Análise de Insumos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FR508- Análise Instrumental
Prof. Paulo Rosa
Experimento 1: ANÁLISE DE INSUMOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
07/Abril/2015
Grupo:
Aline Amorim 						RA:141450
Anna Paula Lourenço Costa 							RA: 140502
Bianca Faccioli Ehmke 					 	 	RA: 138085
Gabriela Galhardo De Vito 							RA: 139466
Ingrid Vaz 						RA: 141514
Marina Borges 						RA:141550
Paola Collazos Pantoja 						RA: 141766
Raisa Rafaela Gusmão 		 				RA: 139725
Tamires Cristine Blanco 						RA: 118730
Tatiane Cândido 						RA: 140940
ÍNDICE
INTRODUÇÃO……………………………………………………………..……………………...… 02
OBJETIVO…………………………………………………………………..………………………...04
PARTE EXPERIMENTAL……………………………………………………..………………….....04
RESULTADOS E DISCUSSÃO………………………………………………………...…………..07
CONCLUSÃO……………………………………………………………………………………12
REFERÊNCIA…………………………………………………………………………………12
Introdução
A cromatografia é um método físico-químico de separação, fundamentada na migração diferencial de componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias torna o método extremamente versátil e de grande aplicação [1].
Historicamente, a técnica cromatográfica foi descoberta pelo russo Mikhail Semenovich enquanto este desenvolvia pesquisas no campos da botânica. Este pesquisador separou pigmentos de plantas a partir de uma coluna de absorção líquida contendo carbonato de cálcio. 
Nos anos seguintes, a técnica foi demonstrada em diversos congressos e conferências na Europa, mas precisamente na Alemanha. No começo da década de 50, o prêmio Nobel de Química foi conquistado por Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge com a invenção de cromatografia de partição.
A riqueza na obtenção dos resultados cromatográficos só foi possível após a década de 70, com a revolução tecnológica e científica que se iniciou nessa época. Assim, a técnica pôde ser modernizada e aplicada nas mais diversas áreas de pesquisa e análise. 
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. 
As técnicas cromatográficas podem ser classificadas de acordo com alguns aspectos, são estes: modo de separação, fase estacionária, fase móvel e sistema cromatográfico.
À partir da classificação da fase móvel, destacamos a Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE - ou, em inglês, HPLC - High Performance Liquid Chromatography), por ser mais amplamente utilizada nas indústrias farmacêuticas, químicas e alimentícias. O grande uso desta técnica é proveniente da eficiência, alta resolução e sensibilidade na separação de espécies de mistura complexas, fornecendo ricos resultados tanto quantitativos quanto qualitativos.
Como técnica de CLAE/HPLC é classificada de acordo com a fase móvel, o solvente deve se enquadrar em algumas características desse método de análise. A principal delas é que, ao mesmo tempo que a fase móvel necessita dissolver a amostra a ser analisada, ambas as fases não podem possuir nenhuma interação química. Esta fase também deve apresentar alto grau pureza para que seja possível uma alta sensibilidade pelo aparelho de UV, pois caso contrário as impurezas podem interferir na detecção da amostra .
Nas últimas décadas, houve um desenvolvimento de detectores que são utilizados na técnica de CLAE/HPLC. Um detector ideal deve possuir alta sensibilidade, baixo limite de detecção, resposta rápida a todos os solutos, insensibilidade a variações de temperatura e na vazão da fase móvel, resposta independente da fase móvel, baixa contribuição ao alargamento do pico, segurança e conveniência para uso e informação qualitativa do pico desejado. Dentre os detectores mais usados nesta técnica estão: o espectrofotométro UV-VIS, o de fluorescência e o refratométrico.
