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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA. PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA Geral e I 2 Aula Prática nº 1 – Caracterização de Aminoácidos e Proteínas. Objetivos: Caracterizar a presença de proteínas em material biológico. Detectar a presença de proteínas através do emprego de métodos específicos para alguns aminoácidos. Fundamentação teórica: Os aminoácidos são compostos que apresentam obrigatoriamente dois grupos funcionais distintos, um grupo amina e um grupo carboxilo, podendo, no entanto, apresentar outros grupos funcionais ao longo das suas cadeias carbonatas. Estas moléculas, geralmente de pequenas dimensões, são de grande importância para a manutenção dos processos químicos inerentes à vida, principalmente quando associados entre si sob a forma de péptidos ou de proteínas. As proteínas podem apresentar interações entre os seus resíduos de aminoácidos (ligações de hidrogênio, por exemplo) ao nível das cadeias laterais, o que lhes confere geralmente uma estrutura globular, responsável pela sua função no interior da célula. Quando ocorrem modificações nessa estrutura a proteína pode perder a capacidade de exercer a sua função, ficando inativa - este processo designa-se por desnaturação de proteínas. Existem várias reações que caracterizam aminoácidos e as proteínas, tendo-se a possibilidade, pela diferença da reação, de identificar a natureza de uma substância desconhecida, caso esta seja de natureza protéica. Nesta prática estaremos empregando algumas destas técnicas de carac terização de proteínas, utilizando como fonte proteica alguns produtos cotidianamente conhecidos. Materiais e Reagentes: ➢ Soluções de proteínas: caseina, ovalbumina, clara de ovo, cabelo, lã, etc. ➢ Reativo de Millon. ➢ Acetato de Chumbo 10% e 5%. ➢ NaOH 2,5N, 0,5N e 20% ➢ Água Sanitária HNO3 concentrado ➢ CuSO4 a 5% H2SO4 concentrado ➢ α-Naftol a 1% em álcool a 50% ➢ NaCl a 0,9g% Procedimentos: Solução de proteínas: Clara de Ovo a 10% v/v com salina (NaCl a 0,9 g%). 1. Teste de Biureto: 2. Reação de Sakaguchi: Pipetar em um tubo de ensaio 1 ml de solução de proteínas e adicionar 10 gotas de NaOH 2,5N, 2 gotas de α-Naftol a 1% e 1 ml de Hipoclorito de Sódio. Desenvolvimento de uma coloração característica de reação positiva. Descreva a coloração observada, explicando o seu significado. 3 3. Reação xantoproteica: Em tubo de ensaio pipetar 1 ml de solução de proteínas, juntar 10 gotas de ácido nítrico concentrado e ferver. Acrescentar em seguida, 4 ml de NaOH a 20%. O aparecimento de cor vermelha, intensificada pela adição da soda, indica reação positiva. 4. Reação de Millon: Pipetar 1 ml de solução de proteínas e algumas gotas (3 a 4) do reativo de Millon. As proteínas precipitarão pela adição do ácido forte e do mercúrio. Leve o tubo diretamente à chama. As proteínas precipitadas formarão massa compacta e aquelas que contiverem Tirosina tomarão cor vermelho tijolo. O teste positivo é indicado pela cor Vermelha, haja ou não formação de precipitado. 5. Reação de Hopkins-Cole: Em um tubo de ensaio pipetar 1 ml de solução de proteínas e 3 ml do reativo de Hopkis-Cole. Inclinar o tubo e deixar cair lentamente no fundo do tubo 2 ml de ácido sulfúrico concentrado, agitar levemente. O aparecimento de um anel púrpura na interface, constitui teste positivo. 6. Reação para aminoácidos sulfurados Pipetar em um tubo de ensaio, 1 ml de solução de proteínas e adicionar 2 ml de NaOH 2,5N e ferver por 1 minuto. Adicionar 5 gotas de Acetato de Chumbo a 5% e ferver durante 20 a 30 segundos e observar. A formação de precipitado fino, castanho ou preto de Sulfato de Chumbo indica reação positiva. Aula Prática nº 2 – Reações de Precipitação de Proteínas. Objetivos: Compreender os diferentes agentes que podem levar a precipitação de proteínas. Determinar o Ponto Isoelétrico de proteínas. Fundamentação teórica: Altas concentrações de sais precipitam proteínas de suas soluções. Este fenômeno é denominado de “salting out” ou precipitação por sais. Os sais desidratam as proteínas, atraindo as moléculas de água do meio, de modo a ficar menos água disponível para as moléculas protéicas. A solubilidade de uma proteína depende da quantidade de água disponível ao redor de seus grupos iônicos (quanto menor for o número de moléculas de água, menor será a