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Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 1 de 17 Elaborado por: Luana Carolina Siqueira Julia Freire Allemão Ferrão Camila Lebani Maluf Larissa Alexsandra Felix Aprovado por: Francisco Duque de Mesquita Neto N° de Revisão:4ª Data: 2020 Revisado por: Déborah Braga Resende 1. Introdução 1.1 Sinonímia Exame Coprológico (funcional e parasitológico). 1.2 Objetivo Padronizar as técnicas de análise laboratoriais para minimizar erros entre os executores do exame. 1.3. Alcance Este POP aplica-se aos médicos veterinários residentes em patologia clínica, técnicos e docentes do laboratório de patologia clínica da Universidade Federal de Lavras (UFLA) e estagiários do setor. 1.4. Divulgação Este Procedimento Operacional Padrão (POP) terá sua cópia impressa e disponibilizada na bancada de execução do exame e em arquivo no computador do laboratório. 1.5 Definição Exame laboratorial para avaliar enfermidades parasitárias do trato gastrointestinal, estado do sistema digestório, presença de corpo estranho, hemorragias ocultas e informações sobre a dieta do animal. Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 2 de 17 1.6 Importância clínica Os animais podem albergar diversas espécies de helmintos e protozoários gastrintestinais que, além de poderem prejudicar a sanidade desses animais, eliminam nas fezes formas que contaminam o ambiente e posteriormente o homem, especialmente crianças. Mesmo portadores de infecções subclínicas eliminam formas evolutivas de parasitas que, sendo em sua maioria resistentes às condições ambientais, fazem com que essa contaminação seja cumulativa. A descoberta do agente envolvido permite realizar a terapia e o controle de forma mais eficiente e adequada. A avaliação das características gerais das fezes permite ter uma ideia geral do funcionamento do trato gastrointestinal, identificando possíveis anormalidades. O teste coprológico funcional atua como um teste de triagem para avaliação da função pancreática exócrina e síndrome de má absorção (WESTERMARCK; WIBERG, 2003). Princípio do teste: O princípio do teste coproparasitológico dependerá da técnica utilizada, esta varia de acordo com o agente a ser pesquisado, podendo ser ovos leves ou pesados, larvas, entre outros estágios do ciclo evolutivo do parasito. Já o princípio do teste coprológico funcional é baseado na digestão de filme radiográfico. 2. Amostra: As fezes de animais de pequeno porte e aves devem ser acondicionadas em frascos coletores estéreis. No caso de grandes animais, como a coleta é realizada diretamente do reto, pode ser utilizada como recipiente, a própria luva de coleta. Amostras mal coletadas, acondicionadas incorretamente ou mal identificadas não serão recebidas, uma vez que estes fatores comprometem o processamento da amostra. Se o exame não for enviado ao laboratório após a coleta, podem ser usados alguns preservativos: Frio (24 a 48 horas); Formol 5 a 10 % (1 parte para 4 de fezes. Tem a desvantagem de alterar morfologia de protozoários e estrutura de larvas); MIF (Mertiolate, Iodo, Formol). Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 3 de 17 2.1 Tipo de amostra Fezes (respeitando a quantidade mínima necessária para cada teste). 2.2 Coleta: Caninos e Felinos: Sondas plásticas ou colher a porção superior do bolo fecal defecado naturalmente, que não teve contato com o solo. Equinos, bovinos, caprinos e ovinos: Diretamente do reto. Aves: Forrar gaiola com papel para que seja coletado fezes de 24 horas, para se obter um volume maior e mais fidedigno. Devem ser recolhidas as fezes com aspecto fresco e com menos sujidades. 