Os detectores espectrofotométros UV-VIS baseiam-se na absorbância da luz pela amostra quando esta passa pelo detector. Existem dois detectores desse tipo, são eles: Fotométricos (comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm) e Espectrofotométricos (comprimento de onda variável: 00nm a190nm). [2]
 Este tipo de detector apresenta certo grau de seletividade, pois só detecta compostos que absorvem o comprimento de onda em que o detector foi ajustado. É o mais utilizado, pois a maioria das substâncias absorvem a radiação UV. Algumas dessas substâncias são: olefinas, aromáticos, compostos contendo ligações C=O, C=S, N=O. As análises feitas estão na ordem de nanogramas.
Já os detectores de fluorescência são utilizadas em detecções específicas. A emissão fluorescente é produzida a partir da excitação com luz. Este métodos também é seletivo e reliza análises na ordem de picograma. 
Os detectores de índice de refração analisam a ocorrência de uma alteração de índice de refração quando o analito passa pelo detector [2]. Essa alteração em relação ao valor da fase móvel livre de analito é detectada. Essa detecção só é possível caso o índice de refração do analito é diferente do IR da fase móvel. Esse detector é normalmente utilizado quando os analitos não absorvem na região de comprimento de onda do UV-VIS. 
Atualmente, os detectores não são versáteis e não apresentam todas as propriedades desejadas. No entanto, existem detectores que oferecem ampla faixa de aplicações e não acarretam danos à analise por CLAE.
O paracetamol é um medicamento extremamente utilizado como antipirético e antitérmico e se constitui na terapia de escolha para pacientes sensíveis a aspirina, por não irritar a mucosa estomacal quando administrada em doses inferiores a máxima recomendada. As determinações dessa substância farmacêutica, tanto em fluidos biológicos como em medicamentos têm sido realizadas através de diferentes procedimentos. As metodologias recomendadas pelas farmacopéias para o controle da qualidade do paracetamol e de seus produtos, são a espectrofotometria no UV-VIS, para a avaliação da matéria-prima, e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção espectrofotométrica ou eletroquímica para análise de preparações medicamentosas. [4]
Objetivo
Realizar diluições e utilizar a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) como ferramenta de quantificação, bem como de análise quantitativa em uma amostra (identificação e determinação do teor de paracetamol com lactose).
Parte Experimental
O diluente utilizado na preparação das amostras para a curva de calibração já havia sido preparado sendo composto por água e metanol (grau HPLC) na proporção 75:25 v/v.
A fase móvel utilizada no HPLC também já havia sido preparada sendo composta por água e metanol (grau HPLC) na proporção 50:50 v/v. Posteriormente foi filtrado em membrana 0,45 mm com a utilização de uma bomba a vácuo para filtrar e, por fim, foi desgaseificado.
· Preparação dos padrões para a curva de calibração
A solução padrão estoque foi preparada a partir de uma solução estoque de padrão de paracetamol de concentração 1 mg/mL. Foi realizada uma diluição dessa solução colocando 5,0 mL da mesma em balão volumétrico de 50,0 mL e o volume foi completado com a solução diluente composta por água e metanol (75:25). Dessa forma, a concentração dessa solução é 0,1 mg/mL.
Os cinco padrões utilizados para compor os pontos da curva de calibração foram preparados pipetando diferentes alíquotas conforme a tabela abaixo e completando o balão volumétrico de 10,0 mL com o mesmo diluente.
Tabela 1. Diluição para a curva analítica de calibração do paracetamol
	Alíquota(mL)
	Balão (mL)
	Concentração final (mg/mL)
	0,5
	10,0
	0,005
	0,8
	10,0
	0,008
	0,9
	10,0
	0,009
	1,0
	10,0
	0,010
	1,2
	10,0
	0,012
· Preparação das amostras a serem analisadas
Amostra 1: Foi pesado cerca de 25 mg de paracetamol e 25 mg de lactose com exatidão para manter a proporção de 1:1. As massas foram transferidas para um balão volumétrico de 50,0 mL, adicionou-se 30,0 mL da solução diluente composta por água e metanol (75:25) e foi deixado no ultra-som por 5 minutos para que fosse completada a dissolução dos compostos com eventuais agitações manuais. O volume do balão volumétrico foi completado com o mesmo diluente. Em seguida, foi pipetado uma alíquota de 0,5 mL desta solução em um balão volumétrico de 50,0 mL, diluído e completado o volume com o diluente. A solução obtida foi filtrada em membrana de 0,45 mm apropriada para tal situação. Por fim, pegou-se uma alíquota de 0,020 mL, colocou-se em um balão volumétrico de 1,0 mL e completou-se o volume. A preparação foi realizada em duplicata.