solubilidade). Por outro lado, baixas concentrações de sais podem aumentar a solubilidade de muitas proteínas. É fenômeno conhecido como “salting in” ou solubilização por sais. Isso pode ser explicado através da interação entre os íons salinos e as cargas iônicas das proteínas, aumentando, assim, o número efetivo de cargas (a tendência de ionização dos grupos dissociáveis das proteínas) e a quantidade de moléculas de água fixadas à ionosfera protéica. De modo geral, pequenos aumentos da força iônica solubilizam melhor as proteínas, enquanto que aumentos maiores provocam a precipitação das mesmas. Materiais e Reagentes: ➢ Soluções de proteínas: solução de caseína, clara de ovo. ➢ Acetato de Chumbo 10% e 5% ➢ Soluções de ácido acético ➢ NaOH 1N; 0,1N ➢ TCA a 10% 4 ➢ Etanol. ➢ Solução saturada de sulfato de amônio. Procedimentos: 1. Precipitação pela ação do calor Em um tubo de ensaio pipetar 2 ml de solução de proteínas e aquecer diretamente na chama. Formação de um coágulo branco indica proteína desnaturada. 2. Precipitação por reação com ácidos orgânicos Em tubo de ensaio pipetar 1 ml de solução de proteínas e 1 ml de ácido tricloroacético a 10% (TCA). A formação de um precipitado branco indica proteínas desnaturadas. 3. Precipitação por reação com sais de metais pesados Em tubo de ensaio pipetar 1 ml de solução de proteínas e 1 ml de Acetato de Chumbo a 5%. Formação de um precipitado indica proteína desnaturada. 4. Precipitação por ação de solventes orgânicos Em um tubo de ensaio pipetar 1 ml da solução de proteínas e álcool etílico (1 a 3 volumes) até formação de precipitado de proteínas. 5. Precipitação de proteínas sem desnaturação - Solubilização ("salting-in") – pipetar 3 ml de clara de ovo (in natura) em um béquer. Diluir com água destilada, mexendo com um bastão de vidro, até notar o aparecimento de um precipitado (globulinas). Adicionar, em seguida, solução de Cloreto de Sódio, gota a gota, até a redissolução do precipitado. - Precipitação ("salting-out") – pipetar 2 ml da solução obtida na experiência anterior ("salting-in") em um tubo de ensaio. Adicionar a seguir, 2 ml de solução saturada de sulfato de amônio e observar a formação de precipitado, o que corresponde ao fenômeno de "saltin-out". Juntar a seguir 4 a 6 ml de água destilada a fim de recompor a força iônica anterior e como consequência, redissolver o precipitado. Aula Prática nº 3 – Caracterização e propriedades das enzimas Objetivos: Manipular experimentalmente soluções de enzimas. Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidade de uma enzima. Manipular reações catalisadas por enzimas com a finalidade de determinar a influência da temperatura, do pH e ação de inibidores na atividade enzimática. Entender o significado das operações e reações realizadas. Fundamentação teórica: As enzimas são catalisadores biológicos extremamente eficientes e aceleram em média 109 a 1012 vezes a velocidade da reação, transformando de 100 a 1000 moléculas de substrato em produto por minuto de reação, porém, elas atuam em concentrações muito baixas e em condições suaves de temperatura e pH, logo, sua eficiência pode ser alterada quando estes fatores são manipulados. Possuem todas as características das proteínas. Podem ter sua atividade regulada. Estão quase sempre dentro da célula, e compartimentalizadas. 5 A especificidadedas enzimas se deve a uma região na superfície da molécula enzimática conhecida como sítio de ligação ao substrato. Em alguns casos o sítio ativo, ou sítio catalítico, da enzima está contido no sítio de ligação ao substrato, em outras enzimas o sítio ativo não se encontra no sítio de ligação do substrato, mas contíguo a ele. Algumas enzimas têm uma região da molécula, o sítio alostérico, que não está nem no sítio ativo nem no sítio de ligação do substrato, mas quando se liga a pequenas moléculas gera alteração no sítio de ligação do substrato ou na atividade que ocorre no sítio ativo, estimulando ou inibindo a atividade enzimática. O sítio ativo ocupa uma parte relativamente pequena do volume total da molécula enzimática e é formado por grupamentos que vêm de diferentes partes da sequência linear de aminoácidos, com uma forma tridimensional. É possível relacionar quatro mecanismos de catálise: 1.O substrato liga-se à enzima por atrações fracas múltiplas (ligações eletrostáticas, pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals e interações hidrofóbicas) ocorrendo tensões entre as ligações da molécula do substrato e mais facilmente essa molécula atingirá o estado de transição. 