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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Análise e Controle de Fármacos e Medicamentos AULAS PRÁTICAS PRESENCIAIS 2021/2 Prof. Rudy Bonfilio 2 PROGRAMAÇÃO DE AULAS Aula Conteúdo DATA CH de vídeo aula ou atividades remotas CH presencial 1 Apresentação de programa de disciplina, divisão de grupos, Apresentação do laboratório e normas de segurança, utilização de farmacopeias, amostragem. 13/10 4 horas - 2 Controle de qualidade de matérias-primas: impurezas inorgânicas, características físicas, solubilidade e faixa de fusão. 20/10 1 hora 3 horas 3 Controle de qualidade de matérias-primas: continuação de impurezas inorgânicas, pH, CCD e poder rotatório específico. 27/10 1 hora 3 horas 4 Controle de qualidade de matérias-primas: identificação e doseamento. 03/11 1 hora 3 horas 5 Validação de metodologia analítica: seletividade. 10/11 1 hora 3 horas 6 Validação de metodologia analítica: linearidade e repetibilidade. 10/11 1 hora 3 horas 7 Validação de metodologia analítica: Precisão intermediária e exatidão. 17/11 1 hora 3 horas 8 Validação de metodologia analítica: Robustez, LD e LQ. 17/11 1 hora 3 horas 9 Controle de qualidade de produto acabado: solução de dipirona. 24/11 1 hora 3 horas 10 Controle de qualidade de produto acabado: creme de cetoconazol. Controle de qualidade de material de embalagem 24/11 1 hora 3 horas 11 Controle de qualidade de produto acabado: comprimidos de captopril – parte 1. 01/12 1 hora 3 horas 12 Controle de qualidade de produto acabado: comprimidos de captopril (ensaios de dissolução e uniformidade de doses). 01/12 1 hora 3 horas 13 Controle de qualidade de produto acabado: comprimidos de captopril (doseamento por CLAE). 08/12 1 hora 3 horas 14 Avaliação final 08/12 4 horas - 15 Controle de qualidade de produto acabado: suspensão de paracetamol 15/12 1 hora 3 horas SISTEMA DE AVALIAÇÃO AVALIAÇÃO DATA VALOR PESO Questões sobre as atividades práticas Mesmo dia das aulas 10.0 1.0 Relatório de validação de método analítico A marcar 10.0 1.0 Avaliação 08/12/2021 (via moodle) 10.0 2.0 (*) Datas de aulas e avaliações sujeitas à alteração posterior, caso haja imprevisto. Início das aulas: 13/10/2021 - Fim das aulas: 15/12/2021 3 SUMÁRIO SEMANA N. 1 ................................................................................................................. 5 A) Apresentação de programa de disciplina ........................................................... 5 B) Divisão de grupos .................................................................................................. 5 C) Apresentação do laboratório e normas de segurança ..................................... 5 D) Utilização de farmacopeias .................................................................................. 9 E) Amostragem ......................................................................................................... 10 SEMANA N. 2 ............................................................................................................... 19 A) Determinação de impurezas inorgânicas ......................................................... 19 A.1) Resíduo por incineração (cinzas sulfatadas) - No máximo 0,1% ........ 19 A.2) Ensaios limite ............................................................................................... 20 A.3) Perda por dessecação (paracetamol) - No máximo 0,5%. ................... 22 B) Características físicas (paracetamol) ............................................................... 22 C) Solubilidade (paracetamol) ................................................................................. 23 D) Faixa de fusão (paracetamol) ............................................................................ 24 SEMANA N. 3 ............................................................................................................... 30 A) Continuação de resíduo por incineração (cinzas sulfatadas) - No máximo 0,1%. .............................................................................................................................. 30 B) Determinação de pH (paracetamol) .................................................................. 30 C) Cromatografia em camada delgada (cimetidina) ............................................ 31 D) Poder rotatório específico (captopril) ................................................................ 33 SEMANA N. 4 ............................................................................................................... 36 A) Ensaios de identificação e doseamento em matérias-primas ...................... 36 SEMANA N. 5 ............................................................................................................... 41 Validação de método analítico - seletividade .......................................................... 41 SEMANA N. 6 ............................................................................................................... 46 A) Validação de método analítico - linearidade ................................................... 46 B) Validação de método analítico - repetibilidade ............................................... 48 SEMANA N. 7 ............................................................................................................... 51 A) Validação de método analítico - exatidão ........................................................ 51 B) Validação de método analítico - precisão intermediária ................................ 53 SEMANA N. 8 ............................................................................................................... 57 A) Validação de método analítico - robustez ........................................................ 57 B) Validação de método analítico – LD E LQ ....................................................... 59 SEMANA N. 9 ............................................................................................................... 62 Controle de qualidade de solução de dipirona ........................................................ 62 A) Determinação de volume .................................................................................... 62 B) Identificação e doseamento ............................................................................... 63 4 C) Determinação do pH ........................................................................................... 64 D) Determinação de densidade .............................................................................. 65 E) Determinação de viscosidade ............................................................................ 66 F) Teste De Gotejamento ........................................................................................ 68 SEMANA N. 10 ............................................................................................................. 72 A) Controle de qualidade de creme de cetoconazol ........................................... 72 A.1) Determinação do peso ............................................................................... 72 A.2) Identificação e doseamento ....................................................................... 73 A.3) Determinação de viscosidade ................................................................... 75 SEMANA N. 11 ............................................................................................................. 76 Controle de qualidade de captopril comprimidos (parte 1) ................................... 76 A) Identificaçãoe doseamento de captopril comprimidos .................................. 76 B) Determinação do peso ........................................................................................ 78 C) Teste de dureza ................................................................................................... 79 D) Teste de friabilidade ............................................................................................ 79 E) Teste de desintegração ...................................................................................... 80 SEMANA N. 12 ............................................................................................................. 82 A) Teste de dissolução de captopril comprimidos .................................................. 82 B) Uniformidade de doses unitárias de captopril comprimidos ......................... 85 SEMANA N. 13 ............................................................................................................. 91 Doseamento de captopril comprimidos por CLAE ................................................. 91 SEMANA N. 14 ............................................................................................................. 94 Controle de qualidade de material de embalagem................................................. 94 SEMANA N. 15 ........................................................................................................... 103 Controle de qualidade de suspensão de paracetamol ........................................ 103 A) Determinação de volume .................................................................................. 103 B) Identificação e doseamento ............................................................................. 104 C) Determinação de densidade ............................................................................ 