Apresentação de Diagnóstico molecular

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D E T E C Ç Ã O P R E C O C E D O I B V U S A N D O
A T É C N I C A D E N E S T E D - P C R 
D i s c e n t e :D i s c e n t e : P a u l o M i q u e i a sP a u l o M i q u e i a s
S u m á r i o
 Introdução
 Justificativa
 Objetivo
 Materiais e métodos
 Desenvolvimento
 Resultados
 Conclusão
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
I N T R O D U Ç Ã O
 A bronquite infecciosa é uma doença viral e contagiosa das aves;
Causa sintomas respiratórios;
A doença é causada pelo coronavírus da bronquite infecciosa (IBV);
A bronquite infecciosa é uma preocupação constante para os
produtores de aves;
O objetivo deste trabalho é descrever o uso da técnica de Nested-
PCR para a detecção precoce do IBV em amostras de swab de
traqueia de aves.
J U S T I F I C A T I V A
A bronquite infecciosa é uma doença viral altamente contagiosa
que afeta as aves causando perdas econômicas significativas
para a indústria avícula em todo o mundo
 
 O vírus causador da bronquite infecciosa (IBV) é um coronavírus
que afeta principalmente o trato respiratório das aves, sendo sua
detecção precoce essencial para o controle da doença e para a
prevenção da sua disseminação
J U S T I F I C A T I V A
 O desenvolvimento de uma técnica molecular sensível e específica
para a detecção de IBV em amostras clínicas de aves é de extrema
importância para o seu controle e preservação da economia avícola
A detecção do IBV pode ser desafiadora devido aos sintomas
semelhantes à outras doenças respiratórias e a sorologia muitas
vezes inconclusiva devido a uma resposta imune inespecífica
A técnica de Nested-PCR é altamente específica e sensível, sendo o
objetivo deste trabalho desenvolver e validar esta técnica para a
detecção precoce do IBV em amostras de suabe de traqueia de aves
O B J E T I V O
O objetivo deste trabalho é descrever um
protocolo para a detecção precoce do IBV
usando a técnica Nested-PCR. 
M A T E R I A I S E M É T O D O S
 Swabs
Amostras de muco traqueal
Kit comercial - extração de RNA viral
Kit comercial - transcrição reversa (RNA - cDNA)
Kit Nested - PCR
Primers seletivos IBV
M A T E R I A I S E M É T O D O S
Coleta armazenamento Transporte
extração
Rna viral
Nested-pcr
em duplicata
Conversão
Rna - cDNA
M A T E R I A I S E M É T O D O S
N E S T E D - P C R 
N A P R I M E I R A E T A P A S E R Ã O U S A D O S O S I N I C I A D O R E S
E X T E R N O S P A R A A M P L I F I C A R U M F R A G M E N T O D E 4 0 0 -
5 0 0 P B . 
A M I S T U R A R E A C I O N A L S E R Á C O M P O S T A D E 5
M I C R O L I T R O S D E R N A V I R A L E X T R A Í D O , 5 M I C R O L I T R O S
D E T A M P Ã O D E R E A Ç Ã O , 0 , 5 M I C R O L I T R O S D E T A Q D N A
P O L I M E R A S E , 1 M I C R O L I T R O D E C A D A I N I C I A D O R
E X T E R N O , 2 M I C R O L I T R O S D E D N T P S E Á G U A L I V R E D E
N U C L E A S E A T É O V O L U M E F I N A L D E 5 0 M I C R O L I T R O S . 
P C R : D E S N A T U R A Ç Ã O I N I C I A L A 9 4 ° C / 5 M I N , S E G U I D O D E
3 5 C I C L O S D E D E S N A T U R A Ç Ã O A 9 4 ° C / 3 0 S E G ,
A N E L A M E N T O A 5 5 ° C / 3 0 S E G E E X T E N S Ã O A 7 2 ° C / 1 M I N ,
C O M E X T E N S Ã O F I N A L A 7 2 ° C / 1 0 M I N .