2.A interação enzima-substrato orienta grupos reativos, aproximando uns dos outros. 3.O envolvimento de doadores (ácidos) e aceptores (bases) de prótons. 4.O substrato é orientado para o sítio ativo da enzima e forma uma ligação covalente intermediária com a enzima ou a coenzima. Um dos exemplos mais bem estudados desse tipo de mecanismo de catálise é aquele envolvendo proteólise por serina proteases, que inclui enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina e elastase) e várias enzimas do sistema de coagulação sanguínea. Materiais e Reagentes: Solução de Urease. ➢Tampão 0,1M pH 7,0 contendo 1% de ureia ➢Tampão 0,1M pH 7,0 contendo 1% de Tiureia ➢Tampão 0,1M pH 4,0 contendo 1% de ureia ➢Tampão 0,1M pH 5,0 contendo 1% de ureia ➢Tampão 0,1M pH 6,0 contendo 1% de ureia ➢Tampão 0,1M pH 7,0 ➢Solução de Vermelho de Fenol (dissolver 0,1g de Vermelho de Fenol em 250 ml de água destilada alcalinizada com 2,82 ml de NaOH 0,1N). ➢Solução de Cloreto de Mercúrio a 0,01%. Procedimentos: A Urease é uma enzima que catalisa a hidrólise da ureia em Amônia e Dióxido de Carbono. Pode ser extraída com facilidade da soja e, nas bactérias do Rúmen exercem um papel preponderante por permitir a utilização do nitrogênio da ureia contida na saliva dos ruminantes. ➢Pesar cerca de 20 g de farinha de soja e colocar em um Erlenmeyer de 250 ml. ➢Adicionar 100 ml de glicerol a 75%. ➢Arrolhar o Erlenmeyer e agitar a suspensão por 15 minutos. ➢Deixar em repouso no refrigerador até o dia seguinte. ➢Filtrar o extrato glicerinado através de gaze. A solução de Urease assim obtida é bastante estável quando conservada em refrigerador. Determinação da atividade enzimática A atividade da enzima pode ser verificada pela formação de Carbonato de Amônio que é um sal de reação básica e cuja presença pode ser revelada por meio de um indicador ácido-básico, por exemplo, Vermelho de Fenol, que passa de cor amarela em meio ácido ou neutro para cor vermelha em meio básico. 6 Técnica: ➢Agitar e observar se há mudança de cor. ➢Esperar 10 minutos e concluir o resultado. Influência da Temperatura sobre a atividade enzimática: Todas as enzimas possuem uma temperatura ótima na qual a atividade é máxima. No caso da Urease a reação processa-se melhor a 37°C. Técnica: ➢Aguardar 5 minutos. Observar e anotar os resultados. Influência do pH sobre a atividade enzimática: A maioria das enzimas possuem um pH no qual sua atividade é máxima. A Urease tem maior atividade em torno de pH 7,0. ➢Agitar. Aguardar 5 minutos. Observar e anotar os resultados. 7 Inibição da atividade por sais de Mercúrio: A Urease é uma enzima que contém grupos sulfidrílicos essenciais para a sua atividade. As enzimas que dependem desses grupos para sua atividade, são inibidas por íons de metais pesados em concentrações reduzidas (10-4M). Técnica: Em um tubo de ensaio colocar 2 ml de água destilada, 2 gotas de solução de Urease, agitar e juntar uma gota de Cloreto de Mercúrio a 0,01%. Agitar e adicionar 3 ml de tampão 0,1M pH 7,0 contendo Uréia a 1% e uma gota de Vermelho de Fenol. Misturar e aguardar 5 minutos. Observar se houve mudança de coloração, anotar e interpretar os resultados. Teste de especificidade enzimática: Observar se há mudança de cor. Anotar e interpretar os resultados. Aula Prática nº 4 – Constituintes do Ovo A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS No final desta aula prática o estudante deverá saber: 01. Determinar experimentalmente a percentagem de proteína e lípides da gema. 02. Determinar experimentalmente a percentagem de proteína da clara. 03. Determinar aproximadamente o pI de proteína. 04. Identificar a presença de proteína em líquido biológico usando sua propriedade de precipitação por agentes químicos e físicos. 