2.3 Envio de material ao laboratório: O pedido do exame deve conter os dados do animal: nome, sexo, espécie, idade e raça; os dados do tutor: número da ficha e nome completo; dados do veterinário; clínica (quando houver), carimbo com nome e CRMV, e assinatura, além do horário e forma de coleta. O exame a ser solicitado deve ser assinalado de acordo com os campos do pedido, no caso do exame coproparasitológico, esta opção encontra-se no campo “Coprologia”. O teste da tripsina fecal pode ser requisitado informando no campo “Outros”. Os campos a serem preenchidos então destacados pelos quadrados vermelhos na Figura 1. Mediante a falta de quaisquer destas informações o pedido não deve ser aceito, sendo solicitado um novo preenchimento. Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 4 de 17 Figura 1.Folha de requerimento de exames do laboratório de Patologia Clínica do Hospital Veterinário da UFLA Fonte: Laboratório de Patologia Clínica- UFLA 3. Equipamentos, reagentes e materiais: Equipamentos Balança de precisão; Microscópio; Centrífuga Excelsa Baby II Modelo 206 – R. Reagentes Solução Salina Hipersaturada; Solução fisiológica 0,9 %; Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 5 de 17 Água morna; Lugol; Sulfato de zinco; Solução de Sheather; Bicarbonato de sódio 5%. Materiais Becker; Proveta; Pipeta; Cálice de Sedimentação; Gaze; Peneira; Câmara de Mcmaster; Lâmina; Lamínula; Alça de platina; Fita de sangue oculto; Filme radiográfico; Tubo de Falcon 15 ml 4. Técnicas: As técnicas adotadas para os procedimentos descritos seguem as metodologias propostas por Ferreira Neto (1981), Urquhart et al. (1998) e Monteiro (2011). 4.1 Exame Macroscópico/Físico 4.1.1Consistência e Forma Equinos: Forma arredondada e consistência firme. Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 6 de 17 Bovinos: Forma cilíndrica ao sair do reto, ao cair forma uma massa pastosa arredondada, uniformemente distribuída, por serem de menor consistência. Ovinos e caprinos: Forma ovóide, de consistência endurecida. Carnívoros e onívoros: Forma cilíndrica, de consistência semi-pastosa. 4.1.2 Volume Varia com a quantidade de alimento ingerido e com o número de defecações. 4.1.3 Cor Depende da alimentação. Nos herbívoros a coloração tende a ser esverdeada devido à presença da clorofila. Nos carnívoros e onívoros a coloração é amarronzada, devido à estercobilina. Nos animais lactentes tende ser amarelada devido o leite. Coloração vermelho tijolo é encontrada principalmente nos casos de aumento de fluxo biliar. Coloração escura pode ser observada nos casos de icterícia hemolítica e em caso de melena. Sangue vivo é observado na presença de hematoquezia. Coloração acinzentada ou branco-acinzentada sugere insuficiência pancreática ou acolia produzida por icterícia obstrutiva. 4.1.4 Odor Nos herbívoros geralmente não é repugnante, nos casos de fermentações intestinais ou pus e fragmentos de tecidos necróticos, pode se tornar fétido. Em carnívoros e onívoros tende a ser pútrido e nauseabundo devido à presença de resíduos mal digeridos que fermentam e se putrefazem no trato digestório. Fezes anormalmente fétidas ocorrem nas diarreias infecciosas e diminuição do fluxo biliar. 4.1.5 Viscosidade Alterada de acordo com a presença de muco. Nas fermentações intestinais, as fezes apresentam-se pouco viscosas; por outro lado, noscasos de putrefação e colites, ocorre aumento da viscosidade. Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 7 de 17 4.1.6 Elementos anormais Muco: indicativo de processo irritativo ou inflamatório do trato gastrointestinal. Se do intestino delgado apresenta-se como pequenos grumos ou filamentos misturados às fezes. Se intestino grosso, freqüentemente apresenta-se cobrindo a superfície das fezes. Grandes lâminas (moldes intestinais) indicam presença de fibrina. Sangue: pode ser melena, hematoquezia ou micromelena, o último é sugestivo de coccidiose em bovinos jovens e enterite crônica em bovinos adultos. Está associada a hemorragias causadas por úlceras, corpo estranho, tumores, traumas, parasitismo, entre outras. Corpos estranhos: presentes em animais portadores de verminoses ou distúrbios nutricionais, metabólicos e/ou comportamentais, que podem levar a perversão do apetite. Alimentos não digeridos: presente quando há disfunção digestória ou aumento do peristaltismo. Podem ser encontradas fibras musculares, gorduras, detritos vegetais, entre outros. 