CRIOPRESERVAÇÃO E REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN

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CRIOPRESERVAÇÃO E REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN
terça-feira, 3 de novembro de 2020
15:22
Criopreservação: conserva o sêmen em uma temperatura extremamente fria -196ºC 
Refrigeração: mais usada em suínos e equinos, resfriar o sêmen a 5 ou 15ºC (suínos 15 e equino 15 ou 5), para diminuir o metabolismo espermático para que dure mais
 
Introdução
Criopreservação: conceito
Indicações (vantagens)
· Estocagem de material genético 
· Melhoramento animal
· Vantagens sanitárias
· Otimização de utilização dos reprodutores
· Aplicações terapêuticas
Espécies mais trabalhadas: bovinos em primeiro lugar, depois equinos e pequenos ruminantes
Oportunidade de realizar carne de mais qualidade (bovinos) 
Nelori - carcaça boa, bom dorso, prolifera número maior de descendentes, pelo benefício do melhoramento genético
Ovinos estão crescendo, apesar de mais difícil, carneiro vai muito bem a inseminação por via laparoscópica
 
Vantagens da criopreservação
Armazenamento de material genético comprovado a baixas temperaturas (-196ºC, sêmen fica em anabiose metabolismo zero) por períodos indeterminados
Utilização de animais excepcionais (com características desejáveis), mesmo após a perda da capacidade reprodutiva e ou morte
Seguro biológico do animal
Racionalização no uso de touros e garanhões nas estações de montas e aumento da relação égua/garanhão e touro/vaca
Facilidade do transporte de sêmen à grandes distâncias, além de menor custo em transporte do sêmen; aumento do número de fêmeas que possam criar de um macho em particular
 
Desvantagens
Sempre ligada a mão de obra
Para alguns machos que têm seu sêmen congelado, há diminuição da taxa de prenhez
A colheita de sêmen e a técnica de congelação precisam ser feitas por um pessoal treinado e especializado, o que inclui gastos adicionais; a perda de céls espermáticas devida a manipulação nas etapas, que vão desde a colheita até o descongelamento
Exclusão de indivíduos que não se obtém sucesso na criopreservação
Céls espermática passa por injúrias (crioinjúrias), danos que são irreversíveis, que leva diminuição da fertilidade. Quando ajusta as contas para saber quantos spz, considera que do número de spz congelados, quando descongelar perde metade
Realizar um exame andrológico primeiro para verificar danos, para que congele um sêmen de boa qualidade, com spz viáveis, de todos os parâmetros vivos (motilidade, vigor, turbilhonamento) e morfologicamente perfeitos
 
Princípios da criopreservação
Anabiose
· Diminuição da temperatura
· Conservação
Retomada do metabolismos e crioinjúria (não inviabilizem os sptz)
· Integridade da membranas
· Acrossoma
· Potencial de mitocôndrias
· Estresse oxidativo e fragmentação do DNA
 
Mecanismos de crioinjúria
Choque frio
Resfriamento: temp abaixo da corpórea (até 5ºC)
Composição das membranas biológicas
· Mudança da fase dos lipídios
· Alteração dos domínios de membrana (leva a condição não fisiológica) e fisiologia
· Morte celular 
· Estresse oxidativo
· Susceptibilidade individual - cada reprodutor tem uma susceptibilidade individual
 
 
 
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A membrana tem várias substâncias que tem temperaturas de congelamento. A hora que resfria, vai congelando fosfolipídios, glicolipídios, colesterol em temperaturas diferentes, para evitar isso, devo tentar fazer com que essas substâncias não formem o chamado domínio lipídico, que vai fazer com que tenha a diminuição de sobrevida do animal, pois causei dano na membrana espermática.
 
Domínio lipídico: Resfriamento abaixo da temperatura corporal, causa transição de fase dos lipídios de membrana, pois os diferentes lipídios tem diferentes temperaturas de transição. Isto leva a formação de "domínios' lipídicos. As proteínas também são excluídas dos domínios de gel, levadas a um ambiente não fisiológico, o que impede suas funções, como integridade estrutural e metabolismo de íons;
Bovinos é que mais fácil tem, pois tem muito mais colesterol nas membranas, o que facilita. Gema de ovo, leite desnatado (proteínas que facilitam congelabilidade)
 
Pegou sêmen, mistura o diluente e mantem na geladeira em tempos diferentes para cada espécie para que consiga proteger (cavalos 20 min, pq ruminantes 1h e meia, bovinos 4 h na dependência do diluente). Na primeira rampa que desce de 37 a 5ºC tem que esperar esse tempo para que diluente interaja e vá abaixando a temp.
A segunda rampa vai de -5 a -70 ou -120ºC (cavalo -70, bovinos -120). Sabemos que na temperatura -5 a 15-ºC a água se congela formando cristais de gelo, e essas formações danificam a céls, devemos preparar a céls pois depois que coloca no vapor de nitrogênio que baixa até -70 ou -120 tenho formação dos cristais de gelo, e quando formo esses cristais a água que congelam primeiro e dentro da água tem sais que farão com que a pressão osmótica do liquido que não congelou ainda (fração gelatinosa) perca mais água ainda, perdendo tanto líquido deformando a cél; desidratação da membrana (perda estabilidade e desnaturação de proteínas); deformação da céls (50% do vol original) e stress mecânico; altas [ ] de solutos e cristalização dos mesmos
 