05. Determinar experimentalmente o valor calórico aproximado do ovo. Explicar o significado das reações e operações realizadas. B - MATERIAL NECESSÁRIO 2 bequeres de 100 ml 1 cilindro graduado de 50 ml 1 cilindro graduado de 100 ml balança algodão 1 funil 2 papéis de filtro lâmpada infra-vermelho chapa de aquecimento para banho de areia estufa tubos de ensaio e suporte 1 bastão de vidro bico de gás 1 pipeta graduada de 2 ml ao centésimo 1 pipeta graduada de 10 ml ao décimo 8 C - REAGENTES 1 ovo (por bancada) álccool a 95% Eter destilado Sulfato de sódio Sulfato de sódio anidro Clorofórmio Solução saturada (22%) de triclorato de antimôniol em clorofórmio Acetato de sódio a 0,1 N Ácido acético a 0,1 N Ácido nítrico concentrado Cloreto de mercúrio a 1% Solução saturada (13%) de ácido pícrico D - INTERPRETAÇÃO A gema do ovo contém como constituintes principais proteínas e lipidios que podem ser isolados. Nas pesquisas I e II as proteínas são precipitadas e extraídas pela adição de álcool, ao passo que os lipídios serão solubilizados e extraídos pelo éter. Após a filtração de mistura, o precipitado representará a fração protéica da gema e o filtrado representará a fração lipídica. O sulfato de sódio anidro é adicionado ao filtrado com o objetivo de se remover a água do solvente. Tendo- se o peso da gema, o cálculo de porcentagem de proteínas e de lípides na gema do ovo será feito por simples regra de três. A clara do ovo também é constituida de proteínas e lipidios. Entretanto aqui a fração mais importante é a protéica, formada principalmente de albumina. Na pesquisa III as proteínas são precipitadas por adição de álcool. Conhecendo-se o volume total de clara do ovo, pode-se facilmente calcular o teor de proteínas na clara de ovo. A fração lipídica e carboidratos são tão pequenos que podem ser desprezados para cálculo do valor calorífico do ovo. As substâncias orgânicas quando oxidadas no organismo libertam uma certa quantidade de calor que irá variar segundo o tipo de substância. Assim, as proteínas liberam uma média de 4 Kcal por grama de substância; os lipidios liberam 9 Kcal por grama e os carboidratos 4 Kcal por grama. Portanto, na pesquisa VI conhecendo-se os valores percentuais de proteínas e lípidios na gema e na clara do ovo pode-se calcular o valor calórico total de um ovo. Uma das técnicas de isolamento de proteínas é a sua precipitação no ponto isoelétrico, onde as mesmas são menos solúveis, mas sem perder a atividade. O objetivo da pesquisa V é determinar o ponto isoelétrico de albumina do ovo. Para isto preparou-se soluções da albumina em diferentes pHs e observou-se aquela em que ocorreu a precipitação da proteína. Entretanto certas proteínas, entre elas a albumina, apresentam grande solubilidade em água e por isso torna-se difícil observara sua precipitação no ponto isoelétrico. Adiciona-se então à solução um agente que compete com a proteína pelo solvente, num processo semelhante ao "salting out". No presente caso empregou-se o álcool. Entretanto é bom levar em consideração que o álcool quando permanece muito tempo em contato com a proteína introduz modificações intramoleculares na mesma, acarretando uma desnaturação. A pesquisa VI permite observar a ação do calor e de alguns agentes precipitantes sobre a albumina do ovo e para extensão, sobre as proteínas. São os processos conhecidos por coagulação a desnaturação. a) O calor promove a coagulação da albumina num processo de desnaturação irreversível. b) A adição de ácidos fortes a uma solução de proteína promove a sua desnaturação com a consequente precipitação. O presente teste (Reação de Heller) é comumente empregado nos laboratórios clínicos quando se deseja verificar a presença de albumina do soro na urina em casos de suspeita de albumina (doença renal). c) A adição de solução de sais de metais pesados a uma solução da proteína promove a formação de proteinatos insolúveis. Em casos de envenenamentos por sais de chumbo e mercúrio costuma-se administrar clara de ovo aos pacientes, pois a reação é imediata e sua eliminação é facilitada. d) Os reagentes de alcalóides (ácido pícrico, fosfotungstico, tânico, metafosfórico, etc) precipitam os alcalóides de suas soluções por formarem com os mesmos sais insolúveis. Estes reagentes agem da mesma forma quando adicionados a uma solução de proteína formando igualmente sais insolúveis. 9 E - PROCEDIMENTO 01. Pesar 2 bequeres de 100 ml. 02. Separar bem a gema da clara e colocar cada uma das partes nos respectivos bequeres. 03. Pesar os bequeres e anotar o peso da gema e da clara. 04. Transferir a clara para o cilindro graduado de 100 ml e anotar o seu volume. I - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE PROTEÍNAS NA GEMA Nota: Durante todas estas operações não deve haver nenhum bico de gás ligado no laboratório. 