4.2 Exame Coproparasitológico 4.2.1 Método direto O método direto é prático e rápido e a única forma de se observar trofozoítos ao vivo (utilização de solução salina isotônica). É útil para fezes de aves pequenas e répteis e não indicada para herbívoros, devido à presença de fibras obscurecendo a visualização dos parasitas. Essa técnica tem como desvantagem resultados falso negativos devido à utilização de quantidades não representativas de fezes, podendo detectar-se somente infecções com alta carga parasitária, além de sobreposição por sujidades. Segue abaixo os passos da técnica e uma figura de parte do processo (Figura 2) 1. Pegar uma lâmina limpa e seca. 2. Pingar em sua superfície 2 a 3 gotas de água ou solução salina isotônica (NaCl 0,9%) ou lugol*. 3. Colocar uma pequena quantidade de fezes sobre a lâmina e com auxílio de um bastão homogeneizar as fezes com a solução. Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 8 de 17 4. Cobrir com lamínula e examinar no microscópio. *O Lugol é indicado para pesquisa de cistos e protozoários, pois estes são corados, facilitando a visualização. Fonte: Imagens Google 4.2.2 Métodos de Flutuação Método para flutuação de ovos de helmintos. Há pouca sujidade para obscurecer a visualização do parasita. Não flutuam ovos de trematódeos e alguns ovos de vermes chatos. Método inadequado para fezes gordurosas. 4.2.2.1 Método de Willis Método para flutuação de ovos de helmintos e oocistos de coccídeos. Distorce o cisto de Giardia. É uma técnica qualitativa, utilizada principalmente para pequenos animais, mas é um bom método para herbívoros. Segue abaixo os passos da técnica e uma figura de parte do processo (Figura 3). 1. Em um Becker dissolver 2 gramas de fezes com solução salina saturada ou de açúcar; 2. Coar a solução com o auxílio de gaze e peneira, despejar a solução em um Becker limpo; 3. Preencher o Becker até a boca com solução salina saturada e colocar sobre ele uma lâmina limpa e seca; Figura 2. Técnica do exame direto de fezes com a utilização de solução salina isotônica em um campo e lugol em outro Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 9 de 17 4. Após aproximadamente 15 minutos, retirar lâmina, cobrir com lamínula e examinar no microscópio; 5. Como a técnica é qualitativa, o resultado será positivo ou negativo para o parasito encontrado. *Observação: Deve ser utilizado ao todo 20 mL de solução salina saturada. Figura 3. Representação esquemática dos passos do método de Willis Fonte: do autor. 4.2.2.2 Centrífugo-flutuação em Sulfato de Zinco (Método de Faust) Método para flutuação de ovos de helmintos e melhor método para cistos de protozoários, especialmente Giardia (COGNIALLI, RAIMUNDO et al., 2016). Segue abaixo os passos da técnica. 1. Dissolver 2 gramas de fezes em 15 ml de sulfato de zinco, homogeneizar e passar através de gaze para um tubo cônico; Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 10 de 17 2. Centrifugar por 5 minutos, a 1500 rpm; 3. Retirar uma amostra da película sobrenadante, com o auxílio de uma alça de platina, e colocar em lâmina limpa e seca; 4. Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio. *Pode ser adicionada uma gota de lugol para facilitar a visualização de cistos. **Se a amostra contiver uma quantidade grande de gordura ou outro material que flutue em água, é possível lavar a amostra antes de fazer a flutuação. Ao centrifugar a mistura água (sem ZnSO4) -fezes, os ovos afundarão, mas a gordura permanecerá flutuante. Depois da centrifugação, deve-se decantar o sobrenadante e acrescentar a solução de ZnSO4. Homogeneizar bem e proceder a partir do passo 2. 