105 D) Determinação de viscosidade .......................................................................... 106 5 SEMANA N. 1 A) Apresentação de programa de disciplina B) Divisão de grupos C) Apresentação do laboratório e normas de segurança Inicialmente, os alunos deverão se familiarizar com: 1) Laboratório; 2) Pessoal envolvido na disciplina; 3) Localização dos reagentes, vidrarias, equipamentos e Farmacopeias; 4) Controle de reagentes; 5) Controle de vidrarias; 6) Descarte adequado de reagentes; 7) Normas de segurança; Observação importante: Todos os procedimentos de segurança em laboratórios aprendidos durante o curso de Farmácia deverão ser estritamente seguidos durante as aulas práticas de Controle Físico-Químico de Fármacos, Medicamentos e Cosméticos. A seguir, uma revisão de procedimentos importantes de segurança a serem adotados: 1) É obrigatório o uso de avental de mangas compridas dentro dos laboratórios; 2) É obrigatório o uso de óculos de proteção sempre que for manipular substâncias, reagentes e amostras; 3) É obrigatório o uso de luvas sempre que for manipular substâncias reagentes e amostras. O professor deverá ser consultado quanto ao tipo de luva que deve ser utilizada em cada procedimento; 4) É obrigatório o uso de máscaras sempre que for manipular substâncias reagentes e amostras. O professor deverá ser consultado quanto ao tipo de máscara que deve ser utilizada em cada procedimento; 5) É obrigatório o uso da capela em todas as experiências que envolvam produtos corrosivos e/ou vapores tóxicos; 6) É obrigatório o uso de calça comprida e sapato fechado. No caso de cabelos compridos, estes deverão estar presos; 6 7) É proibido o uso de avental fora dos laboratórios; 8) Não usar lentes de contato durante o trabalho no laboratório; 9) Antes de manipular qualquer reagente ou substância, é obrigatória a consulta das fichas de Informações de Segurança de Produto Químico (FISPQ), a fim de conhecer todas as propriedades tóxicas e evitar possíveis acidentes e contaminações; 10) Ler atentamente os rótulos dos frascos dos reagentes antes de utilizá- los. Ler duas vezes para ter certeza; 11) Encarar todos os produtos químicos como veneno em potencial, enquanto não verificar sua inocuidade; 12) Não brincar em serviço. Laboratório é lugar para trabalho sério; 13) Consultar o professor quando tiver qualquer tipo de dúvida ou antes de fazer qualquer tipo de modificação no andamento dos experimentos ou quantidades de reagentes a serem usados; 14) Durante a realização das experiências, dirija sua atenção única e exclusivamente ao trabalho que está executando; 15) Verificar a voltagem de cada equipamento antes de utilizá-lo; 16) Ao utilizar um equipamento pela primeira vez, leia o manual atentamente; 17) É, terminantemente, proibido ausentar-se do laboratório e deixar qualquer equipamento operando sozinho; 18) Desligar os celulares durante as atividades; 19) Nunca retirar nenhum material do laboratório. 20) Utilizar somente quantidades necessárias dos reagentes, evitando desperdícios. 21) Coloque todo o material escolar (mochilas, pastas, cadernos, etc.) no local próprio. Não colocar sobre as bancadas dos laboratórios qualquer material estranho ao trabalho que estiver realizando; 22) Nunca trabalhar sozinho(a) nos laboratórios, somente na presença de outras pessoas; 23) Não fumar dentro dos laboratórios; 24) Não comer nem beber dentro dos laboratórios; 25) Durante a permanência nos laboratórios, evite passar os dedos na boca, nariz, olhos e ouvidos; 26) Lavar sempre as mãos após manusear reagentes; 7 27) Não tocar ou provar quaisquer produtos químicos; 28) Segurar o frasco de reagente com o rótulo voltado para a palma de sua mão, evitando desta forma, danos ao rótulo; 29) Identificar corretamente as vidrarias que contêm substâncias; 30) Evitar derramamento de líquidos, mas, se o fizer, limpar imediatamente o local (consultar o professor); 31) Se alguma solução ou reagente respingar na pele ou nos olhos, lavar imediatamente com bastante água corrente e avisar ao professor; 32) Nunca empregar equipamento de vidro trincado ou quebrado; 33) Prestar muita atenção quando manusear materiais de vidro, pois são frágeis e rompem-se facilmente, provocando acidentes; 34) Não devolver sobras de reagentes ao frasco original, evitando assim possíveis contaminações; 35) Não utilizar a mesma pipeta para soluções diferentes; 36) Não inalar gases ou vapores desconhecidos; 37) Quando for utilizar o gás, abra a torneira somente após acender o palito de fósforo (nunca um isqueiro!) e, ao terminar seu uso, feche com cuidado a torneira, evitando vazamentos; 38) Verificar as torneiras de gás supostamente fechadas; 39) Não deixar o bico de gás aceso com chama forte sobre a bancada; 40) Não aquecer reagentes em sistemas fechados, pois pode haver quebra de aparelhagem; 41) Quando aquecer uma substância em tubos de ensaio, não volte a extremidade aberta para si ou para uma pessoa próxima; 42) Manter a cabeça e o vestuário afastado das chamas; 43) Manter o rosto tão distante quanto possível durante as operações de aquecimento ou mistura de reagentes; 44) Não abandonar peças de vidro aquecido em qualquer lugar (o vidro quente parece com o vidro frio!). Coloque-o sempre sobre uma tela de amianto, o que alertará aos demais sobre o perigo de queimaduras; 45) Não deixar produtos inflamáveis perto do fogo e nem expostos ao sol; 46) Não aquecer líquidos inflamáveis em chama direta; 47) Não se deve aquecer bruscamente nenhum sólido ou líquido; 48) Evite debruçar-se sobre a bancada; 49) Conservar sempre limpa a bancada e a aparelhagem que utilizar; 8 50) Não deixar frascos de reagentes destampados, principalmente se contiverem substâncias voláteis. Tenha o cuidado de não trocar as tampas dos frascos; 51) Os reagentes de uso coletivo deverão ser mantidos em seus devidos lugares; 52) Sempre quetrabalhar com água e ácidos concentrados, use sempre a capela, adicionando, lentamente, o ácido sobre a água e NUNCA o contrário; 53) Nunca adicionar sólido em líquido aquecido. Isto pode resultar em uma ebulição violenta; 54) Jogar todos os sólidos e pedaços de papel utilizados em recipiente adequado, destinado ao lixo. Nunca jogar sólidos na pia, ainda que solúveis; 55) Não aquecer vidraria volumétrica; 56) É proibido pipetar líquidos diretamente com a boca. Utilizar pipetadores; 57) Os frascos lavadores (pissetas) devem conter somente água destilada; 58) Evitar montagens instáveis de aparelhos, tais como suportes de vidro, lápis, caixas de fósforo, etc; 59) Localize o extintor de incêndio e familiarize-se com o seu uso; 60) Certifique-se do bom funcionamento dos chuveiros de emergência; 61) Conserve sua bancada organizada; 62) É obrigatório limpar todos os materiais e as bancadas após o término dos experimentos; 63) Ao se retirar do laboratório, verifique se não há torneiras (água ou gás) abertas e limpe todo o material utilizado, bem como a bancada; 64) Desligar todos os aparelhos antes de deixar o laboratório; 65) Lavar bem as mãos antes de deixar o laboratório. 66) Após o término de cada experimento, os reagentes deverão ser descartados em local adequado (consultar o professor e/ou os técnicos. Tenha um caderno de laboratório, onde deverão estar registrados todos os dados dos experimentos. 9 SÍMBOLOS DE RISCO D) Utilização de farmacopeias Farmacopeia Brasileira: • 6ª Edição: (publicada em 15/08/2019); • Disponível no site da ANVISA: http://portal.anvisa.gov.br/farmacopeia-brasileira; • É o código oficial farmacêutico do país, onde se estabelecem, dentre outras coisas, REQUISITOS MÍNIMOS DE QUALIDADE E MÉTODOS DE ANÁLISE PARA: o Insumos Farmacêuticos e Especialidades; o Plantas Medicinais; o Produtos Biológicos; o Hemocomponentes e Hemoderivados; o Correlatos; o Radiofármacos; o Gases Medicinais. Os alunos deverão se familiarizar com a Farmacopeia Brasileira, observando: 1) VOLUME 1: • Informações sobre os métodos gerais (como aplicar um determinado método)? http://portal.anvisa.gov.br/farmacopeia-brasileira 10 • Preparo de reagentes; • Informações gerais; • Etc.; 2) VOLUME 2: • Monografias: Testes que devem ser realizados para cada insumo farmacêutico ou especialidade e as especificações que devem ser cumpridas. Os produtos farmacopeicos devem estar em conformidade com todos os ensaios preconizados na Farmacopeia Brasileira; Caso contrário, deve ser REPROVADO (devolvido ao fabricante, reprocessado ou descartado de forma adequada). Obs.: Resolução RDC nº 37, de 06/07/2009: Art. 1º Na ausência de monografia na Farmacopeia Brasileira, poderá ser adotada monografia oficial, última edição, de um dos seguintes compêndios: • Farmacopeia Alemã; • Farmacopeia Americana; • Farmacopeia Argentina; • Farmacopeia Britânica; • Farmacopeia Europeia; • Farmacopeia Francesa; • Farmacopeia Internacional; • Farmacopeia Japonesa; • Farmacopeia Mexicana; • Farmacopeia Portuguesa. E) Amostragem POPULAÇÃO • Conjunto de todos os elementos (lotes, processos, acontecimentos) que se deseja estudar; • Também chamada de universo. AMOSTRA • Subconjunto da população (parte dos elementos). 