M A T E R I A I S E M É T O D O S
N E S T E D - P C R 
N A S E G U N D A E T A P A S E R Ã O U S A D O S O S I N I C I A D O R E S
I N T E R N O S P A R A A M P L I F I C A R U M F R A G M E N T O M E N O R
D E N T R O D O P R I M E I R O F R A G M E N T O A M P L I F I C A D O .
A M I S T U R A R E A C I O N A L S E R Á C O M P O S T A D E 5
M I C R O L I T R O S D O P R O D U T O D A P R I M E I R A P C R ,
5 M I C R O L I T R O S D E T A M P Ã O D E R E A Ç Ã O , 0 , 5 M I C R O L I T R O S
D E T A Q D N A P O L I M E R A S E , 1 M I C R O L I T R O D E C A D A
I N I C I A D O R I N T E R N O , 2 M I C R O L I T R O S D E D N T P S E Á G U A
L I V R E D E N U C L E A S E A T É O V O L U M E F I N A L D E
5 0Μ I C R O L I T R O S . 
A P C R P A R A A M B A S A S E T A P A S S E R Á C O M P O S T A D E 3 5
C I C L O S , I N C L U I N D O D E S N A T U R A Ç Ã O ( 1 ) S E G U I D O D E
D E S N A T U R A Ç Ã O ( 2 ) , A N E L A M E N T O , E X T E N S Ã O E
E X T E N S Ã O F I N A L .
C O L E T A D O M A T E R I A L A S E R A N A L I S A D O
 A M O S T R A S D E S W A B E D E T R A Q U E I A D E A V E S C O M S U S P E I T A S D E I N F E C Ç Ã O .
M A T E R I A S :
 S W A B E 
 K I T D E E X T R A Ç Ã O D E R N A V I R A L ( Q I A G E N )
 C O N J U N T O D E R E A G E N T E S E P R O T O C O L O S - E X T R A Ç Ã O D E Á C I D O
R I B O N U C L E I C O ( R N A ) V I R A L D E A M O S T R A S B I O L Ó G I C A S .
D E S E N V O L V I M E N T O
E S P E C I F I C A M E N T E P A R A E X T R A I R R N A V I R A L 
 A L T A Q U A L I D A D E E P U R E Z A 
V A R I E D A D E D E A M O S T R A S
 A M O S T R A S C L Í N I C A S E A M B I E N T A I S
 P L A S M A ,
 S A L I V A , 
F E Z E S , 
U R I N A , 
T E C I D O S
S W A B S
D E S E N V O L V I M E N T O
E X E C U Ç Ã O D A T É C N I C A N E S T E D - P C R
D U A S E T A P A S ,
 A M P L I F I C A Ç Ã O D O D N A A L V O E M D U A S R O D A D A S D E A M P L I F I C A Ç Ã O 
D I F E R E N T E S E I N I C I A D O R E S
 P C R E X T E R N A
 P C R I N T E R N A
O O B J E T I V O D A N E S T E D - P C R :
 A U M E N T A R A S E N S I B I L I D A D E D A D E T E C Ç Ã O D E U M A L V O E S P E C Í F I C O ,
R E D U Z I N D O A P R O B A B I L I D A D E D E A M P L I F I C A Ç Ã O D E P R O D U T O S N Ã O
E S P E C Í F I C O S .
D E S E N V O L V I M E N T O
E X T R A Ç Ã O D O R N A V I R A L :
 K I T D E E X T R A Ç Ã O D E R N A V I R A L
T R A N S C R I Ç Ã O R E V E R S A D O R N A V I R A L E M C D N A : 
 T R A N S C R I P T A S E R E V E R S A E U M O L I G O N U C L E O T Í D E O 
P R E P A R A Ç Ã O D O S I N I C I A D O R E S D E P C R :
 C O N J U N T O D E I N I C I A D O R E S E X T E R N O S
 C O N J U N T O D E I N I C I A D O R E S I N T E R N O S 
1 .
A .
2 .
A .
3 .
A .
B .