4.2.2.3 Ovos por grama de fezes / Oocistos por grama de fezes (OPG / OOPG) Método qualitativo que possibilita calcular o número de ovos por grama de fezes. Indicado para herbívoros. Bom para identificação de Strongyloides, Trichuris, Moniezia e Eimeria. Segue abaixo os passos da técnica e uma figura de parte do processo (Figura 4). 1. Ligar balança, colocar uma placa de Petri sobre a mesma e tarar; 2. Homogeneizar as fezes; 3. Pesar 2 gramas de fezes; 4. Dissolver as fezes com 60 ml de solução salina hipersaturada e filtrar por meio de uma gaze e peneira em um cálice de sedimentação; 5. Homogeneizar a solução; 6. Preencher com auxílio de uma pipeta os dois compartimentos da câmara de Mcmaster; 7. Aguardar 15 minutos; 8. Examinar no microscópio na objetiva de 10x; 9. Contar os ovos de ambos os compartimentos da câmara e multiplica por 100, o resultado será expresso em ovos por grama de fezes. Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 11 de 17 Figura 4.Representação esquemática dos passos do método de OPG/OOPG Fonte: do autor. 4.2.3 Métodos de Sedimentação 4.2.3.1 Método de Hoffmann, Pons e Janer (HPJ) – Sedimentação Simples Permite detectar a presença de ovos, larvas de helmintos e cistos de protozoários. Não indicado para herbívoros. Segue abaixo os passos da técnica e uma figura de parte do processo (Figura 5). 1. Diluir 2 a 5 gramas de fezes em 200 mL de solução fisiológica ou em água, e através de gaze filtrar diretamente para um cálice de sedimentação; 2. Deixar em repouso por 15 minutos; Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 12 de 17 3. Decantar o líquido sobrenadante e adicionar ao sedimento 200 mL de solução fisiológica ou em água; 4. Deixar em repouso por 15 minutos; 5. Decantar o líquido sobrenadante; 6. Coletar com pipeta algumas gotas do sedimento e colocar entre lâmina e lamínula para observar no microscópio; 7. Se o primeiro resultado for negativo, repetir o teste até três vezes. Figura 5.Representação esquemática dos passos do método de HPJ Fonte: do autor 4.2.3.2 Método de Baermann Método utilizado para extração de fases larvais vivas de nematódeos nas fezes. Baseado no hidrotropismo e termotropismo das larvas. Podem ser encontradas larvas de Strongyloides stercoralis, Ancylostoma duodenale e Dictyocaulus viviparus. Segue abaixo os passos da técnica e uma figura de parte do processo (Figura6). Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 13 de 17 1. Colocar um funil em um suporte e conectar sua extremidade a um tubo de borracha, fechar este com o auxílio de um grampo; 2. Colocar uma peneira com gaze ou papel filtro, sobre o funil, e então colocar 10 gramas de fezes recentes, retirada diretamente do reto do animal; 3. Encher com água a morna (40-45ºC) até cobrir as fezes, evitando-se que se formem bolhas de ar; 4. Descansar por 12 horas (as larvas migrarão das fezes para a água morna, depositando-se no fundo); 5. Remover o grampo, escoar de 2 a 5 mL do sedimento em uma placa de Petri; 6. Colocar o sedimento entre lâmina e lamínula para examinar no microscópio. *Esta técnica já foi adaptada e modificada, podendo-se substituir o funil e a borracha por um cálice de sedimentação ou um becker. Após 2 horas de descanso, o líquido é centrifugado a 1500 rpm por 5 minutos, o sobrenadante é removido e o sedimento examinado ao microscópio (LIMA; DELGADO; CHAVES, 1959; WILLCOX; COURA, 1989). Figura 6.Representação esquemática dos passos do método de Baermann Fonte: Imagens Google Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 14 de 17 4.2.4 Xenodiagnóstico Esta técnica é utilizada para diagnóstico de habronemose gástrica dos equídeos. Segue abaixo os passos da técnica . 1. Colocar fezes coletadas diretamente do reto do animal em um frasco de boca larga até a metade; 2. Colocar um pouco de água de acordo com a consistência das fezes; 3. Depositar sobre as fezes 5 a 8 ovos de Musca domestica; 4. Fechar boca do frasco com papel celofane ou outro papel que seja resistente e fazer pequenas perfurações para ventilação; 5. Colocar o material em estufa a 32°C até o aparecimento das moscas (aproximadamente uma semana); 6. Esmagar uma ou mais moscas entre duas lâminas e examinar em pequeno aumento no microscópio; 7. Em caso positivo, encontra-se larvas de Habronema. 