11 AMOSTRAGEM • Retirada representativa de material para análise e controle; • O objetivo da amostragem é nos ajudar a tomar uma decisão não sobre as amostras em si, mas todo o universo que elas representam (inferência); • Se a amostragem estiver errada, podemos ter os melhores equipamentos e os melhores analistas, o resultado não tem validade; • É a primeira etapa do controle de qualidade; • Pode representar até 30% do erro de uma análise. • AMOSTRAGEM CORRETA DEPENDE DA QUALIDADE DA AMOSTRA E NÃO DA QUANTIDADE DE AMOSTRA! CÁLCULO DO NÚMERO DE UNIDADES A SEREM AMOSTRADAS Onde: n = número de amostras N = tamanho do lote QUAIS UNIDADES AMOSTRAR? DEPENDE... AMOSTRAGEM PROBABILÍSTICA • Todos os elementos da população têm uma probabilidade conhecida e superior a zero de integrarem a amostra; TIPOS DE AMOSTRAGEM PROBABILÍSTICA • Amostragem aleatória simples: – População numerada de 1 a N e amostras selecionadas por sorteio ou outra forma aleatória. • Amostragem aleatória sistemática: – Amostra de tamanho n, constituída dos elementos K, K + r, K +2r, K + 3r... – K é um número inteiro escolhido aleatoriamente, sendo 1 < k < n; – R é o inteiro mais próximo da fração N/n. • Amostragem aleatória estratificada: – Estratifica-se a população por intermédio de critérios (homem e mulher, líquidos e sólidos, ácidos e bases); – Realiza-se sorteio aleatório dentro de cada estrato. 12 • Amostragem aleatória por conglomerados ou clusters: – Sorteia-se um conjunto e procura estudar todo o conjunto (sacos de farinha, pilhas de livros, caixas de medicamentos). • Amostragem multi-etapas: – Sorteia-se aleatoriamente um grupo. Dentro do grupo, sorteia-se aleatoriamente os indivíduos para compor a amostra.; – Ex.: sorteia-se caixas de medicamentos, e dentro de cada caixa, sorteia- se comprimidos. • Amostragem multifásica – A partir da população N, sorteia-se aleatoriamente um grupo de tamanho n e estuda este grupo; – A partir da população N, novamente sorteia-se aleatoriamente um grupo de tamanho n e estuda este grupo. Entretanto, nessa fase o tipo de estudo é diferente, com base na fase anterior; – Ex.: Sorteia-se n recipientes de matérias-primas e realiza-se algumas análises prévias; – Em uma segunda fase, sorteia-se novamente n recipientes e realiza-se análises diferentes, levando-se em consideração os resultados da fase anterior. AMOSTRAGEM NÃO PROBABILÍSTICA • Nem todos os elementos da população têm a mesma chance de integrarem a amostra; • Escolha dos elementos feita de forma não aleatória. TIPOS DE AMOSTRAGEM NÃO PROBABILÍSTICA • Amostragem intencional – Fundamentada em critérios ou objetivos específicos do investigador; – Pesquisador usa o seu julgamento para selecionar os membros da população que são boas fontes de informação precisa. • Amostragem não intencional: – Único critério é a conveniência (seja relativa a tempo ou espaço, seja pela disponibilidade dos elementos da população); 13 – Utilizada muitas vezes quando a amostra está disponível no local e momento da pesquisa. AMOSTRAGEM CONFORME RDC 17/2010 - BPF • Executar a amostragem em local adequado (sala de amostragem). Nunca amostrar no almoxarifado! • Higienização adequada da sala de amostragem (Executar a limpeza da sala após a amostragem de cada substância ativa); • Higienização e paramentação adequada dos funcionários (utilizar EPIs); • Matéria-prima: sala com fluxo laminar ou com ar controlado no que tange a qualidade e diferencial de pressão; • As embalagens de matéria-prima que foram amostradas devem ser identificadas como amostradas; • Evitar a ocorrência de contaminação - os recipientes devem ser limpos, identificados e fechados após amostragem (BPF); • Se for produto final pode amostrar na produção; • As amostragens devem ser realizadas por métodos aprovados e pessoal qualificado; • Embalagens - antes de entrarem na sala de amostragem devem sofrer limpeza prévia; • Utilizar aparatos de amostragem limpos. • Cuidados na amostragem: condições assépticas, temperatura, condições de transporte, acondicionamento, volatilidade, sensibilidade à luz, reatividade química... • Assumir que o material é homogêneo: ERRO. – Material se encontra em duas ou mais fases físicas. As fases podem ser separadas e mantidas como amostras independentes ou pode-se homogeneizar as fases para formar uma única amostra. – Fase sólida: pode haver variação considerávelda amostra se a distribuição do tamanho das partículas do material varia significativamente: Concentração da amostra pode variar considerando que as diferentes partes estão sujeitas as diferentes tensões. 14 AMOSTRAGEM DE MATÉRIAS-PRIMAS • Amostrada em quantidade suficiente, permitindo no mínimo 4 análises completas; • Liberada: estocada como amostra de referência futura, até um ano após expiração do prazo de validade; • Rejeitada: deve-se, antes da emissão do laudo, ser reanalisada por até 2 analistas diferentes e/ou metodologias diferentes. AMOSTRAGEM – CONTROLE EM PROCESSO • Amostra em quantidade suficiente para permitir 4 análises completas; • Estocadas até aprovação do produto; • Rejeitada: podem ser novamente reprocessadas e reanalisadas. AMOSTRAGEM – PRODUTO ACABADO • Amostra em quantidade suficiente para permitir 4 análises completas; • Envasado em embalagem de venda e armazenado em condições especificadas; • Estocado até um ano após expiração do prazo de validade definido; • Rejeitado: impedimento de utilização terapêutica. PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO (POP) DE AMOSTRAGEM • Plano de amostragem: plano que determina o número de amostras a serem retiradas do lote e a forma de seleção dos elementos da população; • Procedimento de amostragem: detalhes de como se deve proceder a amostragem (condições ambientais critérios de seleção, preparação da amostra, eventuais desvios, etc.); • Identificação do amostrador; • Registros de todos os procedimentos. EMBALAGENS DAS AMOSTRAS • Embalagem deve assegurar que a amostra possa ser manuseada sem causar danos químicos ou microbiológicos; • Atenção a contaminação da amostra por metais ou plastificantes dos frascos ou das tampas utilizados na amostragem; 15 • Vedação adequada para que não haja vazamento da amostra e nem entrada de contaminantes. Amostras devem ser lacradas ou seladas. A confirmação da condição satisfatória do selo faz parte do relatório analítico. ETIQUETAS DAS AMOSTRAS • Etiqueta é aspecto importante da documentação pois deve identificar em relação às informações; • Etiqueta deve ser resistente à: 1) descoramento; 2) autoclavamento; 3) derramamento da amostra ou reagente; 4) condições de temperatura e umidade; • Documentos, como recibos, que atestam que um assinante repassou a amostra para o próximo assinante. ESTOCAGEM DAS AMOSTRAS • Áreas de armazenamento devem ser mantidas limpas e organizadas para evitar riscos de contaminação cruzada; • Condições ambientais controladas para evitar alterações na amostra; • Monitoramento ambiental; • Nível de segurança apropriado. Procedimentos (AMOSTRA DE PARACETAMOL) 1) Com base nos ensaios de matérias-primas que serão realizados nas aulas posteriores (demonstrados na tabela abaixo), e considerando que deve-se guardar quantidade suficiente para, no mínimo, quatro análises completas da matéria-prima, cada grupo deverá calcular a quantidade de matéria- prima a ser amostrada: 16 Ensaio Quantidade aproximada necessária Impurezas inorgânicas: Cinzas sulfatadas 1 g Impurezas inorgânicas: Ensaio limite de cloretos 1 g Impurezas inorgânicas: Ensaio limite de sulfatos 1 g Perda por dessecação 1 g Características físicas 10 mg Solubilidade 100 mg Faixa de fusão 100 mg pH 100 mg Identificação por espectroscopia na região do ultravioleta. 100 mg Identificação por reação colorimétrica com cloreto férrico 100 mg Doseamento 100 mg 2) A quantidade calculada de matéria-prima a ser utilizada nas aulas posteriores deverá ser amostrada de forma correta em recipiente adequado. 3) Cada recipiente deverá ser identificado com as seguintes informações: Nome da matéria-prima Número de lote Quantidade comprada Origem Procedência Fornecedor Data de fabricação Data de validade Data da coleta Data da entrada no Controle de Qualidade Referências: ALMEIDA, P. G. V. Química Geral (práticas fundamentais). Viçosa: Editora UFV, 2001. CONSTANTINO, M. G.; SILVA, G. V. J da.; Donate, P. M. Fundamentos de Química Experimental. São Paulo: Edusp, 2004. GIL, E. S. – Controle Físico-Químico de Qualidade de Medicamentos. 3ª ed. São Paulo: Pharmabooks, 2010. FARMACOPEIA BRASILEIRA. 6ª ed. Brasília: Anvisa. 2019. 17 Questões das atividades da semana número 1 1) Quais EPIs deverão ser utilizados nas aulas práticas? 2) Quais as obrigatoriedades com relação às vestimentas durante as aulas práticas? 3) Suponha que cada grupo recebeu uma determinada matéria-prima para controle de qualidade. Onde se deve pesquisar quais os ensaios que devem ser realizados nessa matéria-prima? Onde pesquisar quais os limites e especificações para esta matéria-prima? Onde pesquisar como se deve realizar cada ensaio? 4) Suponha uma amostragem aleatória sistemática em um lote de matéria- prima recebida pelo seu grupo com uma população de 49 unidades. Qual o número de unidades deve ser amostrada? Quais unidades devem ser amostradas? Descreva os cálculos. 5) Descreva o procedimento de amostragem ideal que deve ser realizado no paracetamol matéria-prima. 