 
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Gelo intracelular: causa danos à organelas e citoesqueleto/ruptura de membranas
Gelo extracelular: "efeitos de solução"; desidratação - efluxo de água; reidratação: influxo muito rápido danifica os canais
 
*Diluente: Causo um dano, mas é um mal necessário para que preserve a cél pós resfriamento
 
Crioprotetores
Alta proteção contra injúria
Baixa toxicidade
Baixa imunogenicidade: IA fêmeas/endometrites
Diminuição do ponto de solidificação
Intracelulares (diminuir os cristais de gelo)
· Glicerol (bovinos) amplamente utilizado, indispensável
· Etilenoglicol (embrião), penetração mais rápida
· Dimetilsulfóxido (DMSO) solvente/sêmen de coelho
· 1,2 propanodiol
· Dimetil formamide: utilização com sucesso em garanhões maus-congeladores
Extracelulares (alimento, faz com que entrada seja mais lenta e mantém sptz tamanho original)
· Açúcares: rafinose, trealose, lactose e frutose - diminuição dos efeitos da solução, fornecimento de substrato para o metabolismo energético do sptz
· Proteínas e lipoproteínas - gema de ovo, leite e soro: estabilização de membranas, proteção contra o choque frio
· Detergentes de membrana: Equex, orvus és paste, Lauril-éter-sulfato de sódio (ODD neutro) - emulsão de gorduras: melhor disponibilidade de componentes da gema do ovo para as céls
 
Tampões - controle o pH
· Bicarbonato de sódio
· Lactato de sódio
· Citrato de sódio
· Fosfato de sódio
· TRIS - hidroximetil-amino-metano
· TES - C6H15NO6S
pH - 6,99 ± 0,02
Osmolaridade - 300 mOsm
 
Antibacterianos
· Penicilina
· Estreptomicina
· Ticarcilina
· Kanamicina
· Sulfanilamida
· Gentamicina
· Polimixina B
 
Meios para criopreservação
· O que devem conter
pH e osmolaridade controlados
Sistema tampão
Nutrientes
Atb
Crioprotetores intra e extracelulares
Antioxidantes 
· Exemplos meios-base
Tris-gema-citrato/frutose
Glicina-gema-leite
Kenney
 
 
 
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Por possuir no plasma seminal lecitinase, não tem gema de ovo, uso o leite desnatado. Caso queira usar diluente a base de gema de ovo, tem que centrifugar o ejaculado para tirar o plasma seminal
 
 
 
Recorte de tela efetuado: 14/11/2020 11:29
 
· Uma fração
Concentração única de crioprotetor
Praticidade
· Duas frações
Frações A e B
Fração B: dobro da [ ] de crioprotetor. Adicionado a 5ºC
Vantagens - potencialmente
Desvantagens - trabalhoso, fazer diluente fração A com mesma composição fração B menos o crioprotetor
 
 
 
Recorte de tela efetuado: 14/11/2020 11:32
Quanto mais sêmen coloco, menor a concentração
 
· Comerciais
Garantias
Partidas homogêneas, resultadostambém
· "caseiros"
Precisão no aviamento
Qualidade dos componentes
Variação entre partidas e resultados
 
Procedimentos para a congelação
Colheita do sêmen
· Lavagem de pênis/prepúcio
· Método de colheita: vagina artificial, manipulaçãp digital, eletroejaculação (plasma seminal - dificulta congelabilidade) diluente 2 frações
Prepara material para envase (palhetas) e álcool poliminilico para lacrar as palhetas no final do processo
Avaliação do sêmen
· Concentração
· Morfologia
· Motilidade
· Vigor
· Testes funcionais
Processamento do ejaculado
· Remoção do plasma seminal:
Garanhões; cachaços; cães; bodes (lecitinase)
Protocolo: diluição 1:1/1:2, meio centrifugação: Kenney; 600G por 10min; desprezar sobrenadante; ressuspensão em meio para criopreservação (fração A ou única); pulo do gato: ressuspender em pouco meio e calcular [ ] para poder diluir corretamente
Cálculos
 
 
 
 
 
 
 
Diluição
· Vagarosa mesmo!
· Meio no sêmen, não sêmen no meio
· Homogeneização constante
· Realizada FORA DO BANHO MARIA: início da curva de resfriamento
Identificação das palhetas
· Nome do animal
· Raça 
· Data
· Partida
Identificação mecânica (nas centrais)
Envase manual - mais usado
Envase automático (nas centrais)
Resfriamento
· Da temp do banho até 5ºC
· Cuidado: choque frio!
· Geladeira x máquina de congelar
Curva rápida: -0,5ºC/min
Curva lenta: -0,25ºC/min
· Melhor curva: próx à -0,3ºC/min
· Estabilização: de 20 (equinos) min até 4h (bovinos) (depende da espécie e do animal)
Congelação
· Da 5ºC até -196º
· Cuidado: danos físicos
· Caixa de isopor x máquina de congelat
Curva rápida: -20ºC/min
Curva lenta: -10ºC/min
· Melhor curva: próxima à -20ºC/min
· Após atingir -70 (equinos) a -120ºC, imersão no N2
 
Avaliação pós descongelação
Duas palhetas de cada partida
Motilidade
Vigor
Teste de termorresistência
Testes funcionais
Descartar partidas fora de padrão
 
Descongelamento
Palheta 0,25mL (menores)
-37ºC/7 seg
Palheta de 0,5mL (maiores)
-37ºC/30 seg
-46ºC/20 seg