Fisiopatologia da Reprodução de Machos - Manipulação do Sêmen

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MANIPULAÇÃO DO SÊMEN 
 
BIOTECNOLOGIA 
 
- Tecnologia desenvolvida a partir de conhecimentos de uma 
ou de várias áreas da biologia; 
- Gerada com finalidade produtiva. 
 
BIOTECNOLOGIA DA REPRODUÇÃO 
 
- Inseminação artificial > biotecnologia mais utilizada: 
→ Outros passos envolvidos antes de realizá-la; 
→ Coleta de sêmen; 
→ Manipulação do sêmen; 
→ Preparação da fêmea. 
 
MÉTODOS DE COLETA DE SÊMEN 
 
ESPONJA 
 
- Coloca-se a esponja no fundo da vagina; 
- Absorção de líquidos; 
- Técnica muito limitada; 
- Grandes possibilidades de perda do ejaculado > esponja 
não absorve tudo; 
- Alto grau de contaminação; 
- Qualidade seminal inferior à Vagina Artificial. 
 
CAMISINHA 
 
- Método de coleta inferior à vagina artificial; 
- Única opção – VA indisponível; 
- Garanhões que não ejaculam em VA: 
→ Temperaturas impróprias; 
→ Montagem e manipulação errada da VA; 
→ Traumas > equinos possuem memória muito boa; 
→ Psicológico; 
→ Acostumados com monta natural. 
- Qualidade seminal inferior à VA > excesso de contaminação 
> bactérias e debris celulares. 
 
FARMACOLÓGICA 
 
- Drogas ansiolíticas: xilazina, imipramina, prostaglandina; 
- Pouco volume, alta concentração > não tem grandes 
volumes de líquido seminal proveniente das glândulas 
acessórias > basicamente o que vem é quase 
espermatozoide puro; 
- É utilizado na IA e criopreservação; 
- Garanhões com problemas ou distúrbios ejaculatórios; 
- Animais impossibilitados de realizar cobertura por 
debilidade ou dor na monta: 
→ Animais que possuem incoordenação motora; 
→ Sequelas de doenças neurológicas; 
→ EPM; 
→ Paralisia peniana; 
→ Laminite. 
- Contração da musculatura lisa do epidídimo > sêmen cai no 
copo coletor. 
VAGINA ARTIFICIAL 
 
- Método mais utilizado; 
- Vários modelos – preferência pessoal e custos; 
- Possui uma entrada e saída > para o garanhão não 
ultrapassar o limite posterior da vagina artificial; 
- Glande aumenta de 200 a 300% do seu tamanho; 
- No momento em que o garanhão ejacula, deve-se liberar o 
conteúdo que está na câmara (entre a parede e a mucosa 
látex) > abre a torneira, água cai e libera a pressão para que 
o garanhão não fique com o pênis preso na VA. 
 
FATORES QUE CAUSAM FALHA NA COLETA: 
- Posição incorreta; 
- Temperatura inadequada; 
- Excesso de pressão. 
 
PREPARO DA VAGINA ARTIFICIAL: 
- Componentes; 
- Cuidado na montagem; 
- Temperatura = 42-45°C; 
- Lubrificação. 
 
 
1- VA. 2- Bobina de mucosa descartável. 3- Copo coletor. 4- Filtro. 
Capuz para que sêmen não pegue luminosidade. Lubrificante. 
 
- Água deve ser colocada entre 48-50°C. 
 
FORMA DE COLETA: 
- Égua em estro > estrogenizada para ficar mais receptiva; 
- Égua em diestro ou anestro; 
- Manequim; 
- Fazer a contenção da égua. 
 
SINAIS DE RECEPTIVIDADE DA ÉGUA AO GARANHÃO: 
- Deslocamento lateral da cauda > principal sinal; 
- Urina em jato; 
- Relincha para atrair o garanhão; 
- Vulva inchada; 
- Reversão de clitóris > expõem o clitóris, fica “pulsando”; 
- Abaixa a garupa se mostrando receptiva. 
 