18 MATERIAIS NECESSÁRIOS PARA SEMANA N. 1 Material Quantidade (caso cada grupo utilize o seu material) Quantidade (para ser utilizado por todos os grupos) Espátula 1 unidade/grupo --- Recipiente de plástico 1 unidade/grupo --- Paracetamol matéria-prima 100 gramas/todos, divididos em 10 frascos numerados de 1 a 10 Farmacopeia Brasileira, 6ª edição --- 1 unidade/todos United States Pharmacopoeia --- 1 unidade/todos European Pharmacopoeia --- 1 unidade/todos British Pharmacopoeia --- 1 unidade/todos Tesoura --- 1 unidade/todos Fita adesiva transparente --- 1 unidade/todos Folha papel A4 --- 1 unidade/todos Projetor datashow --- 1 unidade/todos 19 SEMANA N. 2 A) Determinação de impurezas inorgânicas As impurezas inorgânicas presentes em fármacos geralmente estão presentes em pequenas quantidades. São, geralmente, decorrentes do processamento da matéria-prima ou produto, e os ensaios de pureza são associados com a frequência (abundância) e/ou relevância do contaminante. Entre os contaminantes inorgânicos mais comuns, destacam-se a água, íons metálicos, cloretos, sulfatos e outros ânions. A seguir estão exemplificados alguns contaminantes inorgânicos que podem estar presentes em matérias- primas e os problemas que estes podem causar, caso estejam acima dos limites. Cinzas sulfatadas: parâmetro qualitativo. Cloretos: instabilidade; Sulfatos: instabilidade; Metais pesados: toxicidade e instabilidade; Ferro: instabilidade; Arsênio: toxicidade; Amônia: toxicidade e instabilidade; Substâncias voláteis: dosagem, instabilidade e toxicidade. A.1) Resíduo por incineração (cinzas sulfatadas) - No máximo 0,1% É o resíduo não volátil de uma amostra incinerada na presença de ácido sulfúrico. Este ensaio é utilizado para determinar o conteúdo de impurezas inorgânicas presentes em uma substância orgânica. Procedimento (primeiro dia): Realizar o procedimento em capela exaustora bem ventilada, mas protegida de correntes de ar. 1) Anotar a massa do cadinho de porcelana previamente incinerado a (600 ± 50) °C por 30 minutos e resfriado em dessecador; 2) Pesar exatamente 1,0000 g da amostra no mesmo cadinho (anotar a massa exata de amostra); 20 3) Umedecer a amostra com aproximadamente 1 mL de ácido sulfúrico, aquecer suavemente à temperatura tão baixa quanto possível até a carbonização da amostra (escurecimento); 4) Resfriar e umedecer o resíduo com 1 mL de ácido sulfúrico; 5) Aquecer suavemente até que não sejam desprendidos fumos brancos e carbonizarimediatamente; 6) Incinerar a (600 ± 50) °C por duas horas, 7) Resfriar em um dessecador e pesar imediatamente após o resfriamento. A.2) Ensaios limite São semi-quantitativos, pois destinam-se a comprovar se o conteúdo de determinada impureza não excede o limite, em mcg/g de substância analisada, especificado na monografia. Os ensaios consistem em reações químicas, as quais produzem turbidez, precipitação ou mudança de cor, e posterior comparação visual da intensidade da cor nas preparações amostra e padrão em tubo de Nessler. Exemplos reações químicas para determinação de impurezas presentes em fármacos: Cloretos Cl- + AgNO3 → AgCl + NO3- Sulfatos SO4- + BaCl2 → BaSO4 + 2Cl- Procedimento: A.2.1) Ensaio limite de cloretos do paracetamol (No máximo 0,014% (140 ppm)). Amostra: 1) Agitar 1 g da amostra com 25 mL de água em béquer de 50 mL; 2) Filtrar quantitativamente para tubo de Nessler (capacidade de 50 mL e 22 mm de diâmetro interno); 3) Adicionar ao filtrado 1 mL de ácido nítrico 2 M (SR); 4) Adicionar 30 a 40 mL de água destilada (não completar ainda até o menisco). 21 Padrão: 1) Transferir 0,395 mL (395 µL) de de ácido clorídrico padrão (cada 1,0 mL HCl 0,01 M contém 354,6 ppm de cloreto), para um tubo de Nessler; 2) Adicionar um volume de 30 a 40 mL de água destilada (não completar ainda até o menisco). Procedimento: 1) Aos tubos de Nessler contendo a preparação padrão e a preparação amostra, adicionar 1 mL de ácido nítrico 2M (SR) e 1 mL de nitrato de prata SR; 2) Completar o volume para 50 mL com água destilada e homogeneizar; 3) Deixar em repouso, ao abrigo da luz, durante 5 minutos. Interpretação do resultado: A turbidez da preparação amostra não deve ser superior à do padrão. A.2.2) Ensaio limite de sulfatos do paracetamol (No máximo 0,02% (200 ppm). Amostra: 1) Agitar 1 g da amostra com 25 mL de água em béquer de 50 mL; 2) Filtrar quantitativamente para tubo de Nessler (capacidade de 50 mL e 22 mm de diâmetro interno); 3) Adicionar 30 a 40 mL de água destilada (não completar ainda até o menisco). Padrão: 1) Transferir 0,416 mL (416 µL) de ácido sulfúrico padrão (cada 2,5 mL de H2SO4 0,005 M SV contém 1200,8 ppm de sulfato) para um tubo de Nessler; 2) Adicionar 30 a 40 mL de água destilada. 22 Procedimento: 1) Aos tubos de Nessler contendo a preparação padrão e a preparação amostra, adicionar 1 mL de ácido clorídrico 3 M e 3 mL de cloreto de bário SR; 2) Completar o volume para 50 mL com água destilada e homogeneizar; 3) Deixar em repouso por cerca de 10 minutos. Interpretação do resultado: A turbidez da preparação amostra não deve ser superior à do padrão. A.3) Perda por dessecação (paracetamol) - No máximo 0,5%. Esse ensaio se destina a determinar a quantidade de substância volátil de qualquer natureza eliminada nas condições especificadas na monografia. Procedimento utilizando balança com infravermelho: 1) Retirar a umidade do equipamento; 2) Pesar cerca de 1,00 g da substância a ser analisada e distribuir o material uniformemente no coletor de alumínio contido dentro do aparelho; 3) Definir a temperatura (105 °C até peso constante); 4) Acionar o aparelho e anotar o valor da umidade, em percentual, que aparecerá no display do aparelho. Interpretação do resultado: a amostra deve conter no máximo 0,5% de substâncias voláteis. B) Características físicas (paracetamol) Procedimento: observar em vidro de relógio uma pequena quantidade de paracetamol. Segundo especificações na monografia da matéria prima do paracetamol da sexta edição da Farmacopeia Brasileira, o paracetamol é um pó cristalino branco. 23 Interpretação do resultado: a amostra deve corresponder à descrição farmacopeica. C) Solubilidade (paracetamol) O teste de solubilidade farmacopeico é válido como ensaio complementar de identidade e apresenta utilidade na avaliação do grau de pureza de matérias-primas. A solubilidade indicada não deve ser tomada no sentido estrito de constante física, porém, complementa e corrobora com os demais ensaios, podendo ter um valor definitivo caso a substância não apresente a solubilidade mínima exigida, principalmente, no solvente água. As indicações sobre a solubilidade referem-se às determinações feitas à temperatura de 25 ± 5 ºC. A expressão partes se refere ao número de mililitros de solvente por grama de sólido a ser dissolvido. As solubilidades aproximadas estabelecidas nas monografias são designadas em termos descritivos, cujos significados estão relacionados na Tabela 1: Tabela 1 - Termos descritivos de solubilidade e seus significados Fonte: Farmacopeia Brasileira, 2019. 24 Procedimento: O paracetamol é descrito na quinta edição da Farmacopeia Brasileira como moderadamente solúvel em água e facilmente solúvel em álcool etílico, além de outros solventes. De acordo com o conceito de partes, deve-se testar entre 10 mg e 1 g de amostra nos solventes descritos. Exemplo: O paracetamol é descrito como moderadamente solúvel em água. Portanto, deve-se testar se 1 g de paracetamol se dissolve em 30 a 100 mL de água. Sempre se deve testar o maior volume. Então, deve-se testar se 1 g de paracetamol se dissolve em 100 mL de água. Para fins de economia de amostra, testa-se se 0,01 g se dissolve em 1 mL de água. D) Faixa de fusão (paracetamol) Faixa de fusão é o Intervalo de temperatura compreendido entre o início (no qual a substância começa a fluidificar-se ou formar gotas) e o término da fusão (que é evidenciado pelo desaparecimento da fase sólida). Pode ser empregado tanto como um ensaio de identificação como de pureza. Uma transição da fusão pode ser instantânea para um material altamente puro, mas geralmente se observa um intervalo desde o começo até o final do processo. Existem diferentes fatores que influenciam nesta transição e devem ser padronizados quando se descreve o procedimento. Estes fatores incluem: quantidade da amostra, tamanho das partículas, eficiência na difusão do calor e a velocidade do aquecimento, entre outros. Procedimento: 1) Reduzir a amostra a pó fino e secá-la em um dessecador a vácuo sobre um agente dessecante apropriado durante 24 horas. 2) Levar uma das extremidades de um capilar para chama de bico de Bunsen até fechamento do orifício. 25 3) Colocar uma pequena porção do composto pulverizado sobre superfície dura e limpa e então recolher uma pequena parcela do composto na boca do tubo capilar conforme figura abaixo: 4) Virar capilar para cima e atritar numa lima conforme figura abaixo: 5) ou deixar cair o capilar em uma vara de vidro conforme figura abaixo: 6) ou bater levemente em uma superfície plana. 7) Carregar o tubo capilar seco com quantidade suficiente do pó até formar uma coluna de 3 mm a 4 mm de altura. 8) Aquecer o bloco rapidamente até uma temperatura de 10 ºC abaixo do ponto de fusão esperado. Introduzir o capilar no bloco e registrar a temperatura no início e no final da fusão. 26 9) Realizar a determinação pelo menos em triplicata. Para isso, deixar resfriar o bloco até 10 ºC abaixo do ponto de fusão ou até uma temperatura inferior, e repetir o procedimento empregando novas porções da amostra. Observar a faixa de fusão do paracetamol. De acordo com a descrição da monografia do paracetamol da sexta edição da Farmacopeia Brasileira, deve estar compreendida entre 168 °C a 172 °C. Referências: FARMACOPEIA BRASILEIRA. 6ª ed. Brasília: Anvisa. 2019. GIL, E. S. – Controle Físico-Químico de Qualidade de Medicamentos. 3ª ed. São Paulo: Pharmabooks, 2010. SHRINER, R. L.; FUSON, R. C.; CURTIN, D. Y.; MORRILL, T. C. Identificação sistemática dos compostos orgânicos: manual de laboratório. 