Amostra 2: Foi pesado cerca de 12,5 mg de paracetamol e 37,5 mg de lactose com exatidão para manter a proporção de 1:3. As massas foram transferidas para um balão volumétrico de 50 mL, adicionou-se 30,0 mL de solução diluente e foi deixado no ultra-som por 5 minutos para que fosse completada a dissolução dos compostos com eventuais agitações manuais. O volume do balão volumétrico foi completado com o mesmo diluente. Em seguida, foi pipetado uma alíquota de 0,5 mL desta solução em um balão volumétrico de 50,0 mL, diluído e completado o volume com o diluente. A solução obtida foi filtrada em membrana de 0,45 mm apropriada para tal situação. Por fim, pegou-se uma alíquota de 0,040 mL, colocou-se em um balão volumétrico de 1,0 mL e completou-se o volume. A preparação foi realizada em duplicata.
· Procedimento
	O equipamento de UPLC teve suas funções ajustadas de acordo com os parâmetros necessários para a análise do composto paracetamol. Antes de injetar as amostras e padrões, a bomba foi ligada para que a fase móvel se distribuísse pela coluna cromatográfica. Aguardou-se alguns minutos até que a linha de base do cromatograma não demostrasse mais sinais de ruído. E então, deu-se ínício às injeções. As soluções amostras e soluções padrão de trabalho preparados, filtrados e colocados no vail foram coletados com seringa, verificamos a presença de bolhas, e então colocamos no injetor, primeiramente os padrões, do menos concentrado para o mais concentrado, em torno de 1 mililitro. A chave do injetor deve estar acionada no modo Load no momento da injeção do padrão e da amostra, e quando colocada em modo Inject a amostra é eluida pela fase móvel em direção a coluna cromatográfica e depois ao detector, onde então é quantificada.
	A partir das áreas obtidas, construímos uma curva de calibração, fizemos uma regressão linear e obtivemos a equação da reta para o composto paracetamol. Então, foi calculado a partir da calibração externa de um ponto e equação da reta, a concentração do paracetamol no medicamento. Comparamos os dois resultados obtidos e calculamos os parâmetros cromatográficos: número de pratos, fator de retenção e assimetria.
Tabela 2. Condições cromatográficas : UPLC Waters
	coluna
	C18 1000x4,6 mm, partícula 5 micrômetros
	temperatura
	ambiente
	detecção
	246 nm
	volume de injeção
	10 L
	vazão
	0,7 mL/min
	
Parâmetros de separação: - número de pratos ( maior que 2000) , assimetria ( entre 0,8 e 2,0) , fator de retenção ( maior que 2,0).
Resultados e Discussão
Para validar o método analítico, após definidas as condições de análise, construiu-se uma curva de calibração do Paracetamol a partir das áreas dos picos nos cromatogramas obtidos (anexos 1, 2, 3, 4 e 5) e indicadas na tabela 3 para este medicamento após as injeções das soluções metanólicas de concentrações de 0,005mg/mL a 1,2mg/mL. A obtenção desta curva de calibração tem como finalidade determinar a concentração do Paracetamol presente nas amostras analisadas contendo este medicamento.
