprezados em recipiente apropriado a ser posteriormente esterilizado;
· Depois de terminada a semeadura, fechar a placa e identificar, levando-a a seguir para incubação na estufa, com a tampa voltada para baixo.
1.3 Semeadura em meios líquidos
Difusão: técnica que consiste em acrescentar microrganismos através da alça ou agulha de platina em meios líquidos. Tem como principal finalidade a observação de propriedades bioquímicas por testes microbiológicos, bem como poderá ser utilizada para o favorecimento do crescimento bacteriano, quando é realizada em meios que possibilitem o enriquecimento.
Manual de Estágio
Técnica para semeadura em meios líquidos
· Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás da chama para proteção do operador);
· Retirar a rolha de algodão do tubo que contém o microrganismo a ser semeado ou repicado (que deverá estar na mão esquerda), utilizando-se o dedo mínimo da mão direita. A ROLHA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURADA COM O DEDO MÍNIMO ATÉ O FINAL DA OPERAÇÃO;
· Flambar a boca do tubo e retirar o inóculo com a alça fria; flambar novamente a boca do tubo e fechar;
· Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar;
· Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar;
· Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa.
1.4 Semeadura em meios semissólidos – em picada: essa técnica de semeadura é utilizada para que se possam observar funções metabólicas ou características físicas, como motilidade de alguns microrganismos que são submetidos à análise microbiológica.
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Técnica para semeadura em meios semissólidos
· Retirar o microrganismo do meio sólido ou líquidocom o auxílio de uma alça em agulha já flambada e fria;
· Abrir o tubo que contém o meio semissólido e semear o microrganismo através de picada até mais ou menos 1/3 ou 1/2 do tubo;
· Fechar o tubo, identificar e levar para incubação;
· Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado.
	Materiais
	Quantidades
	Placas de Petri contendo meio de
cultura ágar simples (ágar nutriente)
	3 por grupo
	Tubos de ensaio contendo caldo simples
esterilizado
	3 por grupo
	Tubo de ensaio com 2 mL de cultura
(BHI inoculado com S. aureus ou E. coli)
	1 por grupo
	Placa de Petri de ágar Manitol ou Mac Conckey (com respectivamente S. aureus e/
ou E. coli)
	
1 por grupo
	Tubo com ágar nutriente inclinado
	1 por grupo
	Tubo com ágar M.I.O.
	1 por grupo
	Alça bacteriológica
	1 por grupo
	Alça de Drigalski
	1 por grupo
	Alça bacteriológica ponta agulha
	1 por grupo
	Pipeta de vidro esterilizada (1 mL)
	1 por grupo
	Swab de algodão
	3 por grupo
	
Curso de Farmácia
	Disciplina: Microbiologia Geral e Clínica
Título da Aula: Coloração de Gram
	
AULA 2
Roteiro 2
Objetivo: a avaliação da morfologia microbiana é muito importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A coloração de gram também deve ser revisada dada sua grande importância no diagnóstico clínico das amostras microbiológicas.
	Materiais
	Quantidades
	Solução salina
	10 mL (por grupo)
	Corantes para a coloração de gram
	1 por grupo
	Cristal de violeta, lugol, álcool – acetona
e safranina
	1 por grupo
	Placas pré-cultivadas com S. aureus
	1 por grupo
	Placas pré-cultivadas com E. coli
	1 por grupo
	Placas pré-cultivadas com leveduras
	1 por grupo
	Óleo de imersão
	1 por grupo
	Equipamentos
	Quantidades
	Lâminas
	5 por grupo
	Microscópios
	1 por grupo
	Alças bacteriológicas
	1 por grupo
	Estufa 37 °C
	1
Manual de Estágio
Técnica coloração de gram
1) Em uma lâmina, pingar uma gota de solução salina estéril.
2) Recolher uma colônia pré-cultivada com alça bacteriológica.
3) Colocar a colônia selecionada junto à lâmina e homogeneizar.
4) Fixar o esfregaço no calor.
5) Cobrir o esfregaço com cristal de violeta por 1 minuto.
6) Lavar o esfregaço com água corrente, removendo o excesso de corante.
7) Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto.
8) Repetir o passo 6.
9) Descorar com álcool acetona até remover o excesso de corante.
10) Repetir o passo 6.
11) Cobrir o esfregaço com safranina por 30 segundos.
12) Lavar e secar.
13) Examinar ao microscópio (1000x).
Atenção! Todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos.
Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança.
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Manual de Estágio
Procedimento
Cada grupo deverá reproduzir as seguintes técnicas de semeadura:
· Semeadura por estrias múltiplas;
· Semeadura por espalhamento com swab de algodão e alça de Drigalski;
· Semeadura em meio líquido com alça bacteriológica;
· Semeadura por estrias em meio sólido em tubo;
· Semeadura em picada em tubo com meio semissólido.
Os materiais devem ser identificados e incubados a 37 °C, por 48h, em estufa bacteriológica.
Interpretação dos resultados e discussão.
Avaliar o crescimento microbiano nos diferentes meios de cultura e relacionar o tipo de crescimento à técnica de semeadura realizada.
Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança.
	