6ª ed. Rio de Janeiro:Guanabara Dois, 1983 - 517 p. 27 Questões das atividades práticas da semana número 2. 1) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no ensaio limite de cloretos do paracetamol. Incluir na discussão as possíveis fontes de erros experimentais. 2) Supondo que a especificação para o ensaio limite de cloretos no paracetamol fosse: no máximo 350 ppm, calcule o volume de ácido clorídrico 0,01 M que seria necessário para preparo da solução padrão. 3) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no ensaio limite de sulfatos do paracetamol. Incluir na discussão as possíveis fontes de erros experimentais. 4) Qual a importância da realização dos ensaios limites de cloretos e de sulfatos para controle de qualidade de Ingredientes Farmacêuticos Ativos (IFAs)? 5) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no ensaio de perda por dessecação do paracetamol. Incluir na discussão as possíveis fontes de erros experimentais. 6) Descrever, interpretar e discutir os resultados obtidos nos ensaios de determinação de solubilidade do paracetamol. Descreva as massas de IFAs e os volumes dos solventes utilizados no teste. Incluir na discussão as possíveis fontes de erros experimentais. 7) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no ensaio de determinação da faixa de fusão do paracetamol. Incluir na discussão as possíveis fontes de erros experimentais. 8) Qual a importância da realização do ensaio de determinação da faixa de fusão para controle de qualidade de IFAs? 28 MATERIAIS NECESSÁRIOS PARA SEMANA N. 2 Paracetamol (contaminar algumas amostras com 2,0 mL de HCl 0,1 M e outras com 1,0 mL de H2SO4 0,1 M). Anotar quais amostras foram contaminadas com HCl 0,1 M e quais foram contaminadas com H2SO4. Não mostrar aos alunos. Amostrado por cada grupo --- Cadinho de porcelana previamente calcinado a 600 oC ± 50 oC por 30 minutos e esfriado em dessecador. O técnico deverá anotar a massa de cada cadinho imediatamente após o mesmo esfriar e repassar os valores aos alunos. 1 unidade/grupo --- Vidro de relógio 1 unidade/grupo --- Pinça para cadinho 1 unidade/grupo --- H2SO4 P.A. 10 mL/grupo --- Espátula 1 unidade/grupo --- Água destilada 1 pisseta cheia/grupo --- Béquer de 50 ou 100 mL 2 unidades/grupo --- Proveta de 25 mL 2 unidades/grupo --- Papel de filtro quantitativo 2 unidades/grupo --- Tubo de ensaio 2 unidades/grupo --- Suporte para tubos de ensaio 1 unidade/grupo --- Tubo de Nessler 4 unidades/grupo --- Suporte para tubo de Nessler 1 unidade/grupo --- Etanol anidro 10 mL/grupo --- Ácido Nítrico 2 M (SR) 20 mL/grupo --- Solução padrão de ácido clorídrico (354,6 ppm/mL = 0,01 M) 10 mL/grupo --- Solução padrão de ácido sulfúrico a 1200,8 ppm/2,5 mL = 0,005 M. 10 mL/grupo --- Nitrato de prata solução reagente 10 mL/grupo --- HCl 3 M 10 mL/grupo --- Cloreto de Bário SR 10 mL/grupo --- Pipeta volumétrica de 3 mL 1 unidade/grupo --- Prato para balança de infravermelho 1 unidade/grupo --- Tubos capilares 3 unidades/grupo --- Pipeta graduada de 1 mL --- 1 para todos (para H2SO4 P.A.) Bico de Bunsen --- 1 unidade/todos Tela de amianto --- 1 unidade/todos Mufla --- 1 unidade/todos Dessecador --- 2 unidades/todos Papel alumínio --- 1 rolo/todos Micropipeta de volume ajustável, com volume entre 200 µL e 1000 µL, com ponteiras --- 1 unidade/todos Micropipeta de volume fixo, com volume de 1000 µL, com ponteiras --- 1 unidade/todos Bico de Bunsen --- 1 unidade/todos Balança analítica previamente calibrada (4 casas) --- 2 unidades/todos Balança de infravermelho --- 1 unidade/todos 29 Aparelho para determinação de ponto de fusão --- 1 unidade/todos Modo de preparo das soluções: • Ácido Nítrico 2 M (SR) Em um balão volumétrico de 100 mL e em capela, adicionar cerca de 40 mL de água destilada. Adicionar 14,0 mL de Ácido Nítrico 70% (reagente). Completar o volume com água destilada. • Solução padrão de ácido clorídrico (354,6 ppp/mL = 0,01 M) Em um balão volumétrico de 1000 mL e em capela, adicionar cerca de 400 mL de água destilada. Adicionar exatamente 0,85 mL de Ácido Clorídrico (reagente). Completar o volume com água destilada. • Solução padrão de ácido sulfúrico a 1200,8 ppm/2,5 mL = 0,005 M. Em um balão volumétrico de 1000 mL e em capela, adicionar cerca de 400 mL de água destilada. Adicionar exatamente 0,27 mL de Ácido Sulfúrico (reagente). Completar o volume com água destilada. • Nitrato de prata solução reagente Pesar 4,25 g de nitrato de prata P.A. e dissolver em 100 mL de água destilada. • HCl 3 M Em um balão volumétrico de 100 mL e em capela, adicionar cerca de 400 mL de água destilada. Adicionar exatamente 26 mL de Ácido Clorídrico (reagente). Completar o volume com água destilada. • Cloreto de Bário SR Pesar 10 g de cloreto de bário P.A. e dissolver em 100 mL de água destilada. 30 SEMANA N. 3 A) Continuação de resíduo por incineração (cinzas sulfatadas) - No máximo 0,1%. Procedimento: 1) Calcular a porcentagem do resíduo de acordo com a equação abaixo: [(P2 – P1)/P3] x 100 = % cinzas sulfatadas. em que: P1 = Peso do cadinho vazio (em gramas); P2 = Peso do cadinho com cinza após a calcinação e esfriamento; P3 = Peso da amostra inicial. 2) Se o resíduo obtido exceder o limite especificado, adicionar 1 mL de ácido sulfúrico, aquecer e incinerar por 30 minutos adicionais; 3) Repetir este procedimento até que a diferença entre duas pesagens consecutivas seja de, no máximo, 0,5 mg ou até que o resíduo cumpra com o limite estabelecido na monografia individual. Interpretação do resultado: a amostra não deve conter mais do que 0,1% de cinzas sulfatadas. B) Determinação de pH (paracetamol) A medida de pH pode ser uma ferramenta auxiliar útil em ensaios de identificação de matérias-primas de caráter ácido ou básico. A variação do pH de um fármaco pode modificar a estabilidade de uma forma farmacêutica, interferir em sua solubilidade e consequentemente alterar sua farmacocinética. A alteração da absorção de um fármaco está relacionada com seu grau de ionização, o qual depende do pH do meio onde se encontra e de seu pKa. Assim, a compatibilidade com o pH fisiológico é fundamental. Portanto, a importância da medida de pH em formas farmacêuticas se relaciona à eficácia 31 e segurança e atributos como estabilidade, biodisponibilidade e biocompatibilidade. Procedimento: 1) Adicionar paracetamol em cerca de 50 mL de água até observar saturação. 2) Lavar o eletrodo com jatos de água destilada e enxugar com papel; 3) Calibrar o equipamento com as soluções tampão; 4) Lavar o eletrodo com jatos de água destilada e enxugar com papel; 5) Lavar o eletrodo com várias porções da solução amostra; 6) Então medir o pH utilizando potenciômetro adequado; 7) A primeira determinação fornece valor variável, havendo necessidade de proceder a novas leituras. Os valores encontrados posteriormente não deverão variar mais do que 0,05 unidade de pH em três leituras sucessivas. Expressar o resultado como média ± desvio padrão de três medidas sucessivas. Interpretação do resultado: segundo a monografia do paracetamol matéria-prima da quinta edição da Farmacopeia Brasileira, o pH da solução deve estar compreendido entre 5,3 a 6,5. C) Cromatografia em camada delgada (cimetidina) É utilizada para a separação e identificação das substâncias ou componentes da mistura. Em controle de qualidade, também pode ser utilizada para avaliar semi- quantitativamente uma impureza orgânica, através da comparação de qualquer mancha secundária da amostra com um padrão da impureza orgânica na concentração limite permitida para essa impureza. Consisteno sistema cromatográfico em que a separação dos componentes de uma mistura ocorre através da migração diferencial sobre uma fase estacionária composta por uma fina camada de adsorvente aplicado sobre um suporte plano, o qual pode ser constituído de diversos materiais tais como vidro, alumínio ou poliéster. A fase móvel por sua vez é constituída por 32 diversas misturas de solventes e permanece no interior de um recipiente ou cuba de material transparente e inerte, geralmente vidro, permanecendo vedada onde se deposita a cromatoplaca em posição vertical sob uma atmosfera saturada da fase móvel. Procedimento para CIMETIDINA (Realizar todo procedimento em capela): 1) Preparar (dentro da capela) 10 mL de fase móvel constituída de mistura de amônia 13,5 M, metanol e acetato de etila (15:20:65); 2) Adicionar 5 mL de fase móvel em cuba cromatográfica, fechar e deixar saturando por 15 minutos; 3) Aplicar, separadamente, à placa de sílica-gel GF254, 1 gota (utilizando capilar) de cada uma das soluções recentemente preparadas, descritas a seguir. Solução (1): solução de 0,1000 g da amostra de cimetidina em 2,0 mL de metanol. Solução (2): solução de 0,1000 g de padrão de cimetidina em 2,0 mL de metanol. 4) Desenvolver o cromatograma; 5) Remover a placa e deixar secar ao ar; 6) Deixar sob vapor de iodo até obter o máximo contraste das manchas; 7) Examinar sob luz ultravioleta (254 nm). Interpretação do resultado: a mancha principal obtida com a Solução (1) corresponde em posição, cor e intensidade, àquela obtida com a Solução (2). 