SINAIS QUE O GARANHÃO EJACULOU: 
- Arremetidas pélvicas > “saltos” sem sair do chão; 
- Movimento pendular da cauda > “cauda em bandeira”; 
- “Sapateia” com os posteriores > não consegue observar em 
cavalos agitados; 
- Coleta com VA > coloca a mão na base do pênis e sente os 
pulsos ejaculatórios. 
 
 
 
COLETA EM ESTAÇÃO 
 
- Treinamento; 
- Lavagem do pênis com a água morna é estimulatório. 
 
MÉTODO: 
- Excitar o garanhão, lavar o pênis com água morna e secar; 
- Aproximação de água em cio > estímulo visual e olfatório; 
- Colocar a VA até a base do pênis e movimentos de “vai e 
vem” ao longo da base do pênis; 
- Arremetidas pélvicas > ejaculação após 5 a 10x; 
- Pescoço deve ser liberado para poder esticar e fazer 
curvatura em cima da égua. 
 
COLETA DA CAUDA DO EPIDÍDIMO 
 
- Óbito do garanhão; 
- Patologias > necessidade de retirada do testículo > hérnia 
inguino-escrotal. 
 
- Dissecação do epidídimo e fazer fluxo retrógrado > ejetar 
diluidor em uma das pontas, empurrando o sêmen 
armazenado na cauda para poder realizar a coleta; 
- Deve-se coletar o mais rápido possível > quanto mais 
tempo demora, mais espécies reativas de oxigênio, mais 
lesão tem a célula espermática. 
 
ANÁLISE DO SÊMEN 
 
EXAMES IMEDIATOS 
 
ANÁLISES MACROSCÓPICAS: 
- Volume = 20 a 80mL; 
- Cor = branco acinzentado; 
- Odor = “suis generis”; 
- Aspecto/densidade = aquoso/leitoso. 
 
ANÁLISES MICROSCÓPICAS: 
- Motilidade = 0-100%; 
- Vigor = 0-5. 
 
EXAMES MEDIATOS 
 
- Concentração espermática; 
- Patologia espermática; 
- Provas laboratoriais de integridade de membrana > 
geralmente tem relação com motilidade; 
- Manipular sempre em placa aquecida à T biológica (37°C). 
 
MEIOS DILUENTES 
 
TIPOS DE DILUENTE E TAXA DE DILUIÇÃO: 
- Diluente (Merk; Kenney; Cream Gel; Skim Milk Gel; Glycine 
Egg Yolk; INRA-96; Botu-Sêmen) > leite desnatado (fonte de 
energia) e antibiótico (inibe proliferação de bactérias); 
- Preserva a longevidade espermática; 
- Neutraliza efeitos deletérios do plasma seminal > ao diluir, 
diminui esses efeitos; 
- Reduz contaminação bacteriana; 
- Ajuda a impedir choques térmicos pelo frio. 
DILUIÇÃO E CONSERVAÇÃO DO SÊMEN 
 
FRESCO NÃO DILUÍDO: 
- Até 2h. 
 
FRESCO DILUÍDO: 
- Até 8h; 
- 1:1 ou 1:2 > recomendação é que a diluição seja de 25 a 50 
milhões de sptz/mL. 
 
DILUÍDO E RESFRIADO: 
- De 12 a 48h após coleta; 
- 1:2 até 1:10; 
- Taxa de resfriamento: 0,3°C/min. 5 a 8°C. 
 
CONGELADO: 
- Sêmen com grande volume e baixa concentração 
espermática; 
- Centrifugação; 
- Pellets, ampolas, macrotubos, microtubos (palhetas). 
 
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL 
 
VANTAGENS 
 
- Maior número de fêmeas por macho através do 
fracionamento do ejaculado; 
- Menor risco para o garanhão e éguas > acidentes na monta 
natural; 
- Útil para animais inaptos para monta natural; 
- Melhor controle reprodutivo de machos e fêmeas; 
- Maior facilidade de transporte > animal x dose de sêmen; 
- Diminuição dos riscos em acidentes de transporte; 
- Conforto e bem-estar animal. 
 