Tabela 3. Diluição para curva analítica do paracetamol e respectivas áreas
	Alíquota (mL)
	Balão (mL)
	Concentração (mg/mL)
	Área
	0,5
	10
	0,005
	290371
	0,8
	10
	0,008
	488665
	0,9
	10
	0,009
	532843
	1
	10
	0,01
	596154
	1,2
	10
	0,012
	712326
	
 Figura 1. Curva de Calibração do Paracetamol
A linearidade do sistema cromatográfico para o Paracetamol foi verificada nas condições cromatográficas estabelecidas, a partir da curva de calibração construída na faixa de concentração 0,005mg/mL a 1,2mg/mL, obtendo-se a equação da reta y=5,996.107 x – 3617,836 e coeficiente de correlação (R2) igual a 0,9978, o que é bastante satisfatório.
Para obtermos a concentração do composto na amostra do medicamento (paracetamol com lactose), podemos utilizar a equação da reta obtida na curva de calibração e a partir do uso do padrão a 100% (calibração externa de apenas um ponto), conforme mostrado a seguir, substituindo o valor de “y” pelas áreas das amostras indicado na tabela 4 (cromatogramas - anexos 6 e 7):
Tabela 4. Concentração e área das amostras
	
	Concentração (mg/mL)
	Área
	Amostra 1
	0,0087
	523143
	Amostra 2
	0,009
	541548
⇨Equação da reta para Amostra 1:
 y=5,996.107 x – 3617,836 
 523143 =5,996.107 x – 3617,836 
x=8,78.10-3 mg/ml
 Logo, a concentração de paracetamol na amostra 1 (1:1) é 0,0087 mg/ml.
⇨Equação da reta para Amostra 2:
 y=5,996.107 x – 3617,836 
 541548 =5,996.107 x – 3617,836 
x= 9,09.10-3 mg/mL
 Logo, a concentração de paracetamol na amostra 2 (1:3) é 0,009 mg/ml.
 Calibração externa (curva analítica) para Amostra 1:
Concentração = (Aa - coeficiente linear) x (r2) x FDA x Pp
----------------------------------------------------------- = % de paracetamol
 Coef. Angular x ma
Onde:
Aa: área da amostra.
Pp: pureza do padrão em %
ma: massa da amostra em mg.
FDA: fator de diluição da amostra
Considerando a diluição da amostra da seguinte forma: 25 mg para balão de 50 mL e diluição de 0,020mL para 1 mL. Assim, o fator de diluição da amostra será de 2500 vezes.
Concentração = (523143 -(– 3617,836) ) x (0,998) x 2500 x 99
 ------------------------------------------------------------ = 86,79% de paracetamol
 5,996.107 x 25
Calibração externa (curva analítica) para Amostra 2:
Concentração = (541548 -(– 3617,836) ) x (0,998) x 2500 x 99
 ------------------------------------------------------------ = 179,66% de paracetamol
 5,996.107 x 12,5
	
Calibração externa de um único ponto para Amostra 1 (ponto da concentração de 0,009 mg/ml):
 		Aa x mp x Pp x FDA
-------------------------------------- = % de paracetamol
Ap x FDP x ma
Onde:
Aa: área da amostra.
Ap: área média do padrão de concentração de 0,01 mg/mL
Pp: pureza do padrão em %
mp: massa do padrão em mg.
ma: massa da amostra em mg.
FDA: fator de diluição da amostra
FDP: fator de diluição do padrão
Considerando :
FDP = 25 x (50/5) x (10/0,9) = 2777,77
523143 x 25 x 99 x 2500
-------------------------------------- =87,48% de paracetamol
532843 x 2777,78 x 25
Calibração externa de um único ponto para Amostra 2 (ponto de concentração 0,009 mg/ml):
541548 x 25 x 99 x 2500
-------------------------------------- =181,11% de paracetamol
532843 x 2777,78 x 12,5
Comparação dos valores de calibração externa no ponto de concentração 0,009 mg/ml, nas amostras 1 e 2: 
Teoricamente, a amostra 1 deveria ter um maior valor de concentração de paracetamol, pois sua proporção é de 1:1 de paracetamol para lactose, enquanto que a amostra 2 apresenta proporção de 1:3. Contudo, além dos cálculos não demonstrarem essa variação de concentração, os dados das amostras ficaram fora da curva de calibração, o que dificulta ainda mais a exatidão dos resultados das amostras.