33 D) Poder rotatório específico (captopril) Muitas substâncias farmacêuticas são opticamente ativas, logo desviam a luz plano-polarizada de modo que a luz transmitida é desviada em um determinado ângulo em relação à incidente. Um dos enantiômeros desvia a luz plano-polarizada para a direita e é chamado de dextrógiro, ou d; o antípoda desvia para a esquerda e é conhecido como levógiro ou l. O ângulo desse desvio é igual em módulo para os enantiômeros, porém com sinais opostos. As propriedades físico-químicas dos enantiômeros como densidade, índice de refração, momento dipolo-dipolo, pontos de ebulição e fusão são idênticas já que o ambiente químico no qual está inserido cada átomo é igual para os enantiômeros. A polarimetria, isso é, a medição do poder rotatório de uma substância com polarímetro é um dos métodos mais prático para distinguir os enantiômeros e, portanto, é um importante critério de identificação, caracterização e de determinação de pureza enantiomérica dos fármacos. A equação geral usada em polarimetria é: [𝛼]𝜆 𝑡 = 100𝛼 𝑙𝑐 Em que: [α] é o poder rotatório específico no comprimento de onda λ e na temperatura t, α é o poder rotatório observado em graus (°), l é o caminho óptico em decímetros e c é a concentração da substância em g por 100 mL. Procedimento para CAPTOPRIL: 1) Preparar solução 2% (p/v) de amostra de captopril em água (25 mL é suficiente); 34 2) Determinar poder rotatório em polarímetro, utilizando caminho óptico de 1 decímetro; 3) Calcular poder rotatório específico [α] de acordo com a equação acima. Interpretação do resultado: de acordo com a monografia do captopril na quinta edição da farmacopeia Brasileira, o poder rotatório específico de solução de captopril em água a 2% (p/v) deve estar compreendido entre –156º a –161º. Referências: FARMACOPEIA BRASILEIRA. 6ª ed. Brasília: Anvisa. 2019. GIL, E. S. – Controle Físico-Químico de Qualidade de Medicamentos. 3ª ed. São Paulo: Pharmabooks, 2010. Questões das atividades práticas da semana número 3. 1) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no ensaio de cinzas sulfatadas (resíduo por incineração) do paracetamol. Descrever os cálculos utilizados e as possíveis fontes de erros experimentais. 2) Por que no ensaio de cinzas sulfatadas (resíduo por incineração), deve- se repetir o procedimento de esfriar, pesar a amostra e incinerar por mais 30 minutos até que a diferença entre duas pesagens sucessivas não seja maior que 0,5 mg? 3) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no ensaio de determinação do pH do paracetamol. Incluir na discussão as possíveis fontes de erros experimentais. 4) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no ensaio de cromatografia em camada delgada da cimetidina. Calcule o Rf para a solução 1 (amostra) e para a solução 2 (padrão). Incluir na discussão as possíveis fontes de erros experimentais. 35 5) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no ensaio de poder rotatório específico do captopril. Incluir na discussão as possíveis fontes de erros experimentais. Por que este ensaio é preconizado apenas para alguns IFAs? Qual a importância deste ensaio para estes IFAs? MATERIAIS NECESSÁRIOS PARA SEMANA N. 3 Material para cinzas sulfatadas (segundo dia) Cadinhos de porcelana contendo os resíduos das amostras incineradas na aula anterior (o cadinho de cada grupo deve estar devidamente identificado e acondicionado em dessecador). 1 unidade/grupo --- Paracetamol Amostrado por cada grupo --- Cimetidina Matéria-prima 0,1000 g/grupo --- Cimetidina SQR (padrão) 0,1000 g/grupo --- Captopril matéria-prima 1,0 g/grupo --- Água destilada 1 pisseta/grupo --- Bastão de vidro 1 unidade/grupo --- Proveta 10 mL 3 unidades/grupo --- Proveta de 50 mL 1 unidade/grupo --- Balão volumétrico de 25 mL 1 unidade/grupo --- H2SO4 SR 10 mL/grupo --- Pinça para cadinho 1 unidade/grupo --- Espátula 2 unidades/grupo --- Béquer 10 mL 2 unidades/grupo --- Béquer de 50 mL ou 100 mL 3 unidades/grupo --- Água destilada 1 pisseta cheia/grupo --- Cromatoplaca com sílica-gel GF254 1 cromatoplaca de 3 cm (largura) x 5 cm (altura)/grupo --- Cuba cromatográfica 1 unidade/grupo --- Amônia 13,5 M 1,5 mL/grupo --- Metanol 10,0 mL/grupo --- Acetato de etila 6,5 mL/grupo --- Tubo capilar 1 unidade/grupo --- Bico de Bunsen --- 1 unidade/todos Tela de amianto --- 1 unidade/todos Cuba contendo iodo --- 1 unidade/todos Revelador de luz ultravioleta --- 1 unidade/todos Micropipeta 2,0 mL de volume fixo + ponteiras --- 1 unidade/todos Béqueres 50 mL --- 3 unidades (1 béquer para cada solvente: amônia 13,5 M, metanol e acetato de etila) Mufla --- 1 unidade/todos Balança analítica previamente calibrada (4 casas) --- 1 unidade/todos pH metro previamente calibrado --- 1 unidade/todos Polarímetro --- 1 unidade/todos 36 SEMANA N. 4 A) Ensaios de identificação e doseamento em matérias-primas Os métodos de identificação são métodos analíticos de natureza qualitativa, destinados à confirmação da identidade da matéria-prima. Independentemente do método utilizado, um ensaio de identificação deve ser específico e confiável, de baixo custo e de fácil realização. Considerando, que um fármaco é o princípio ativo de um medicamento, a sua identificação é um quesito básico para a segurança e eficácia do produto. A.1) Ensaios de identificação através de reações químicas (métodos clássicos) São baseados em reações químicas de importantes grupos funcionais. Apresentam como vantagem a redução de custos com instrumentação. Entretanto, estes ensaios apresentam como desvantagens: menor sensibilidade e não são confirmatórios, mas sim eliminatórios. Procedimento: A 10 mL de uma solução de paracetamol em água a 1% (p/v), adicionar uma gota de cloreto férrico SR. Interpretação do resultado: desenvolve-se coloração azul-violácea. A.2) Ensaios de identificação e doseamento através de métodos instrumentais Métodos instrumentais são podem ser baseados em espectros, cromatogramas ou medidas diretas de propriedades físico-químicas, dependendo da variada complexidade da instrumentaçãoutilizada. Apresentam como vantagem a sensibilidade e reprodutibilidade, sendo o custo referente ao equipamento a principal desvantagem. 37 Exemplos de métodos instrumentais para identificação de matérias-primas: Espectrofotometria na região do UV-visível, Espectrofotometria na região do infravermelho, Ressonância Magnética Nuclear, Espectrometria de Massas, Difratometria de Raios-X, etc. São exemplos de métodos instrumentais para doseamento: métodos espectroscópicos, métodos eletroanalíticos e métodos cromatográficos. Preparo de soluções independentes da amostra: 1) Pesar, exatamente, cerca de 25 mg de paracetamol matéria-prima e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 100 mL; 2) Adicionar 50 mL de hidróxido de sódio 0,1 M, e agitar mecanicamente até observar dissolução completa; 3) Completar o volume do balão de 100 mL com água; 4) Homogeneizar; 5) Transferir 1,0 mL da solução para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com água; 6) Realizar o procedimento em triplicata (preparar 3 balões de 25 mL contendo solução da amostra na concentração final de 10 µg mL-1). Preparo de soluções independentes do padrão: 1) Pesar, exatamente, cerca de 25 mg de padrão (Substância Química de Referência – SQR) e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 100 mL; 2) Adicionar 50 mL de hidróxido de sódio 0,1 M, e agitar mecanicamente até observar dissolução completa; 3) Completar o volume do balão de 100 mL com água; 4) Homogeneizar; 5) Transferir 1,0 mL da solução para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com água; 6) Realizar o procedimento em triplicata (preparar 3 balões de 25 mL contendo solução do padrão na concentração final de 10 µg mL-1). 38 Procedimento para identificação: 1) Realizar o baseline e fazer uma varredura espectral (entre 200 e 400 nm) de um dos padrões preparados e de uma amostra preparada (não descartar o restante das amostras). Interpretação do resultado para identificação: o espectro de absorção no ultravioleta na faixa de 200 nm a 400 nm de solução da amostra exibe máximos e mínimos somente nos mesmos comprimentos de onda de solução similar de paracetamol SQR. Procedimento para doseamento: 1) Medir as absorvâncias das soluções resultantes em 257 nm, utilizando água para ajuste do zero. Interpretação do resultado para doseamento: calcular o teor de C8H9NO2 na amostra a partir das leituras obtidas utilizando a seguinte equação: Em que: Aa= absorbância da amostra; Cp= concentração do padrão; Ap= absorbância do padrão; Ca= concentração da amostra. A amostra deverá apresentar teor médio entre 98,0% 101,0%. Referências: FARMACOPEIA BRASILEIRA. 6ª ed. Brasília: Anvisa. 2019. GIL, E. S. – Controle Físico-Químico de Qualidade de Medicamentos. 3ª ed. São Paulo: Pharmabooks, 2010. 39 Questões das atividades práticas da semana número 4. 1) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no ensaio de identificação do paracetamol através de reação com cloreto férrico SR. 2) O ensaio de identificação do paracetamol através de reação com cloreto férrico SR é inequívoco? Por que? 3) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido na identificação do paracetamol por espectrofotometria na região do UV-visível. Anexar os espectros obtidos com as soluções do padrão e da amostra. 4) Descrever, interpretar e discutir o resultado obtido no doseamento do paracetamol por espectrofotometria na região do UV-visível. Descrever os cálculos utilizados para determinar a média e o desvio padrão relativo (ou coeficiente de variação). Incluir na discussão as possíveis fontes de erros experimentais. 5) Descreva como se deve preparar uma solução padrão de paracetamol na concentração final de 25 µg.mL-1. Considere a massa mínima que a balança analítica disponível no laboratório é capaz de pesar e uma massa máxima de 100 mg para pesagem (para fins de economia). 