D E S E N V O L V I M E N T O :
D E S E N V O L V I M E N T O
A M P L I F I C A Ç Ã O D O D N A A L V O P O R N E S T E D - P C R : 
 P R I M E I R A R O D A D A
 P C R E X T E R N A - ( P R I M E R S ) Q U E S E L I G A M E M S E Q U Ê N C I A S E S P E C Í F I C A S N A E X T R E M I D A D E
D O D N A A L V O .
 D E S N A T U R A Ç Ã O : 9 5 ° C P O R 3 M I N U T O S
 A B R I R A D U P L A H É L I C E D O D N A E S E P A R A R A S D U A S F I T A S C O M P L E M E N T A R E S .
T E M P E R A T U R A É R E D U Z I D A P A R A 5 0 ° C : P R I M E S S E L I G A M E I N I C I E M A S Í N T E S E D E N O V A S
F I T A S D E D N A .
T E M P E R A T U R A É E L E V A D A P A R A 7 2 ° C : E N Z I M A T A Q P O L I M E R A S E , 
 N O V O S N U C L E O T Í D E O S À S F I T A S E M C R E S C I M E N T O . 
1 .
A .
I .
I I .
1 .
B .
C .
I .
D E S E N V O L V I M E N T O
E S S E C I C L O É R E P E T I D O 3 5 V E Z E S P A R A A M P L I F I C A R O D N A A L V O . 
N A Ú L T I M A E T A P A , A T E M P E R A T U R A É M A N T I D A A 7 2 ° C P O R 5 M I N U T O S
 C O M P L E T A E X T E N S Ã O - F I T A D E D N A
G A R A N T I R A E F I C I Ê N C I A D A A M P L I F I C A Ç Ã O .
N E S T E D - P C R É U M A T É C N I C A M U I T O S E N S Í V E L E E S P E C Í F I C A
 B A I X A S C O N C E N T R A Ç Õ E S D E D N A A L V O E M U M A A M O S T R A
E V I T A R C O N T A M I N A Ç Õ E S D U R A N T E A E X T R A Ç Ã O D E R N A E P R E P A R A Ç Ã O D O S R E A G E N T E S . 
A N Á L I S E D O S P R O D U T OS A M P L I F I C A D O S :
 E L E T R O F O R E S E E M G E L D E A G A R O S E
 P R O D U T O D E A M P L I F I C A Ç Ã O C O M O T A M A N H O E S P E R A D O I N D I C A A
P R E S E N Ç A D O I B V N A A M O S T R A .
V A L I D A Ç Ã O D A T É C N I C A :
 A T É C N I C A D E N E S T E D - P C R D E V E S E R V A L I D A D A 
A N T E S D E S E R U T I L I Z A D A E M A M O S T R A S C L Í N I C A S ,
A V A L I A Ç Ã O D A E S P E C I F I C I D A D E , S E N S I B I L I D A D E , P R E C I S Ã O E R O B U S T E Z
D O M É T O D O .
1 .
A .
I .
2 .
A .
I .
I I .
D E S E N V O L V I M E N T O
 A P Ó S A R E A L I Z A Ç Ã O D A N E S T E D - P C R :
P R O D U T O S A M P L I F I C A D O S S E R Ã O S E P A R A D O S E M G E L D E A G A R O S E
 V I S U A L I Z A D O S S O B L U Z U V 
 C O L O R A Ç Ã O C O M B R O M E T O D E E T Í D I O .
 B A N D A S C O M T A M A N H O C O R R E S P O N D E N T E A O S F R A G M E N T O S E S P E R A D O S I N D I C A R Á
A P R E S E N Ç A D O I B V N A S A M O S T R A S T E S T A D A S .
 A S E N S I B I L I D A D E D A N E S T E D - P C R É D E A T É 1 0 C Ó P I A S V I R A I S P O R R E A Ç Ã O ,
 M É T O D O A L T A M E N T E S E N S Í V E L P A R A A D E T E C Ç Ã O P R E C O C E D O I B V . 