01. Adicionar à gema isolada 15 ml de álcool a 95%. Agitar bem por alguns minutos. 02. Adicionar 30 ml de éter. Agitar por 5 minutos. 03. Filtrar através de algodão para um erlenmeyer de 125 ml. 04. Lavar o precipitado no funil com 3 porções de 10 ml de éter. Adicionar somente uma porção de éter depois da precedente ter sido completamente drenada no erlenmeyer que está recebendo o filtrado. Guardar o filtrado. 05. Pesar um papel de filtro grande. 06. Transferir o precipitado extraído para o papel de filtro, desprezando o pedaço de algodão. 07. Secar o papel com o precipitado usando lâmpada infra-vermelho como fonte de calor. Não usar estufa. 08. Pesar o papel de filtro mais o precipitado seco. 09. Calcular a porcentagem de proteína na gema. 10. Ler a interpretação correspondente. II - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LÍPIDES NA GEMA 01. Pesar um bequer seco de 100 ml. 02. Adicionar 3 g de sulfato de sódio anidro ao filtrado obtido em I, item 4. Agitar por 5 minutos. 03. Filtrar em papel de filtro recolhendo o filtrado no béquer pesado. 04. Evaporar o solvente em manta aquecedora. 05. Pesar o béquer com o resíduo. Conservar o resíduo. 06. Calcular a percentagem de lípides na gema. 07. Ler a interpretação correspondente. III - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE PROTEÍNAS NA CLARA 01. Transferir 10 ml da clara do ovo (medir com pipeta) para um béquer de 50 ml. 02. Adicionar 15 ml de álcool a 95%. Agitar bem por alguns minutos. 03. Pesar um papel de filtro. 04. Filtrar pelo papel anteriormente pesado. Desprezar o filtrado. 05. Abrir o papel de filtro e levá-lo à estufa para secar completamente. 06. Pesar o papel com o precipitado. 07. Calcular a porcentagem de proteínas na clara. 08. Ler a interpretação correspondente. IV - DETERMINAÇÃO DO VALOR CALÓRICO DO OVO De posse dos dados obtidos nas pesquisas anteriores, calcular o valor calórico do ovo analisado. Ler a interpretação correspondente. V - DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DA ALBUMINA DO OVO Nota: Preparar para esta pesquisa e as subsequentes uma solução de albumina de ovo a 1%, diluindo 1 ml da clara com 100 ml de água. 01. Tomar 5 tubos de ensaio e numerá-los de 1 a 5. 02. Adicionar aos mesmos as soluções abaixo relacionadas, segundo o esquema: 10 03. Agitar bem os 5 tubos. 04. Adicionar ao tubo 3, cuidadosamente, e com agitação, empregando a pipeta graduada de 10 ml, álcool a 95% até se produzir pequena turvação. Anotar a quantidade gasta. 05. Adicionar a mesma quantidade de álcool a cada um dos outros tubos. 06. Deixar em repouso por 10 minutos e anotar depois em qual dos tubos ocorreu maior formação de precipitado. 07. Ler a interpretação correspondente. VI - PRECIPITAÇÃO DE ALBUMINA DO OVO a) Precipitação pelo calor 01. Colocar 2 ml da clara em um tubo de ensaio. 02. Aquecer a chama (CUIDADO: manter vidros de álcool e éter longe da chama). 03. Observar a formação de um precipitado. 04. Ler a interpretação correspondente. b) Precipitado por ácidos fortes (reação de Heller) 01. Colocar 2 ml da solução de albumina em um tubo de ensaio. 02. Acrescentar lentamente no fundo do tubo 2 ml de HNO3 concentrado. Para isto introduz-se a pipeta contendo o ácido na solução, mantendo-se a extremidade superior tampada com o dedo. Somente quando a ponta da pipeta atingir o fundo do tubo de ensaio é que deverá ser escoado o ácido da pipeta. 03. Observar a formação de um anel na superfície de separação das duas camadas. 04. Ler a interpretação correspondente. c) Precipitação por sais de metais pesados 01. Colocar 2 ml da solução de albumina em um tubo de ensaio. 02. Adicionar 3 gotas de HgCl2 a 1%. 03. Observar o precipitado formado. 04. Ler a interpretação correspondente. d) Precipitação por agentes de alcalóides 01. Colocar 2 ml da solução de albumina em um tubo de ensaio. 02. Adicionar 3 gotas de solução saturada de ácido pícrico. 03. Observar a formação de um precipitado. 