Aula Biotec Criopreservação

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12/09/2017
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Criopreservação de sêmen 
equino 
Antonio Hugo Bezerra Colombo
Sêmen congelado Porque congelar ?Porque congelar ?Porque congelar ?Porque congelar ?
• Preserva o material genético
• Minimiza propagação de doenças
• Elimina barreiras geográficas
O que acontece na congelação ?O que acontece na congelação ?O que acontece na congelação ?O que acontece na congelação ?
Meios diluidores Meios diluidores Meios diluidores Meios diluidores 
• Lipoproteínas e Macromoléculas
• Açúcares
• Substâncias Tamponantes
• Antibióticos
• Crioprotetores
• Aminoácidos, enzimas...
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Proporcionar proteção e manutenção 
dos espermatozoides durante 
congelação
Meios diluidores Meios diluidores Meios diluidores Meios diluidores 
• ANTIBIÓTICOS = Controle crescimento bacteriano
• CITRATO DE SÓDIO / CITRATO DE K+ = Tampões
• DETERGENTES (Orvus Est Paste) = Solubilização de
gorduras
• EDTA = Quelante (↓ influxo de Ca++ para dentro da
célula )
Meios diluidores Meios diluidores Meios diluidores Meios diluidores 
• AÇÚCARES = Energia e Crioproteção extracelular (glicose,
lactose, sacarose, rafinose, trealose)
• GEMA DE OVO / LEITE = interagem com MP Crioproteção
• GLICEROL+ AMIDAS = Crioprotetores intracelulares
CrioproteroresCrioproteroresCrioproteroresCrioproterores
CrioprotetoresCrioprotetoresCrioprotetoresCrioprotetores penetrantes penetrantes penetrantes penetrantes 
• Substâncias de baixo peso molecular
• Lipossolúveis
CrioprotetoresCrioprotetoresCrioprotetoresCrioprotetores penetrantes penetrantes penetrantes penetrantes 
• Atravessam membrana plasmática e atuam nos
meios intra e extracelulares
• Agem solvente e soluto
• Pressão osmótica- saída água das células
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CrioprotetoresCrioprotetoresCrioprotetoresCrioprotetores penetrantespenetrantespenetrantespenetrantes
• Amidas 
• Menor viscosidade das amidas favorece a permeabilidade
destes compostos à membrana plasmática
• Melhor cinética espermática e consequentemente maior
índice de fertilidade
CrioprotetoresCrioprotetoresCrioprotetoresCrioprotetores não penetrantesnão penetrantesnão penetrantesnão penetrantes
• Moléculas grandes que não atravessa membrana plasmática
• Agem como solutos e coloides propriedades
osmóticas afetam entrada e saída de água de
dentro e para fora das células
Problemas na congelaçãoProblemas na congelaçãoProblemas na congelaçãoProblemas na congelação????
• CHOQUE PELO FRIO LEVA A DANOS IRREVERSÍVEIS
CARACTERIZADOS POR:
• PADRÃO ANORMAL DE MOVIMENTO (CIRCULAR)
• PERDA RÁPIDA DE MOTILIDADE
• DANOS AO ACROSSOMA
• DANOS À MEMBRANA PLASMÁTICA
• METABOLISMO REDUZIDO
• PERDA DE COMPONENTES INTRACELULARES
Etapas do congelamento Etapas do congelamento Etapas do congelamento Etapas do congelamento 
1 Diluição 1 Diluição 1 Diluição 1 Diluição com meio a base decom meio a base decom meio a base decom meio a base de
leite leite leite leite desnatadodesnatadodesnatadodesnatado
• Diluição 1:1
2 Remoção 2 Remoção 2 Remoção 2 Remoção do plasma do plasma do plasma do plasma seminalseminalseminalseminal
• Particularidade em equinos
• Plasma seminal é produzido pela rede testis,
epidídimo e glândulas acesserória
• No ejaculado equino há grande quantidade plasma
seminal, sendo necessário removê-los antes da
criopreservação
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Centrifugação Centrifugação Centrifugação Centrifugação 