E, de acordo com a equação da curva de calibração dos padrões, as concentrações de paracetamol nas amostras 1 e2 são, respectivamente, 0,0087 e 0,009 mg/ml, o que corresponde com o esperado, pois encontra-se na faixa de concentração proposta.
Parâmetros cromatográficos:
⇨Fator de retenção (K Prime)
	Na cromatografia, o fator de retenção (K) é um componente determinado pela razão do tempo decorrido do instante em que a amostra foi introduzida até o instante do máximo do pico (Rt) menos o tempo do volume de retardamento (Vo) sobre este mesmo tempo, dado por:
K′=(Rt-Vo)/Vo, sendo, portanto:
K= fator de retenção
Rt= tempo de retenção
Vo= tempo do volume de retardamento (void volume time)
	Dessa forma, temos que:
Amostras 1 e 2:
K′=(1.866-0,6)/0,6= 2,11
⇨Fator de Assimetria (USP Tailing (T))
	Uma outra propriedade importante de uma coluna cromatográfica é a simetria dos picos, e distorções frontais ou posteriores (caudas) induzem à superposição dos picos [3]. O fator de assimetria mede a simetria dos picos e pode ser calculado através da seguinte fórmula:
T=W/(2xF), sendo:
W= largura do pico a 5% da altura
F= tempo do início da largura do pico a 5% de altura até o tempo de retenção (Rt)
Dessa forma, temos que:
Amostras 1 e 2:
T=(1,98-1,79)/(2x0,08)
T=2
 
⇨Número de Pratos (USP Plate Count (N))
A eficiência representada por um cromatograma é medida em termos de número de pratos gerados. Um prato pode ser considerado equivalente a uma etapa de equilíbrio entre as duas fases, análogo aos pratos de teoria de destilação. Quanto maior o número de pratos, mais equilíbrios existirão, maior será a eficiência e, portanto, melhor a separação [3]. O número de pratos é calculado pela seguinte fórmula:
N =16(Rt/W)2, sendo:
N= número de pratos teóricos
Rt= tempo de retenção
W= largura do pico na linha de base, determinada pela tangente do pico.
Dessa forma, temos que:
Amostras 1 e 2:
N=16(1.866/0,20)2=1392,782
Conclusão
A lactose é um dissacarídeo composto de β -D-galactose e D-glicose e consiste e um composto amplamente utilizado como excipiente para diversos fármacos, devido às suas propriedades de sólido, que garantem a simplicidade, redução de custos, rapidez, maior rendimento, não exposição do fármaco ao calor e aos solventes, compatibilidade físico química, compressibilidade, compactabilidade, fluidez, lubrificidade e capacidade de uniformizar misturas sem interagir com o princípio ativo. 
Durante o experimento, todas as integrantes do grupo puderam colocar em prática os métodos ensinados pelo docente, e este “excesso de operadores” pode ter ocasionado uma maior quantidade de erros acumulativos que, por fim, culminaram em uma menor resolução da análise final.
Enquanto a detecção era realizada, alguns picos não saíram corretos, isso ocorreu provavelmente devido à variação de solvente decorrente da mudança de “operador” tanto durante o preparo da amostra, quanto durante o processo de detecção.
Apesar desta possibilidades de erros, a experimentação foi satisfatória, possibilitando a separação e quantificação do paracetamol, bem como aprimorar nossos conhecimentos sobre a técnica da cromatografia líquida de alta eficiência e suas limitações. 
Referências
[1] http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc07/atual.pdf
[2] http://www.crq4.org.br/
[3]: Collins, C.H.; Braga; Bonato P.S.; Fundamentos da Cromatografia, Campinas - SP, Editora Unicamp, 2006.
[4] THE UNITED States Pharmacopeia, 24 ed., 1V.,Rockville, 2000.