04. Ler a interpretação correspondente. Aula Prática nº 5 – Extração e caracterização de lipídios Objetivos: Caracterizar triacilgliceróis através de hidrólise alcalina (saponificação). Evidenciar a formação de produtos de hidrólise (sabões) pelas suas propriedades. Caracterizar um esterol através de suas reações de coloração. Procedimentos: 11 1. Solubilidade de lipídios: Preparar a seguinte série de tubos: Tubo 1 - 1,0 ml de água destilada Tubo 2 - 1,0 ml de ácido clorídrico Tubo 3 - 1,0 ml de álcool etílico Tubo 4 - 1,0 ml de éter etílico Tubo 5 - 1,0 ml de clorofórmio Acrescentar a cada um dos tubos 0,5 ml de óleo. Agitar bem os tubos 2 Formação de Acroleína: Numerar dois tubos de ensaio A cada um deles, adicionar uma pitada de cloreto de cálcio A seguir, adicionar: Tubo 1: 3 gotas de óleo Tubo 2: 3 gotas de água Aquecer, a princípio lentamente e depois fortemente, cada um dos tubos. Observar o odor desenvolvido. 3 Adição de Halogênios (teste de fixação do iodo): Em um tubo de ensaio, adicionar 5 mL de óleo de soja Adicionar 10 gotas de lugol Aquecer em banho-maria fervente até o desaparecimento da cor Deixar esfriar a temperatura ambiente Após o esfriamento completo, adicionar 3 gotas da solução de amido Observar e anotar os resultados Observar e anotar os resultados OBS.: Realize o mesmo experimento substituindo o óleo de soja por água destilada e compare. Aula Prática nº 6 – Saponificação Materiais e Reagentes: - Tubo de ensaio grande - Óleo de soja - Conta-gotas - Hidróxido de potássio 40% - Béquer 500 mL - Etanol - Pérolas de vidro - Água destilada - Chapa de aquecimento - Ác. Acético glacial - Pipeta graduada 10 mL - Cloreto de cálcio 10% - 4 Tubos de ensaio - Solução saturada de cloreto de sódio - Bancada para tubos de ensaio Procedimento Em um tubo de ensaio grande adicione 15 gotas de óleo de soja e 5,0 mL desolução de potassa alcoólica. Adicione pérolas de vidro para evitar ebulição tumultuosa e aqueça em banho-maria fervente por 30 min. Resfrie o tubo, dilua com 4,0 mL de água e transfira igualmente para 4 tubos 12 de ensaio. (Solução de potassa alcoólica: misturar volumes iguais de KOH 40% e etanol). Teste de abaixamento da tensão superficial: No tubo 1 adicione 2,0 mL de água e agite bem a solução. O aparecimento de espuma indica a presença do sabão pelo abaixamento da tensão superficial. Precipitação de ácidos graxos: No tubo 2 adicione gota a gota ácido acético glacial até não haver mais formação de precipitado branco. O precipitado são os ácidos graxos. Precipitação de sabões de cálcio: No tubo 3 adicione cloreto de cálcio 10% gota a gota até o aparecimento de um precipitado branco. O precipitado é um sabão de cálcio. Precipitação de sabão por excesso de eletrólitos: No tubo 4 adicione igual volume de solução saturada de cloreto de sódio. Observe a precipitação do sabão. Aula Prática nº 7 – Reações de identificação de carboidratos Objetivos: Executar testes qualitativos para reconhecimento de g glicídeos. Aplicar os testes: Iodo, Benedict, Seliwanoff, Molish, Barfoed, Bial e Tollens, para identificar glicídeos desconhecidos. Fundamentação teórica: A caracterização dos carboidratos pela ação de ácidos minerais diluídos e pelo calor os glúcides são transformados por perda de água, dando origem ao Furfural ou ao Hidroximetilfurfural. As aldopentoses e as pentoses formam Furfural, enquanto que as cetohexoses, as aldoses e os polissacarídeos deles constituídos formam hidroximetilfurfural. Furfural e Hidroximetilfurfural tem a propriedade de formar produtos de condensação coloridos com substâncias fenólicas. Por outro lado, diversos reativos são utilizados para demonstrar a presença de grupo redutor em açúcares. Justamente por possuírem grupo aldeídico livre, ou potencialmente livre, ou grupo cetônico, são capazes de se oxidarem em soluções alcalinas de íons de determinados metais como o cobre, ferro, bismuto, mercúrio e prata. Todos os monossacarídeos se comportam como açúcares redutores. Com alguns dissacarídeos como a sacarose e a trealose, que não acontece por não possuírem grupo redutor livre, fato que também ocorre com a rafinose, trissacarídeo formado por galactose, glicose e frutose, combinados entre sí de tal modo que os três grupos redutores dos monossacarídeos respectivos se encontram envolvidos na constituição da molécula maior. As macromoléculas polissacarídicas do tipo do amido possuem, também, poder redutor, dependendo a sua intensidade dos grupos terminais da molécula. Materiais e Reagentes: ➢ Tubos de ensaio e suporte. Bico de gás, tripé e tela. ➢ Pinça para tubo de ensaio. Balão de vidro. ➢ Soluções padrões de glúcides: (glicose, frutose, lactose e sacarose a 0,1M), (Amido a 1%), (goma arábica a 10%). ➢ Solução de Lugol: 0,5g de Iodo metálico + 1,0g de Iodeto de Potássio, dissolvidos