DESVANTAGENS 
 
- Execução incorreta: 
Redução drástica das taxas de prenhez; 
Pode aumentar incidência de endometrite pós-IA; 
- Custo adicional > para colheita e processamento do sêmen; 
- Disseminação de genes indesejáveis; 
- Fraudes > deve-se fazer o controle pela tipificação 
sanguínea ou teste de DNA. 
 
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN 
 
CÉLULA ESPERMÁTICA 
 
- Célula altamente especializada para a função de fertilizar o 
ovócito; 
- Haploide; 
- Capacidade limitada de reparação > se sofre algum dano, 
provavelmente irá morrer. 
 
 
- Membranas da cabeça do espermatozoide > membrana 
plasmática, membrana acrossomal externa (próxima à 
membrana plasmática), membrana acrossomal interna 
(próxima ao núcleo), envelope nuclear externo e envelope 
nuclear interno > 5 membranas ao todo; 
- Outras estruturas > centríolo, fibras densas, mitocôndrias, 
axonema etc.; 
- Cada uma dessas partes pode sofrer lesão no processo de 
congelação. 
 
BREVE HISTÓRICO 
 
LAZZARO SPALLANZANI: 
- Primeira tentativa de congelação em 1176; 
- No início do século XX houve a popularização da IA; 
- Descoberta dos efeitos da gema de ovo na minimização do 
choque térmico pelo frio; 
- Polge (1949) > efeitos crioprotetores do glicerol. 
 
ERNEST POLGE: 
- Descoberta acidental do efeito crioprotetor do glicerol; 
- 15% de glicerol a -79°C ou -192°C; 
- 1950 – congelação do sêmen bovino e caprino; 
- 1951 – primeiro bezerro nascido a partir de sêmen 
congelado; 
- Uso do nitrogênio líquido/botijões criogênicos. 
 
- Primeiras congelações eram em ampolas de vidro; 
- Cassou adaptou um tubo de papel celofane parafinado: 
→ Tubo plástico; 
→ Acetato de celulosa 1,2mL (1964); 
→ Policloreto 0,5 e 0,25mL. 
- Primeiras pipetas de inseminação eram de vidro. 
 
EQUINOS: 
- Primeira prenhez com sêmen congelado em 1957; 
- 10% de glicerol > tóxico para células; 
- Sêmen de epidídimo (Barker e Gandier). 
 
- Intenção de congelar o sêmen é manter a célula em um 
estado de quiescência(parada) sem gastar energia > 
durabilidade do sêmen congelado é indeterminada. 
 
 
 
 
 
BOVINO VS. EQUINO 
 
- Bovino > sêmen congelado; 
- Equino > sêmen refrigerado. 
- Diferenças na fisiologia da reprodução; 
- Diferença no método de seleção dos reprodutores; 
- Diferença na decisão de quando congelar. 
 
DESVANTAGENS NO USO DO SÊMEN CONGELADO 
 
- Mão de obra qualificada; 
- Custos (equinos, suínos); 
- Diminuição dos índices reprodutivos. 
 
 BOVINO SUÍNO EQUINO 
Nº de IA 4,6 x 106 5,4 x 106 0,04 x 106 
% de fêmeas inseminadas 82 > 90 82 
% de IA com sêmen congelado 100 0 2,4 
 
PRINCÍPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO ESPERMÁTICA 
 
PARA O SUCESSO NA CRIOPRESERVAÇÃO: 
- Contato do sêmen com um meio apropriado > deve 
diminuir metabolismo, proteger contra o frio e diminuir 
contaminação com antibióticos; 
- Remover plasma seminal – algumas espécies (equino) > 
plasma se torna deletério no processo de congelação; 
- Interação adequada entre a célula e o meio > osmolaridade 
adequada; 
- Respeitar a curva de diminuição de temperatura; 
- Respeitar da curva de descongelação. 
 