Curso de Farmácia
	Disciplina: Microbiologia Geral e Clínica 
Título da Aula: Provas Bioquímicas
	
AULA 3
ROTEIRO 1
Procedimento
As provas bioquímicas são essenciais para o diagnóstico e a identificação das bactérias patológicas. A interpretação dos resultados dessas provas bioquímicas permite ao profissional identificar os microrganismos.
Prova TSI
Essa prova avalia em um só tubo a utilização de glicose e lactose pelas bactérias, também verifica a formação de h2S pelas bactérias.
1) Semear bactérias (bacilos gram negativos previamente semeados) por picada e por estrias na superfície do meio TSI.
2) Encubar por 24 horas.
3) Verificar os resultados no cilindro do tubo e na superfície do tubo.
Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha), fermentação apenas da glicose. Cilindro ácido (amarelo) e rampa ácida (amarela), fermentação de lactose e glicose.
Produção de gás: observa-se se houve fratura no meio.
Verificação do uso da lactose
1) Semear bacilos gram negativos em ágar Mac Conkey.
2) Verificar a formação de colônias Pink (lactose positiva).
Servięo Social
3) Encubar a 37 °C por 48 horas.
	Materiais
	Quantidades
	Ágar TSI
	1 por grupo
	Ágar Mac Conkey
	1 por grupo
	Alças bacteriológicas
	1 por grupo
	Bacilos gram negativos pré-cultivados
	1 por grupo
	Equipamento
	Quantidade
	Estufa 37 °C
	1
Atenção! Todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos.
	
Curso de Farmácia
	Disciplina: Microbiologia Geral e Clínica 
Título da Aula: Diagnóstico dos cocos Gram +
	
AULA 3
ROTEIRO 2
Objetivo: os cocos gram positivos são um importante grupo de bactérias causadoras de patologias nos seres humanos. A identificação das principais bactérias desse grupo é de vital importância em laboratórios clínicos.
Procedimento
Verificação da morfologia das bactérias (lâminas pré-preparadas).
Prova da catalase
1) Em uma lâmina, pingar uma gota de água oxigenada.
2) Remover uma colônia pré-semeada e adicionar à lâmina.
3) Homogeneizar	e	verificar	a	formação	de	bolhas	(Staphylococcus	sp)	ou não (Streptococcus sp).
Verificação de hemólise em ágar sangue
1) Em placas pré-semeadas com Estreptococos, solicitar ao aluno que verifique o tipo de hemólise (halo esverdeado, incolor e sem hemólise).
Manual de Estágio
Prova da coagulase
1) Em tubos contendo 0,5 mL de plasmacoagulase ou soro humano, inocular uma alçada da colônia de Staphylococcus aureus e levar para estufa a 37 °C, aguardar formação do coágulo após aproximadamente 2 horas.
	Materiais
	Quantidades
	Água oxigenada
	100 mL
	Alças bacteriológicas
	1 por grupo
	Lâminas
	5 por grupo
	Placas de ágar sangue
	1 por grupo
	Placas pré-semeadas com
Staphylococcus e Streptococcus
	1 por grupo
	Tubos com 0,5 mL de plasmacoagulase
ou soro humano
	1 por grupo
	Equipamento
	Quantidade
	Microscópio
	1 por grupo
Atenção! Todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos.
	
 Curso de Farmácia
	Disciplina: Microbiologia Geral e Clínica
Título da Aula: Antibiograma
	
AULA 3
ROTEIRO 3
Objetivo: o antibiograma se constitui da principal prova microbiológica. Essa prova direciona o tratamento antimicrobiano das infecções.
Procedimento (Parte 1 – esta aula será continuada em aula posterior)
1. Preparar o inóculo em tubos de solução fisiológica estéril utilizando as colônias de
Staphylococcus aureus segundo a escala de Mac Farland.
2. Semear bactérias (por espalhamento) em ágar Müller Hünton (usando swab).
3. Colocar com pinça os discos de antibiograma sobre o meio.
4. Incubar por 24-48 horas.
5. Verificar o crescimento ou não de bactérias.
6. Medir o diâmetro dos halos de inibição em cada disco. Se igual ou superior a 2 centímetros (considerar sensível).
	Materiais
	Quantidades
	Ágar Müller Hünton
	2 por grupo
	Discos de antibiograma (diversos)
	1 por grupo
	Swab
	2-3 por grupo
	Escala de Mac Farland
	Bancada
	Alça de platina
	1 por grupo
	Placa de ágar sangue contendo colônias
crescidas de Staphylococcus aureus
	1 por grupo
	Tubos contendo 2 mL de solução
fisiológica estéril
	1 por grupo
Servięo Social
	Equipamento
	Quantidade
	Estufa 37 °C
	1
Atenção! Todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulaçãoe ao descarte de microrganismos.