40 MATERIAIS NECESSÁRIOS PARA SEMANA N. 4 Material Quantidade (caso cada grupo utilize o seu material) Quantidade (para ser utilizado por todos os grupos) Paracetamol Amostrado por cada grupo --- Paracetamol SQR 100 mg/grupo --- Água destilada 1 pisseta/grupo --- Proveta de 10 mL 1 unidade/grupo --- Proveta de 50 mL 1 unidade/grupo --- Béquer 50 mL 3 unidades/grupo --- Cloreto Férrico SR 5 mL/grupo --- Hidróxido de sódio 0,1 M 500 mL/grupo --- Espátula 2 unidades/grupo --- Balão volumétrico 100 mL 6 unidades/grupo --- Balão volumétrico 25 mL 7 unidades/grupo --- Pipeta de Pasteur 1 unidade/grupo --- Micropipeta de 1 mL de volume fixo + ponteiras --- 1 unidade/todos Espectrofotômetro UV/VIS + cubetas de quartzo --- 1 unidade/todos Balança analítica previamente calibrada (4 casas decimais) --- 2 unidades/todos Modo de preparo das soluções: • Cloreto Férrico SR Dissolver 5,25 g de cloreto férrico em 50,0 mL de água. • Hidróxido de sódio 0,1 M Pesar 4,0 g de hidróxido de sódio e dissolver em 1.000 mL de água destilada (realizar procedimento em capela). 41 SEMANA N. 5 Validação de método analítico - seletividade O primeiro parâmetro de validação a ser testado será a seletividade, que deve ser demonstrada por meio da capacidade de um método analítico de identificar ou quantificar o analito de interesse, inequivocamente, na presença de componentes que podem estar presentes na amostra, como impurezas, diluentes e componentes da matriz. (BRASIL, 2017). A partir desta aula, todos os grupos irão realizar o mesmo procedimento. Cada grupo realizará uma validação de método para análise quantitativa de nimesulida comprimidos (100 mg). PROCEDIMENTO PARA AVALIAÇÃO DE SELETIVIDADE DE MÉTODO: 1) Preparo de soluções independentes da SQR de nimesulida: Realizar procedimento em triplicata: a) Pesar 25 mg de nimesulida SQR e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 50 mL; b) Adicionar cerca de 40 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e agitar até observar completa solubilização; c) Completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M); d) Transferir quantitativamente 1,0 mL da solução para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M); e) Proceder a varredura espectral de 200 a 800 nm em uma das soluções e guardar o restante do balão e os outros dois balões não analisados. 42 2) Preparo de placebo dos comprimidos de nimesulida: Supondo que o medicamento para o qual vocês deverão validar um método analítico é a nimesulida comprimidos (100 mg), contendo os seguintes excipientes farmacêuticos: lactose (46%), estearato de magnésio (5%), celulose microcristalina (35%), lauril sulfato de sódio (2%), amido (8%), polivinilpirrolidona (4%), cada grupo deverá preparar 3,0 gramas de placebo. 3) Preparo de solução do placebo dos comprimidos de nimesulida: a) Supondo que o peso médio dos comprimidos é 390,0 mg, cada grupo deverá pesar a quantidade de placebo na formulação que corresponde a 25 mg de nimesulida. Esta quantidade de placebo pode ser obtida através da equação: 100 mg de nimesulida ----- 290 mg de placebo 25 mg de nimesulida ----- X X = 72,5 mg de placebo b) Transferir quantitativamente 72,5 mg do placebo de nimesulida para balão volumétrico de 50 mL; c) Adicionar cerca de 40 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e agitar pelo mesmo tempo no qual a nimesulida SQR foi agitada (o placebo não deverá necessariamente se solubilizar completamente); d) Completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M) (solução mãe de placebo); e) Transferir quantitativamente 1,0 mL da solução mãe de placebo para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M);43 f) Proceder a varredura espectral de 200 a 800 nm em uma das soluções e guardar o restante do balão e os outros dois balões não analisados; 4) Preparo de soluções independentes da SQR de nimesulida adicionadas de placebo: Realizar procedimento em triplicata: a) Pesar 25 mg de nimesulida SQR e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 50 mL; b) No mesmo balão, adicionar 72,5 mg do placebo de nimesulida; c) Adicionar cerca de 40 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e agitar pelo mesmo tempo no qual a nimesulida SQR foi agitada (o placebo não deverá necessariamente se solubilizar completamente); d) Completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M); e) Transferir quantitativamente 1,0 mL da solução para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M). Interpretação dos resultados: 1) Primeiramente, cada grupo deverá observar o(s) comprimento(s) de onda de máxima absorção da nimesulida onde o placebo não apresenta absorção, e definir um comprimento de onda para análises posteriores. 2) Posteriormente, cada grupo deverá realizar a leitura dos três padrões e dos três padrões adicionados de placebo no comprimento de onda definido e observar se o padrão adicionado de placebo não apresentou aumento de absorção no comprimento de onda selecionado. Observações: 1) Cuidado para não contaminar o placebo com padrão; 2) As condições definidas nesta aula serão utilizadas nos ensaios de validação posteriores. 44 Referências: BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n°166, de 24 de julho de 2017. Dispõe sobre a validação de métodos analíticos e dá outras providências. 2017. Brasília, DF: Diário Oficial da União, 25 jul. 2017. FARMACOPEIA BRASILEIRA. 6ª ed. Brasília: Anvisa. 2019. Questões das atividades práticas da semana número 5. 1) Qual(is) o(s) comprimento(s) de onda de máxima absorção da nimesulida? 2) Qual o comprimento de onda selecionado? Justifique e anexe o espectro de varredura do padrão e dos excipientes. 3) Pode-se dizer que o método é seletivo nas condições testadas na aula prática? Justifique. 4) A partir das leituras dos três padrões e dos três padrões adicionados de placebo no comprimento de onda definido, foi observado que o padrão adicionado de placebo apresentou aumento de absorção no comprimento de onda selecionado? Descreva os resultados. 5) Caso o método não apresente seletividade, quais procedimentos poderiam ser adotados? 45 MATERIAIS NECESSÁRIOS PARA SEMANA N. 5 Material Quantidade (caso cada grupo utilize o seu material) Quantidade (para ser utilizado por todos os grupos) Nimesulida SQR 150 mg/grupo --- Balão volumétrico 50 mL 7 unidades/grupo --- Balão volumétrico de 25 mL 7 unidades/grupo --- Solução de NaOH 0,1 M 700 mL/grupo --- Espátula 2 unidades/grupo --- Lactose 1 g/grupo --- Estearato de magnésio 0,1 g/grupo --- Celulose microcristalina 1 g/grupo --- Lauril sulfato de sódio 0,1 g/grupo --- Amido 0,1 g/grupo --- Polivinilpirrolidona 0,1 g/grupo --- Frascos de plástico 1 unidade/grupo --- Béquer de 50 ou 100 mL 7 unidades/grupo --- Béquer de 100 mL --- 1 unidade/todos (ao lado da solução de NaOH 0,1 M) Pipeta de Pasteur --- 1 unidade/todos (ao lado da solução de NaOH 0,1 M) Micropipeta de 1 mL de volume fixo + ponteiras --- 1 unidade/todos Espectrofotômetro UV/VIS + cubetas de quartzo --- 1 unidade/todos Balança analítica previamente calibrada (4 casas decimais) --- 2 unidades/todos Modo de preparo das soluções: • Hidróxido de sódio 0,1 M Pesar 4 g de hidróxido de sódio e dissolver em 1.000 mL de água destilada (realizar procedimento em capela). 46 SEMANA N. 6 A) Validação de método analítico - linearidade A linearidade de um método deve ser demonstrada por meio da sua capacidade de obter respostas analíticas diretamente proporcionais à concentração de um analito em uma amostra (BRASIL, 2017). Para o estabelecimento da linearidade, deve-se utilizar, no mínimo, 5 (cinco) concentrações diferentes da SQR para as soluções preparadas em, no mínimo, triplicata (BRASIL, 2017). As soluções utilizadas para avaliação da linearidade devem ser preparadas de maneira independente, podendo ser utilizadas soluções diluídas de uma mesma solução mãe da SQR (BRASIL, 2017). Por preparo independente, entende-se que, para cada réplica, deve ser feita uma pesagem. PROCEDIMENTO PARA AVALIAÇÃO DE LINEARIDADE DE MÉTODO: Preparo da solução mãe: Realizar o procedimento em triplicata (amostras independentes): a) Pesar 20 mg de nimesulida SQR e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 200 mL; b) Adicionar cerca de 160 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e agitar até observar completa solubilização. c) Completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M). Concentração: 100 µg.mL-1. Soluções de nimesulida SQR a 16 µg mL-1 (80% da concentração teórica do teste): 47 a) Transferir, utilizando bureta calibrada, 4,0 mL de cada solução mãe de nimesulida SQR para balão volumétrico de 25 mL; b) Completar o volume com hidróxido de sódio 0,1 M. Soluções de nimesulida SQR a 18 µg mL-1 (90% da concentração teórica do teste): a) Transferir, utilizando bureta calibrada, 4,5 mL de cada solução mãe de nimesulida SQR para balão volumétrico de 25 mL; b) Completar o volume com hidróxido de sódio 0,1 M. Soluções de nimesulida SQR a 20 µg mL-1 (100% da concentração teórica do teste): a) Transferir, utilizando bureta calibrada, 5,0 mL de cada solução mãe de nimesulida SQR para balão volumétrico de 25 mL; b) Completar o volume com hidróxido de sódio 0,1 M. Soluções de nimesulida SQR a 22 µg mL-1 (110% da concentração teórica do teste): a) Transferir, utilizando bureta calibrada, 5,5 mL de cada solução mãe de nimesulida SQR para balão volumétrico de 25 mL; b) Completar o volume com hidróxido de sódio 0,1 M. Soluções de nimesulida SQR a 24 µg mL-1 (120% da concentração teórica do teste): a) Transferir, utilizando bureta calibrada, 6,0 mL de cada solução mãe de nimesulida SQR para balão volumétrico de 25 mL; b) Completar o volume com hidróxido de sódio 0,1 M. Cada grupo deverá realizar as leituras das 15 soluções preparadas e devidamente identificadas em espectrofotômetro, no comprimento de onda definido no estudo de seletividade. 