Bovinos: 
- Coleta o sêmen > dilui > no bovino, cada palheta é uma dose 
inseminante > resfria o sêmen por 4 a 5 horas em torno de 
5°C para que haja troca da célula com o meio > congelação. 
 
Equinos: 
- Coleta > retira plasma seminal > diluição > resfria > congela. 
 
- Morfologia espermática em nível aceitável > defeitos 
maiores e menores; 
- Metabolismo para a produção de energia > geralmente está 
no plasma seminal; 
- Motilidade progressiva (após o descongelamento); 
- Capacidade de adquirir motilidade hiperativada > 
capacitação espermática; 
- Acrossoma intacto. 
 
Membrana lipídica: 
- Estabilidade da membrana; 
- Atividade da enzima flipase; 
- Fusão das membranas no momento certo. 
 
Proteínas na membrana plasmática: 
- Sobrevivência no ambiente uterino; 
- Ligação com o ovócito. 
 
- Falta de um desses quesitos diminui drasticamente a 
fertilidade. 
 
MEMBRANA PLASMÁTICA 
 
- Varia de acordo com o tipo de célula; 
- Define os limites celulares; 
- Mantém as diferenças existentes entre o meio citosólico 
(intracelular) e o meio extracelular; 
- Contém uma bicamada lipídica unida por ligações não 
covalentes (ligações fracas). 
 
LIPÍDEOS: 
- Responsáveis pela integridade estrutural das células > 
bicamada lipídica; 
- Fosfolipídeos: 
→ Grupamento polar (hidrofílico); 
→ Amina; 
→ Fosfato; 
→ Glicerol; 
→ 2 AG > 1 insaturado (cauda reta) e 1 saturado 
(cauda dobrada). 
- Glicolipídeos; 
- Colesterol. 
 
PROTEÍNAS: 
- Responsáveis pelos processos dinâmicos; 
- Agem como receptores, enzimas, bombas iônicas e 
transdutores de energia. 
 
- Em volta da célula espermática há o glicocálice; 
- Crioprotetor extracelular utilizado fica adsorvido à célula 
espermática, funcionando como se fosse um glicocálice. 
 
FLUIDEZ DA MEMBRANA: 
- Membrana precisa der maleável, pois se for rígida, ao 
esfriar, pode se romper; 
- Se adapta ao formato dos cristais de gelo dentro da célula 
> tem um melhor resultado no congelamento. 
 
Influenciada pela: 
- Composição lipídica: 
→ Muito ácido graxo saturado (reto) = mais rígido; 
→ Muito ácido graxo insaturado = mais flexível. 
- Comprimento das cadeias carbônicas; 
- Grau de insaturação dos ácidos graxos; 
- Quantidade de colesterol; 
- Relação colesterol:fosfolipídios. 
 
- Maior rigidez = maior sensibilidade ao estresse osmótico; 
- Maior flexibilidade = maior resistência aos processos de 
congelação e descongelação. 
 
Colesterol: 
- Efeito estabilizador na MP; 
- Interfere na temperatura da transição de fase; 
- Encontra-se próximo às caudas hidrocarbonadas dos FFL; 
- Reduz a formação da fase hexagonal tipo II; 
- Diminui efeitos deletérios da congelação; 
- Aumenta proporção colesterol:fosfolipídeos; 
- Aumenta tolerância osmótica; 
- Aumenta permeabilidade a crioprotetores; 
- Aumenta longevidade do espermatozoide; 
- Na fecundação, diminui a taxa de prenhez > membrana fica 
muito estável e não tem reação do acrossoma. 
DIFUSÃO ATRAVÉS DA MEMBRANA: 
 
Solutos: 
- Sais; 
- Proteínas; 
- Açúcares; 
- Outras moléculas. 
 
- Teste de integridade de membrana > coloca a célula em 
meio hiposmótico > se cauda estiver dobrada, membrana 
fica íntegra > se cauda fica reta, membrana está rompida. 
 