em 100 ml de água. ➢ Reagente de Benedict: 17,3g de Sulfato de Cobre + 173g de Citrato de Sódio e 100g de Carbonato de Sódio anidro, dissolvidos em 1000 ml de água. 13 ➢ Reativo de Barfoed: 9g de Acetato cúprico cristalizado + 0,6 ml de Ácido Acético glacial + Água q.s.p. 100 ml. Dissolver o acetato na água e juntar o ácido acético e filtrar. O reativo é muito instável. ➢ Reativo de Seliwanoff: 0,05g de Resorcinol dissolvidos em 100 ml de HCl diluído(1:1) com água destilada. ➢ Reativo de Molish: solução de alfa-naftol a 5% em álcool. ➢ Reativo de Bial: 1g de orcinol + 500 ml de HCl a 30% + 1 ml de Cloreto férrico a 10%. AgNO3 a 1%; NaOH 0,2N; Hidróxido de Amônia concentrada; ➢ H2SO4 concentrado. Procedimentos: 1. Teste do Iodo: Colocar em tubos de ensaio 1 ml das soluções de glúcides fornecidas. Adicionar a cada tubo 2 gotas de solução de Lugol. O aparecimento de cor azul indica reação positiva. 2. Reação de Molish: Em tubos de ensaio pipetar 2 ml de solução de glicídeos, juntar 3 gotas do reativo de Molish e misturar. Inclinar o tubo e deixar escorrer pela parede do tubo, 2 ml de ácido sulfúrico concentrado, de modo que os dois líquidos não se misturem. Na reação positiva forma-se uma zona de cor violeta ou verde na interface. 3. Teste de Benedict: Colocar em tubos de ensaio 0,5 ml de solução de glicídeos. Adicionar 1 ml do reagente de Benedict e misturar. Aquecer, com agitação e diretamente na chama. Deixar em ebulição por mais ou menos 1 minuto. Observar a solução. A mudança de coloração (azul para verde até vermelho tijolo) e/ou formação de precipitado (cor de tijolo), indica reação positiva. 4. Teste de Barfoed: Em tubos de ensaio colocar 5 ml do reagente de Barfoed e 1 ml da solução de glicídeos e agitar bem. Aquecer em banho-maria fervente. Verificar a redução pelo aparecimento de um precipitado avermelhado (mais rapidamente com os monossacarídeos). 5. Teste de Seliwanoff: Em tubos de ensaio pipetar 1 ml de solução de carboidrados e 1 ml do reativo de Selivanoff. Aquecer diretamente na chama. A reação positiva é indicada pelo aparecimento de cor vermelha. O aquecimento em banho-maria a 80°C durante 10 minutos aumenta a especificidade da reação. 6. Teste de Tollens: Colocar em um tubo de ensaio 2 ml de solução de Nitrato de Prata 0,1N e 0,5 ml da solução de NaOH 0,2N. Dissolve-se o precipitado adicionando amônia concentrada, gota a gota, com agitação permanente (evitar o excesso de amônia). Colocar 1 ml do glúcide redutor (o mais redutor) e aquecer diretamente na chama. Observar a formação de um espelho de prata. 7. Teste de Bial: Colocar em tubo de ensaio 5 ml de reativo de Bial e cinco gotas de solução de goma arábica a 10%. Ferver prolongadamente. O aparecimento de uma coloração inicialmente roxa, por fim, verde, com formação de um precipitado verde-azulado, indica reação positiva. 14 Aula Prática nº 8 – Pesquisa Qualitativa do Leite Objetivos: No final desta aula prática o estudante deverá saber: 01. Separar proteínas do leite por precipitação e decantação. 02. Identificar a presença de proteínas sem líquidos biológicos pelo teste de biureto. 03. Identificar em líquidos biológicos a presença de gordura, lactose, fósforo, cálcio e cloretos. 04. Definir pI. 05. Explicar o significado das reações e operações realizadas. Materiais e Reagentes: • 1 erlenmeyer de 250 ml • 1 bequer de 100 ml • 1 bequer de 250 ml • tubos de ensaio e suporte • pipetas graduadas (1, 2, 5 e 10 ml) • bico de gás, 1 tripé, 1 tela, 1 caneca • algodão: filtração em algodão • funil • vidro de relógio ou placa de Petri • leite • água destilada • ácido acético 5% • álcool absoluto • éter • solução de NaOH a 10% • solução de CuSO4 a 1% • reagente de Benedict • solução de molibdato de amônio a 5% • leite x • leite y • reagentes de Sulkovitch: 2,5 g ácido oxálico; 2,5 g oxalato de amônio; 5,0 ml ácido acético • glacial; água q.s.p. 150 ml • HNO3 concentrado • solução de AgNO3 a 5% Procedimentos: I – EXTRAÇÕES 01. Adicionar 50 ml de água destilada morna e 50 ml de leite em um bequer de 250 ml. 02. Acrescentar CH3COOH 5% gota a gota, com agitação lenta até que o leite se coagule (queijo). 03. Deixar em repouso por cerca de 5 minutos. 04. Decantar o líquido sobrenadante sobre o filtro de algodão, recolhendo o filtrado no erlenmeyer de 125 ml. Lavar o precipitado 2 vezes com 5 ml de álcool absoluto. 