http://www.endmemo.com/bio/grpm.php
Centrifugação Centrifugação Centrifugação Centrifugação 
• A centrifugação pode ser deletéria aos
espermatozoides de alguns garanhões
• Reduzindo a sua qualidade, longevidade e
consequentemente fertilidade
• Danos mecânico
• Empacotamento de espermatozoides
• Perioxidação da membrana
CentrifugaçãoCentrifugaçãoCentrifugaçãoCentrifugação
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Centrifugação com Centrifugação com Centrifugação com Centrifugação com cushioncushioncushioncushion
FiltragemFiltragemFiltragemFiltragem
Adição do meio Adição do meio Adição do meio Adição do meio diluentediluentediluentediluente
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Número de Número de Número de Número de espermatozoidesespermatozoidesespermatozoidesespermatozoides
Cálculo Cálculo Cálculo Cálculo 
• Diluição inicial 1:1 (sêmen x Botu sêmen) 30 a 50 x 106
/sptz/ml
• Volume do ejaculado 80ml
• Adicionar 80ml de Botu sêmen
• Solução total de 160ml
• N SPTZ: contados 5 quadrados: 45 em uma diluição de 1:20
significa que essa solução esta com 45 x 106 sptz/ml
• Reavaliar após a centrifugação
• Diluição inicial 1:1 (sêmen x Botu sêmen) acima de 50 x 106
/sptz/ml
• Volume do ejaculado 80ml
• Adicionar 80ml de Botu sêmen
• Solução total de 160ml
• N SPTZ: contados 5 quadrados: 60 em uma diluição de 1:20
significa que essa solução esta com 60 x 106 sptz/ml
• 160 x 60 x 106 = 9600 x 106
• 9600 x 106 / 50 x 106 = 192ml
• 192 – 160 = 32ml de Botu sêmen para ser adicionado a solução
• Solução total de 192ml com 50 x 106 sptz/ml
• Exercício 01
• Garanhão Quarto de Milha
• VOL: 160 ml 1:1 (sêmen x Botu sêmen) 
• MOT: 85
• VIG: 4 
• N SPTZ: contados 5 quadrados: 45
• Diluição: 20
• Concentração (100 x 106 sptz viáveis), palheta 0,5ml
•Sêmen fresco
45 x 106 sptz/ml
45 x 106 x 160 = 7200 x 106 sptz/totais 
7200 x 106 x 0,85 = 6120 x 106 sptz/ viáveis
6120 x 106 / 100 x 106 = 61,2 palhetas 
61,2 x 0,5 = 30,6 volume diluidor 
•Sêmen centrifugado 
Reconstituição 20ml de Botu crio 
N SPTZ: contados 5 quadrados: 300 em uma diluição de 
1:20 significa que essa solução esta com 300 x 106 sptz/ml
300 x 106 x 20 = 6000 x 106 sptz/totais 
6000 x 106 x 0,85 = 5100 x 106 sptz/viáveis
5100 x 106 / 100 x 106 = 51 palhetas 
51 x 0,5 = 25,5 volume diluidor 
25,5 – 20 = 5,5 de Botu crio para ser adicionado a 
solução
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Envase da palheta Envase da palheta Envase da palheta Envase da palheta 
Lacrar a palhetaLacrar a palhetaLacrar a palhetaLacrar a palheta
Refrigerar a 5°C
• 20 minutos 
Curva de congelamento Curva de congelamento Curva de congelamento Curva de congelamento 
• 5°C a -40°C
• 15 minutos no vapor de nitrogênio, após é mergulhado
(-196°C)
Descongelamento Descongelamento Descongelamento Descongelamento • Avaliação da concentração da palheta após descongelamento
Dentro de cada palheta com volume de 0,5ml deve conter 100 x 
106 sptz/viáveis
100 x 106 / 0,85 = 117,64 x 106 sptz/totais /palheta
117,64 x 106 x 2 = 235,29 x 106 sptz/ml
Na contagem da Câmara de Neubauer devem ser contado um 
numero aproximado de 235 espermatozoides para confirmar a 
concentração real da palheta 
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Armazenamento Armazenamento Armazenamento Armazenamento Problema Problema Problema Problema 
• Curva e meio inadequado
• Baixa quantidade de crioprotetor por célula espermática
• Baixa resistência espermática a criopreservação
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