Algumas substâncias funcionam tanto como soluto quanto 
como solvente: 
- Crioprotetores permeáveis (internos): 
→ Glicerol; 
→ Etilenoglicol; 
→ Amidas > Metilformamida e Dimetilformamida. 
 
 
G = Glicerol > soluto. Célula perde água para tentar se estabilizar. 
 
 
Ao perder água para tentar se estabilizar, perde volume. 
 
 
Logo após, aumenta de volume novamente e glicerol entra na 
célula para tentar estabilizar o meio. É esse glicerol que impede 
formação de cristais de gelo dentro da célula. 
 
EFEITO DA REFRIGERAÇÃO NA CÉLULA 
ESPERMÁTICA 
 
- Desaceleração da movimentação lateral dos lipídeos > 
aproximação dos ácidos graxos; 
- Transição de fase entre o estado líquido cristalino e o 
estado gel > entre 19 e 8°C; 
- Maior susceptibilidade ao choque térmico pelo frio > 
ruptura da MP; 
- Perda da motilidade. 
 
 
 
- Fosfolipídeos tem movimento de rotação no mesmo eixo; 
- Pode acontecer a inversão dos ácidos graxos (flip flap) > 
fosfolipídeos com predileção pelo meio extracelular e intracelular > 
ao congelar a célula, é normal ocorrer a inversão; 
- Inversão deve acontecer quando o espermatozoide chega 
próximo ao ovócito > aumenta a permeabilidade de membrana > 
espermatozoide passa pelo processo de capacitação e reação do 
acrossoma; 
- Se inversão acontece antes, célula se torna inviável, rompe a 
membrana e pode se perder > deve acontecer de forma controlada. 
 
- Diminuição do metabolismo; 
- Cada 10°C de redução de temperatura > diminuição de 50% 
do metabolismo: 
→ 15°C > 25% da capacidade metabólica; 
→ 5°C > 8% da capacidade metabólica. 
 
 
Meio equilibrado com células espermáticas e soluto, sem congelar. 
 
 
Ao congelar, soluto começa a se concentrar. Meio se torna hiper-
osmótico. Célula perde mais água. 
 
CRIOPROTETORES 
 
EXTERNOS: 
- Lactose; 
- Gema de ovo > LDL. 
 
- Responsáveis por atuar no compartimento extracelular; 
- Causa desidratação da célula > impedem a formação de 
cristais de gelo intracelular; 
- Os mecanismos não estão totalmente elucidados. 
 
- Interagem e estabilizam a MP; 
- LDL forma um “filme” protetor > reposição de FFL perdidos 
no processo; 
- Fosfatidilcolina da soja > mesmo efeito da fosfatidilcolina 
da gema de ovo > não é incorporada na MP. 
 
 
PLASMA SEMINAL: 
- Substâncias que contribuem com a fertilização: 
→ Motilidade; 
→ Viabilidade; 
→ Capacitação espermática. 
 
Substâncias que não contribuem diretamente com a 
fertilização: 
- Fatores decapacitantes; 
- Fatores que inibem a motilidade > por isso, se retira o 
plasma seminal do sêmen de equinos. 
 
BSP: 
- Ligam-se aos fosfolipídeos da MP > potencializam a 
capacitação (não deve ser capacitado antes da hora); 
- LDL (da gema de ovo) é interessante > previne o 
efluxo/saída de fosfolipídeos e colesterol da MP > dá maior 
viabilidade às células; 
- HDL não é interessante > estimula saída/efluxo de 
fosfolipídeos e colesterol da MP. 
 
PROTEÇÃO DADA PELO LEITE: 
- Leite desnatado não difere do leite total em termos de 
proteção > logo, lipídeos do leite não são responsáveis pela 
proteção; 
- Fatores envolvidos: 
→ Micela de caseína + glicerol; 
→ Lactose > atua como coadjuvante. 
 