4.3 Exame Coprológico Funcional 4.3.1 Teste da Tripsina Fecal Esta técnica é utilizada como um teste de triagem para diagnóstico de insuficiência pancreática exócrina (WESTERMARCK; WIBERG, 2003). Seguem abaixo os passos da técnica. 1. Homogeneizar as fezes; 2. Separar três tubos de Falcon; 3. Tubo 1: Controle negativo- 10 partes de solução de bicarbonato de sódio 5%; 4. Tubo 2. Controle positivo- 9 partes de solução de bicarbonato de sódio5% + 1 grama de fezes de animal sadio; 5. Tubo 3. Animal teste- 9 partes de solução de bicarbonato de sódio 5% + 1 grama de fezes de animal a ser avaliado. Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 15 de 17 6. Adicionar fitas de filme radiográfico em cada um dos tubos; 7. Incubar os tubos em banho maria 37°C por uma hora; 8. Retirar os tubos do banho maria 37°C e avaliar os filmes radiográficos; 9. Interpretação do teste: Quando ocorre a digestão, a parte do filme radiográfico exposto às fezes deixa de ser enegrecido e passa a ter um tom azulado, desta forma, é confirmada a atividade proteolítica nas fezes, o que é esperado de um animal saudável. 5. Laudo Para a interpretação do exame e diagnóstico do parasito, será utilizado como material de apoio o Atlas de Parasitologia (SILVEIRA et al., 2019), o material da Merial e a Apostila de Patologia Clínica (FERREIRA NETO, 1981). Segue abaixo o modelo do laudo. COPROLOGIA CARACTERÍSTICAS GERAIS Volume: Cor: Odor: Forma e Consistência: Viscosidade: Elementos anormais: Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 16 de 17 MÉTODO: Resultado: 6. Referências Metodologia interna Material da Merial COGNIALLI, RAIMUNDO, R. C.; HAIDAMAK, J.; VAYEGO, S. A.; KLISIOWICZ, D. do R. Limiar de positividade e sensibilidade dos métodos de Faust et al. e Lutz para detecção de cistos de Giardia duodenalis. Revista Brasilleira de Anállises Clínicas, v. 49, n. 1, p. 100–104, 2016. FERREIRA NETO, J. M.; VIANA, E. S.; MAGALHÃES, L. . Patologia Clínica Veterinária. 2. ed. Belo Horizonte, MG: Rabelo Brasil, 1981. LIMA, J. P.; DELGADO, P.; CHAVES, D. Importância do método de Baermann no diagnóstico da estrogiloidíase. Anais da Faculdade de Medicina de Porto Alegre, v. 21, n. 2, p. 34–38, 1959. Resultado de amostra negativa não descarta a possibilidade de o paciente apresentar infecção parasitária. Recomendações: quantidade mínima de 5 (cinco) gramas de fezes por exame. Caso não seja processado imediatamente o material deve ser conservado refrigerado, não congelar. Laboratório de Patologia Clínica DMV- UFLA Procedimento Operacional Padrão -POP Código POP- GQ 001 Edição 4ª Fezes Data 2020 Página Página 17 de 17 MONTEIRO, S. G. Técnicas Laboratoriais. In: MONTEIRO, S. G. (Ed.). Parasitologia na Medicina Veterinária. 1. ed. São Paulo; SP: ROCA, 2011. p. 301–313. SILVEIRA, J. A. G.; ARAÚJO, R. N.; PEREIRA, C. A. J.; COSTA, G. C. A.; SANTOS, H. A. Atlas de Parasitologia Veterinária Belo Horizonte, MGFEPMVZ Editora e CRMV-MG, , 2019. . Disponível em: <http://weekly.cnbnews.com/news/article.html?no=124000>. URQUHART, G. M.; ARMOUR, J.; DUNCAN, J. L.; DUNN, A. M.; JENNINGS, F. W. Diagnóstico laboratorial de parasitismo. In: BRESAN, M. C. R. V.; PEREIRA, M. C. (Ed.). Parasitologia veterinária. 2. ed. Rio de Janeiro, RJ: Guanabara Koogan, 1998. p. 239–248. WESTERMARCK, E.; WIBERG, M. Exocrine pancreatic insufficiency in dogs. The Veterinary Clinics. Small Animal Practice, v. 33, p. 1165–1179, 2003. WILLCOX, H. P.; COURA, J. R. Nova concepção para o método de Baermann-Moraes- Coutinho na pesquisa de larvas de nematódeos. Memórias do instituto oswaldo cruz, v. 84, n. 4, p. 563–565, 1989. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/mioc/v84n4/vol84(f4)_122-124.pdf>.
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