05. Transferir o filtrado acima para o béquer de 250 ml. Aquecê-lo diretamente na chama, até a ebulição. Deixar fervendo até reduzir o volume a 40 ml. Agitar constantemente com bastão de vidro para evitar formação de bolhas (cuidado com o rosto). 06. Filtrar em papel de filtro e deixar esfriar. (Filtrado 2) II - PESQUISA DE GLÍCIDES REDUTORES 15 01. Colocar 2 ml do reagente de Benedict em um tubo de ensaio. 02. Adicionar 1 mldo filtrado 2. Misturar. 03. Aquecer até a ebulição e observar a mudança de coloração do reagente. 04. Ler a interpretação. III - PESQUISA DE FÓSFORO 01. Colocar 2 ml do filtrado respectivamente em 2 tubos de ensaio. 02. Adicionar 1 ml de solução de molibdato de amônio a 5% a um dos tubos. Misturar. 03. Observar o aparecimento de cor amarelo-esverdeada, comparando com o tubo controle. 04. Ler a interpretação correspondente. IV - PESQUISA DE CÁLCIO 01. Colocar 2 ml do filtrado em um tubo de ensaio. 02. Adicionar o reativo de Sulkowitch gota a gota até o aparecimento de uma turvação ou precipitado branco. 03. Ler a interpretação correspondente. V - PESQUISA DE CLORETOS 01. Colocar 2 ml de filtrado em um tubo de ensaio. 02. Adicionar 2 a 3 gotas de HNO3 concentrado. 03. Adicionar gotas de AgNO3 5% até o aparecimento de turvação ou precipitado branco. VI - TESTES PARA VERIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ESTRANHAS AO LEITE. Nos 3 testes abaixo, fazer com as 2 amostras de leite. 01. Pesquisa de amido Colocar em um béquer, 5 ml de leite. Aquecer. Em seguida, adicionar 6 gotas de reativo de lugol. 02. Pesquisa de urina. Pipetar 5 ml de leite e colocar em um béquer. Juntar em seguida 5 ml de HCl, 5 ml de álcool Etílico e 0,5 ml de HNO4 03. Pesquisa de sacarose. Colocar 5 ml de leite em um béquer e 1 ml de reativo de Seliwanoff. Aquecer em banho maria durante 10 minutos. Agitar de vez em quando. Aula Prática nº 9 – Metabolismo - glicólise e fermentação em leveduras Objetivos: Verificar o processo de reação metabólica que acontece no nosso organismo, através da fermentação alcoólica. Fundamentação teórica: O metabolismo de alguns materiais biológicos é detectado através da liberação de CO2 decorrente da fermentação ou da respiração. A glicólise é o tipo de fermentação anaeróbica da glicose que ocorre nas células dos animais superiores e em muitas plantas e microorganismos. Um outro tipo de fermentação da glicose é a fermentação alcoólica de leveduras, em que a glicose é degradada em Etanol e Dióxido de Carbono. 16 Em adição podemos dizer que todo o organismo heterotrófico obtém sua energia das reações de oxidação-redução, isto é, reações nas quais elétrons são transferidos de um composto, o doador de elétrons, ou agente redutor para um aceptor de elétrons, o agente oxidante. Na fermentação alcoólica o oxidante final ou aceptor de elétrons é alguma molécula orgânica, produzida no próprio processo de fermentação que no caso é o acetaldeído. Materiais e Reagentes: 1 litro de Garapa; • 15g de fermento biológico; • Sistema de destilação; • Béquer de 250mL • Béquer de 1 Litro • Água aquecida a 40ºC • Espátula • Caixa de isopor • Erlenmeyer 500mL • Alcoômetro • Proveta de 500mL Procedimentos: 1. Dissolver o fermento biológico em um pouco de água morna; 2. Misturar o fermento à garapa e deixar em caixa de isopor por 5 dias; 3. Adicionar o produto de fermentação em conjunto de destilação; 4. Destilar a mistura a 85 ºC, recolhendo o álcool em erlenmeyer de 500mL; 5. Transferir o destilado para proveta e medir o teor alcoólico. Aula Prática nº 10 – Extração de DNA Objetivos: 17 Visualizar o DNA da banana, e comprovar a sua existência. Materiais e Reagentes: 1 Banana madura; sal de cozinha; álcool; água; detergente(sem cor); saco plástico; colher de chá; colher de sopa; vidro transparente; peneira; Procedimentos: 1°-Colocar a banana dentro do saco plástico e macerá-la; 2°- Em um copo misturar a água com 150ml de água, uma colher (sopa) de detergente, e uma colher (chá) de sal de cozinha; 3°- Misturar 1/3 da mistura de água, sal e detergente com a banana macerada; 4°- Incubar por 30 minutos; 5°- Passar pela peneira a mistura para tirar os pedaços de banana; 6° Colocar metade do líquido peneirado em um tubo e despejar sobre a mistura dois volumes de álcool comum, aguardar cerca de 3 minutos para o DNA começar a precipitar na interfase; 7°- Usar um palito para enrolar as moléculas de DNA.