D E S E N V O L V I M E N T O
N E S T E D - P C R P A R A A D E T E C Ç Ã O D O C O R O N A V Í R U S D A B R O N Q U I T E I N F E C C I O S A ( I B V )
 P O S I T I V O S E M V Á R I A S A M O S T R A S D E S W A B 
 A S B A N D A S E S P E C Í F I C A S D E T A M A N H O C O N H E C I D O V I S U A L I Z A D A S E M G E L D E
A G A R O S E A 2 % I N D I C A R A M A P R E S E N Ç A D O G E N E A L V O D O I B V N A S A M O S T R A S
T E S T A D A S . 
R E S U L T A D O S
UM
 GUIA PARA A PROTEÇÃO COLETIVA
PR
EV
EN
ÇÃ
O 
À 
CO
VI
D-
19
 N
A 
VO
LT
A 
AO
 T
RA
BA
LH
O
R E S U L T A D O S
 T É C N I C A D E N E S T E D - P C R P O D E M S E R U S A D O S P A R A :
O R I E N T A R A S M E D I D A S D E P R E V E N Ç Ã O E C O N T R O L E D O I B V E M A V E S ,
 M I N I M I Z A R A S P E R D A S E C O N Ô M I C A S A S S O C I A D A S À D O E N Ç A .
 D I A G N Ó S T I C O P R E C O C E D O I B V E M A M O S T R A S D E S U A B E D E T R A Q U E I A D E A V E
 R E S U L T A D O S R Á P I D O S E C O N F I Á V E I S . 
UM
 GUIA PARA A PROTEÇÃO COLETIVA
PR
EV
EN
ÇÃ
O 
À 
CO
VI
D-
19
 N
A 
VO
LT
A 
AO
 T
RA
BA
LH
O
C O N C L U S Ã O
 A T É C N I C A D E N E S T E D - P C R É U M A F E R R A M E N T A S E N S Í V E L E
E S P E C Í F I C A P A R A A D E T E C Ç Ã O P R E C O C E D O C O R O N A V Í R U S D A
B R O N Q U I T E I N F E C C I O S A ( I B V ) E M A V E S
 A T É C N I C A D E N E S T E D - P C R A P R E S E N T O U U M A L T O G R A U D E
E S P E C I F I C I D A D E E S E N S I B I L I D A D E
 A A P L I C A B I L I D A D E D E S S E E S T U D O P E R M I T E A A D O Ç Ã O D E M E D I D A S
P R E V E N T I V A S E D E C O N T R O L E , M I N I M I Z A N D O A S P E R D A S
E C O N Ô M I C A S .
R E F E R Ê N C I A S :
C A V A N A G H , D . , & C H A R V E T , J . ( 2 0 1 6 ) . I N F L U E N Z A A N D O T H E R R E S P I R A T O R Y V I R U S E S :
S T A N D A R D I Z I N G D I S E A S E S U R V E I L L A N C E S Y S T E M S T O I M P R O V E O U T B R E A K D E T E C T I O N A N D
R E S P O N S E . P U B L I C H E A L T H R E P O R T S , 1 3 1 ( 6 ) , 7 6 6 - 7 7 1 .
S U N , Y . , H U A N G , X . , W A N G , H . , L I U , S . , & W A N G , Y . ( 2 0 2 1 ) . A R E V E R S E T R A N S C R I P T I O N L O O P -
M E D I A T E D I S O T H E R M A L A M P L I F I C A T I O N A S S A Y F O R R A P I D D E T E C T I O N O F A V I A N I N F E C T I O U S
B R O N C H I T I S V I R U S . B M C V E T E R I N A R Y R E S E A R C H , 1 7 ( 1 ) , 1 - 7 .
R A H M A N , M . M . , & U D D I N , M . J . ( 2 0 1 8 ) . D I A G N O S I S A N D C O N T R O L O F I N F E C T I O U S B R O N C H I T I S
V I R U S : A R E V I E W . I N T E R N A T I O N A L J O U R N A L O F V E T E R I N A R Y S C I E N C E A N D M E D I C I N E , 6 ( 2 ) , 1 0 9 -
1 1 5 .
O B R I G A D O !