AÇÚCARES: 
- Substrato energético; 
- Atuam na pressão osmótica do meio > diminui injúrias pela 
cristalização do gelo; 
- Interação direta com a MP > grupo hidroxil do açúcar se liga 
com o grupo fosfato dos fosfolipídeos; 
- Inibe a fusão das membranas; 
- Manutenção dos lipídeos na fase fluida; 
- Dissacarídeos atuam melhor que monossacarídeos. 
 
VANTAGENS DO SÊMEN CONGELADO 
 
- Programas de melhoramento genético; 
- Importação e exportação de material genético > difusão; 
- Seleção de reprodutores geneticamente superiores; 
- Permite a participação de reprodutoresem eventos; 
- Seguro biológico reprodutor; 
- Transporte a longas distâncias com baixo custo; 
- Preservação por tempo indefinido; 
- Manutenção do bem-estar animal. 
 
DESVANTAGENS DO SÊMEN CONGELADO 
 
- Resistência a congelação – tolerância > ~ 30% de garanhões 
com boa resistência; 
- Variação entre: 
→ Raças; 
→ Indivíduos; 
→ Ejaculados. 
- Menores taxas de prenhez; 
- Custo > infraestrutura, equipamentos, congelação e IA; 
- Baixo número de doses/ejaculado > equinos > 2 a 10 
doses/ejaculado. 
ETAPAS DA CRIOPRESERVAÇÃO 
 
- Colheita do sêmen > vagina artificial; 
- Avaliação > motilidade, vigor, concentração, % stpz viáveis; 
- Cálculo de diluição > nº de espermatozoides viáveis por 
palheta > varia conforme a espécie; 
- Diluição; 
- Identificação e envase das palhetas: 
→ No sêmen de garanhão deve-se fazer centrifugação 
para retirar o plasma seminal. 
- Equilíbrio > tempo varia conforme espécie; 
- Congelação; 
- Armazenamento em botijão de nitrogênio líquido; 
- Descongelação. 
 
PROCEDIMENTO DE CONGELAÇÃO – GARANHÃO: 
 
Colheita de sêmen: 
- Volume livre-gel; 
- Concentração; 
- % móveis. 
 
Centrifugação: 
- Diluir 1:1; 
- Diluente centrifugação sem crioprotetor. 
 
Ressuspensão: 
- Diluente congelação com crioprotetor. 
 
Envase: 
- Identificação. 
 
Refrigeração: 
- 5°C/20 minutos. 
 
Vapor nitrogênio: 
- 20 minutos – 6cm N2 líquido. 
 
ESTOCAGEM DO BOTIJÃO CRIOGÊNICO 
 
- Botijão sempre cheio de nitrogênio; 
- Não deixar baixar da metade no nível de nitrogênio; 
- Geralmente > 30 cm de N2; 
- Nível mínimo de 15 a 16cm. 
 
DESCONGELAÇÃO 
 
- Não erguer muito a caneca ao manipular > não retira 
totalmente a caneca para não ter total contato com a 
temperatura do meio externo. 
 
- Palhetas de 0,5ml; 
- 37°C por 30 segundos; 
- 46°C por 20 segundos. 
 
- Seca, corta uma ponta, vira a ponta para o tubo de 
Eppendorf e corta a outra ponta para cair. 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DO SÊMEN PÓS-DESCONGELAÇÃO 
 
- Descongelar uma palheta; 
- Secar cuidadosamente; 
- Cortar a extremidade que foi lacrada; 
- Colocar a palheta dentro do tubete; 
- Cortar a extremidade da bucha > o sêmen escoará; 
- Adicionar diluente > aguardar ~ 10 minutos; 
- Avaliar – motilidade maior ou igual a 30% > bovinos e 
equinos. 
 
TIPOS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL 
 
- Sêmen fresco; 
- Sêmen refrigerado: 
→ 15°C; 
→ 5°C. 
- Sêmen congelado. 
 
 
DIFICULDADES DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL 
 
- Mão de obra especializada; 
- Estrutura física; 
- Laboratório; 
- Controle folicular; 
- IA em dias alternados até o final do cio.