48 Interpretação dos resultados: plotar os valores individualmente em um gráfico de dispersão. Calcular o coeficiente de correlação (r). O resultado obtido comprova a linearidade do método, de acordo com a Resolução RDC 166/2017, que estabelece o critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) de = 0,99? B) Validação de método analítico - repetibilidade A precisão deve avaliar a proximidade entre os resultados obtidos por meio de ensaios com amostras preparadas conforme descrito no método analítico a ser validado (BRASIL, 2017). As amostras para avaliação da precisão devem ser preparadas de maneira independente desde o início do procedimento descrito no método (BRASIL, 2017). Por preparo independente, entende-se que, para cada réplica, deve ser feita uma pesagem. A repetibilidade deve avaliar as amostras sob as mesmas condições de operação, mesmo analista e mesma instrumentação. PROCEDIMENTO PARA AVALIAÇÃO DE REPETIBILIDADE: Realizar o procedimento em sextuplicata: a) Pesar 25 mg de nimesulida SQR e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 50 mL; b) No mesmo balão volumétrico, adicionar 72,5 mg do placebo preparado na aula de seletividade; c) Adicionar cerca de 40 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e agitar; d) Completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M); e) Transferir, utilizandopipeta volumétrica ou micropipeta, 1,0 mL para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com hidróxido de sódio 0,1 M. Cada grupo deverá realizar as leituras das seis soluções preparadas e devidamente identificadas em espectrofotômetro, no comprimento de onda definido no estudo de seletividade. 49 Interpretação dos resultados: calcular o desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV%) entre as seis leituras obtidas no estudo. A RDC 166 não estabelece um limite para o DPR (ou CV).No entanto, rotineiramente, são aceitos valores menores do que 2,0%. Referências: BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n°166, de 24 de julho de 2017. Dispõe sobre a validação de métodos analíticos e dá outras providências. 2017. Brasília, DF: Diário Oficial da União, 25 jul. 2017. FARMACOPEIA BRASILEIRA. 6ª ed. Brasília: Anvisa. 2019. Questões das atividades práticas da semana número 6. 1) Descrever os resultados do estudo de linearidade em uma tabela, descrever o gráfico de dispersão obtido e a equação da reta, indicando os valores do coeficiente angular e do coeficiente linear. 2) Calcular o coeficiente de correlação (r) do estudo de linearidade. O resultado obtido comprova a linearidade do método, de acordo com a Resolução RDC 166/2017, que estabelece o critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) de = 0,99? 3) Descrever como se deve preparar soluções de nimesulida SQR nas concentrações de 50, 60, 70, 80 e 90 µg mL-1 para um estudo de linearidade. Considere a massa mínima que a balança analítica disponível no laboratório é capaz de pesar e uma massa máxima de 100 mg para pesagem (para fins de economia). 4) Descrever os resultados do estudo de repetibilidade e calcular o desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV%) entre as seis leituras obtidas. O resultado obtido comprova a precisão intra-corrida do 50 método? A RDC 166 não estabelece um limite para o DPR (ou CV). No entanto, rotineiramente, são aceitos valores menores do que 2,0%. 5) Quais as possíveis fontes de erros experimentais nos estudos de linearidade e de repetibilidade? MATERIAIS NECESSÁRIOS PARA SEMANA N. 6 Material Quantidade (caso cada grupo utilize o seu material) Quantidade (para ser utilizado por todos os grupos) Nimesulida SQR 250 mg/grupo --- Placebo Preparado pelos grupos na aula de seletividade --- Balão volumétrico 200 mL 3 unidades/grupo --- Balão volumétrico 50 mL 6 unidades/grupo --- Balão volumétrico de 25 mL 21 unidades/grupo --- Solução de NaOH 0,1 M 1500 mL/grupo --- Espátula 2 unidades/grupo --- Béquer de 50 ou 100 mL 9 unidades/grupo --- Bureta de 10 mL ou de 25 mL 1 unidade/grupo --- Suporte para bureta 1 unidade/grupo --- Micropipeta de volume fixo de 1 mL + ponteiras --- 1 unidade/todos Béquer de 100 mL --- 1 unidade/todos (ao lado da solução de NaOH 0,1 M) Pipeta de Pasteur --- 1 unidade/todos (ao lado da solução de NaOH 0,1 M) Espectrofotômetro UV/VIS + cubetas de quartzo --- 1 unidade/todos Balança analítica previamente calibrada (4 casas decimais) --- 2 unidades/todos Modo de preparo das soluções: • Hidróxido de sódio 0,1 M Pesar 4,0 g de hidróxido de sódio e dissolver em 1.000 mL de água destilada (realizar procedimento em capela). 51 SEMANA N. 7 A) Validação de método analítico - exatidão A exatidão de um método analítico deve ser obtida por meio do grau de concordância entre os resultados individuais do método em estudo em relação a um valor aceito como verdadeiro (BRASIL, 2017). A exatidão deve ser verificada a partir de, no mínimo, 9 (nove) determinações, contemplando o intervalo linear do método analítico, ou seja, 3 (três) concentrações: baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas em cada nível (BRASIL, 2017). As amostras para avaliação da exatidão devem ser preparadas de maneira independente, podendo ser utilizadas soluções diluídas de uma mesma solução mãe da SQR (BRASIL, 2017). Por preparo independente, entende-se que, para cada réplica, deve ser feita uma pesagem. PROCEDIMENTO PARA AVALIAÇÃO DE EXATIDÃO DE MÉTODO: Observação: Este procedimento deve ser realizado de forma cuidadosa e atenciosa, pois frequentemente são observados erros sistemáticos na condução deste tipo de experimento. 1) Preparo de soluções independentes da SQR de nimesulida: Realizar procedimento em triplicata: a) Pesar 25 mg de nimesulida SQR e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 50 mL; 52 b) Adicionar cerca de 40 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e agitar até observar completa solubilização; c) Completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M); d) Transferir quantitativamente 1,0 mL para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M). 2) Preparo de soluções independentes de nimesulida SQR adicionadas de placebo na concentração baixa (80% = 16 µg mL-1) Realizar o procedimento em triplicata: a) Pesar 20 mg de nimesulida SQR e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 50 mL; b) No mesmo balão volumétrico, adicionar 72,5 mg do placebo preparado na aula de seletividade; c) Adicionar cerca de 40 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e agitar pelo mesmo tempo no qual a nimesulida SQR foi agitada (o placebo não deverá necessariamente se solubilizar completamente); d) Completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M); e) Transferir, utilizando pipeta volumétrica ou micropipeta, 1,0 mL para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com hidróxido de sódio 0,1 M. 3) Preparo de soluções independentes de nimesulida SQR adicionadas de placebo na concentração média (100% = 20 µg mL-1) Realizar o procedimento em triplicata: a) Pesar 25 mg de nimesulida SQR e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 50 mL; b) No mesmo balão volumétrico, adicionar 72,5 mg do placebo preparado na aula de seletividade; c) Adicionar cerca de 40 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e agitar pelo mesmo tempo no qual a nimesulida SQR foi agitada (o placebo não deverá necessariamente se solubilizar completamente); d) Completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M); 53 e) Transferir, utilizando pipeta volumétrica ou micropipeta, 1,0 mL para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com hidróxido de sódio 0,1 M. 4) Preparo de soluções independentes de nimesulida SQR adicionadas de placebo na concentração alta (120% = 24 µg mL-1) Realizar o procedimento em triplicata: a) Pesar 30 mg de nimesulida SQR e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 50 mL; b) No mesmo balão volumétrico, adicionar 72,5 mg do placebo preparado na aula de seletividade; c) Adicionar cerca de 40 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e agitar pelo mesmo tempo no qual a nimesulida SQR foi agitada (o placebo não deverá necessariamente se solubilizar completamente); d) Completar o volume com o mesmo solvente (NaOH 0,1 M); e) Transferir, utilizando pipeta volumétrica ou micropipeta, 1,0 mL para balão volumétrico de 25 mL e completar o volume com hidróxido de sódio 0,1 M. Cada grupo deverá realizar as leituras das doze soluções preparadas e devidamente identificadas em espectrofotômetro, no comprimento de onda definido no estudo de seletividade. Interpretação dos resultados: calcular a exatidão do método, em cada nível (baixo, médio e alto), de acordo com a equação: 𝐸𝑋𝐴𝑇𝐼𝐷Ã𝑂 (%) = 𝐶𝑂𝑁𝐶𝐸𝑁𝑇𝑅𝐴ÇÃ𝑂 𝐸𝑋𝑃𝐸𝑅𝐼𝑀𝐸𝑁𝑇𝐴𝐿 𝐶𝑂𝑁𝐶𝐸𝑁𝑇𝑅𝐴ÇÃ𝑂 𝑇𝐸Ó𝑅𝐼𝐶𝐴 𝑋 100 O resultado obtido comprova a exatidão do método? A RDC 166 não estabelece um limite. No entanto, rotineiramente, são aceitos valores entre 98,0 a 102,0%? B) Validação de método analítico - precisão intermediária 54
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